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문제 정의
- 식물 성장후, 질소고정 균이 접종된 토양의 미생물 군집 분석은 대조군과 유사했다. 따라서 본 연구에서는 도시녹화 시스템에 질소고정 균을 이용하여 식물 성장을 촉진한다면 그 효율이 증대될 것이다.
- 현재 도시의 도시열섬현상을 완화시키는 방안으로 도시 녹화사업 및 연구가 주목 받고 있다. 이 연구에서는 질소고정 균을 분리하고, 식물 성장에 미치는 영향을 확인했다. 먼저 질소고정 균을 분리하기 위해, 질소원이 없는 배지에서 enrichment를 실시했고, 질소원이 제한된 배지에서 높은 성장을 보인 colony를 분리하여 순수분리 했다.
- 이에 따라 본 연구에서는 질소 고정 능력이 우수한 균주를 선별하고, 옥상녹화에서 저관리 경량형 시스템의 효율을 증대시키기 위해 실험실에서 질소고정 균의 식물 성장 촉진 효율을 확인했다. 또 균 접종 후 토양 내 균 community를 분석하여 일반 토양과 차이점을 확인했다.
제안 방법
- 적응된 균이 들어있는 serum bottle의 기상부를 89% 아르곤과 10% acetylene, 1% 산소로 조정한다. 0, 3, 5일에 GC-FID를 이용하여 ethylene 생성을 확인했다.
- 토양이 건조되는 것을 방지하기 위해 증류수를 일일 15 ml씩 주었다. 50일 배양 후 줄기의 길이와 식물의 건조중량을 측정함으로써 식물 성장을 확인했다.
- ARA 통해 nitrogenase의 활성을 간접적으로 확인된 분리 균주들은 동정하기 위해 16s rRNA sequence를 분석했다. Kim et al.
- ARA를 통해 acetylene을 ethylene으로 환원시킨 8개의 균주(토양에서 분리된 균주 7, KEMB를 통해 분양받은 균주1)를 확인했다(Fig. 1). 토양에서 분리한 균주 중 acetylene을 대부분 ethylene으로 환원시킨 strain MK7과 Y4, Y8에 대하여 재현성 실험을 실시했다.
- 토양의 영양 상태에 따른 균의 효율을 확인하기 위해 TSB를 함께 첨가하여 실험을 실시했다. Control로 증류수를 첨가한 실험군과 TSB를 첨가한 실험군으로 두고 실험을 실시했다. 49일 후에 줄기의 길이를 측정한 결과 증류수를 첨가한 control, TSB를 첨가한 control, 질소고정 균을 접종한 실험군, 광합성 균을 접종한 실험군에서 각각 17.
- 각 sequencing sample은 Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library 프로토콜에 따라 준비했다. DNA의 정량과 농도는 PicoGreen과 Nanodrop을 이용해 측정했다. 16S rRNA 유전자는 16S V3-V4 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.
- 프라이머 서열은 다음과 같다; 16S V3-V4 프라이머(Forward Primer, 5' TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG, Reverse Primer 5' GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C). Input gDNA (12.5 ng)는 16S V3-V4 primer로 증폭되고 이후의 limit-cycle 증폭 단계는 multiplexing indices와 Illumina sequencing adapters를 이용해 수행했다. 최종 산물은 PicoGreen을 사용하여 표준화되고 풀링되며, 라이브러리의 크기는 LabChip GX HT DNA High Sensitivity kit (PerkinElmer, Massachusetts, USA)를 사용하여 검증했다.
- 6"E)의 콩밭에서 얻은 토양 시료를 사용했다. 각 시료를 yeast mannitol media(yeast extract 1.0 g/l, mannitol 10.0 g/l, K2HPO4 0.5 g/l, MgSO4 0.2 g/l, NaCl 0.1 g/l, CaCO3 0.1 g/l)에서 2일간 농화배양했다. 농화배양된 시료는 순차 희석 기법을 이용하여 질소가 없는 배지에 도말했다.
- Y8을 혼합하여 실시하였다. 결과를 확인하기 위해 잎의 길이와 식물체의 건조중 량을 측정했다.
- Serum bottle 안에 질소가 소량 함유된 배지 100 ml을 넣고, aluminum seal과 고무 cap을 이용해 닫힌계를 만들었다. 고무 cap을 이용해 serum bottle 안의 기상부를 99% 질소와 1% 산소로 조성하고, 순수 분리된 균을 접종했다. 2일간 28℃에서 적응시켰다.
- 최종 산물은 PicoGreen을 사용하여 표준화되고 풀링되며, 라이브러리의 크기는 LabChip GX HT DNA High Sensitivity kit (PerkinElmer, Massachusetts, USA)를 사용하여 검증했다. 그후 MiSeqTM 플랫폼 (Illumina, San Diego, USA)을 사용하여 sequencing 했다.
- 포트당 seed는 3개씩 파종했다. 대조군으로 균을 접종하지 않고 같은 양의 증류수를 첨가한 포트의 식물로 했고, positive control로 광합성 혼합 균주를 이용했다. 각 실험군은 4개의 포트를 사용했고, 식물은 20℃, 6000 lux의 빛 세기에서 배양했다.
- 순수 분리된 균주들은 대부분 점액질로 이루어진 colony를 형성했다. 따라서 이후의 정량적 실험을 위해 각 균주는 nutrient media나 tryptic soy broth에서 성장을 확인했다. 배양된 균은 KEMB에 기탁했다.
- 이에 따라 본 연구에서는 질소 고정 능력이 우수한 균주를 선별하고, 옥상녹화에서 저관리 경량형 시스템의 효율을 증대시키기 위해 실험실에서 질소고정 균의 식물 성장 촉진 효율을 확인했다. 또 균 접종 후 토양 내 균 community를 분석하여 일반 토양과 차이점을 확인했다.
- 선행된 연구 내용으로서, 질소고정 균을 이용하여 사탕수수, 벼, 잔디와 같은 식물의 성장을 확인한 연구 결과가 있다[7−11]. 많은 연구에서 식물의 줄기나 뿌리의 길이와 건조중량을 비교 측정함으로써 식물의 성장을 확인했다.
- 이 연구에서는 질소고정 균을 분리하고, 식물 성장에 미치는 영향을 확인했다. 먼저 질소고정 균을 분리하기 위해, 질소원이 없는 배지에서 enrichment를 실시했고, 질소원이 제한된 배지에서 높은 성장을 보인 colony를 분리하여 순수분리 했다. 순수 분리된 균은 ARA를 통해 acetylene이 90% 이상 감소되고, ethylene 생성을 통해 nitrogenase의 활성을 간접적으로 확인했다.
- N, P, K에 따른 토양 내 균의 군집도를 확인하고[14], 화학 비료 및 생물 유기 비료에 따른 균의 군집도나 진균의 군집도를 확인하는 실험이 이루어지고 있다[15]. 본 연구에서도 질소고정 균을 접종한 토양과 영양배지, 이미 식물성장을 촉진한다고 알려진 광합성 균을 접종한 토양에서의 균집도 변화를 확인하기 위해 miseq으로 군집 분석을 실시했다.
- 분리된 균은 포트 실험를 통하여 식물 성장에 미치는 영향을 확인했다. 균의 준비는 분리된 질소고정 박테리아를 동일비율로 섞어 혼합 균주를 만들고 TSB (Tryptic soy broth)에 3일간 28℃에서 배양했고, 원심분리기를 이용하여 배지 성분을 제거했다.
- 먼저 질소고정 균을 분리하기 위해, 질소원이 없는 배지에서 enrichment를 실시했고, 질소원이 제한된 배지에서 높은 성장을 보인 colony를 분리하여 순수분리 했다. 순수 분리된 균은 ARA를 통해 acetylene이 90% 이상 감소되고, ethylene 생성을 통해 nitrogenase의 활성을 간접적으로 확인했다. 재현성이 확인된 Cedecea sp.
- 식물의 성장을 확인한 토양을 사용하여 토양 내 균 community를 분석했다. 토양내 미생물의 DNA는 PowerSoil® DNA Isolation Kit (카탈로그 번호 12888, MO BIO)을 이용하여 제조업체의 안내서에 따라 추출했다.
- Kim et al.에 의해 기술된 universal primer를 사용하여 16S rRNA 유전자 분석을 실시했다. 염기서열은 Macrogen에서 3730XL 자동화된 DNA sequencing system (Applied Biosystems)을 사용하여 분석했다.
- 에 의해 기술된 universal primer를 사용하여 16S rRNA 유전자 분석을 실시했다. 염기서열은 Macrogen에서 3730XL 자동화된 DNA sequencing system (Applied Biosystems)을 사용하여 분석했다. 16S rRNA 유전자 서열은 Ezbiocloud 서버에서 BLAST 검색 분석에 의해 확인되었다[16].
- 토양에서 분리한 균주 중 acetylene을 대부분 ethylene으로 환원시킨 strain MK7과 Y4, Y8에 대하여 재현성 실험을 실시했다. 재현성 실험에서 strain MK7과 Y8에서 지속적인 nitrogenase 활성을 확인했다 (Table 1). 따라서 질소고정 균주로 strain MK7과 Y8을 선별하여 이후 실험을 실시했다.
- 토양을 준비된 플라스틱 포트에 150 g씩 담았다. 준비된 균을 증류수에 부유시키고, 토양에 1.0 g bacteria/kg soil의 농도로 접종했다. 식물은 perennial ryegrass를 이용했다.
- 5 ng)는 16S V3-V4 primer로 증폭되고 이후의 limit-cycle 증폭 단계는 multiplexing indices와 Illumina sequencing adapters를 이용해 수행했다. 최종 산물은 PicoGreen을 사용하여 표준화되고 풀링되며, 라이브러리의 크기는 LabChip GX HT DNA High Sensitivity kit (PerkinElmer, Massachusetts, USA)를 사용하여 검증했다. 그후 MiSeqTM 플랫폼 (Illumina, San Diego, USA)을 사용하여 sequencing 했다.
- 토양내 미생물의 DNA는 PowerSoil® DNA Isolation Kit (카탈로그 번호 12888, MO BIO)을 이용하여 제조업체의 안내서에 따라 추출했다.
- 1). 토양에서 분리한 균주 중 acetylene을 대부분 ethylene으로 환원시킨 strain MK7과 Y4, Y8에 대하여 재현성 실험을 실시했다. 재현성 실험에서 strain MK7과 Y8에서 지속적인 nitrogenase 활성을 확인했다 (Table 1).
- 토양의 영양 상태에 따른 균의 효율을 확인하기 위해 TSB를 함께 첨가하여 실험을 실시했다. Control로 증류수를 첨가한 실험군과 TSB를 첨가한 실험군으로 두고 실험을 실시했다.
- 파종 49일 후, 식물을 뽑아서 줄기의 길이와 건조 중량을 측정했다. Control에서 줄기의 길이는 18.
대상 데이터
- 12종, Paenibacillus sp. 3종, 기타 다른 속들 10종을 분양받아 Nutrient broth에서 배양했다.
- 토양내 미생물의 DNA는 PowerSoil® DNA Isolation Kit (카탈로그 번호 12888, MO BIO)을 이용하여 제조업체의 안내서에 따라 추출했다. 각 sequencing sample은 Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library 프로토콜에 따라 준비했다. DNA의 정량과 농도는 PicoGreen과 Nanodrop을 이용해 측정했다.
- 도시녹화를 위해 토양에서 분리된 58개의 질소고정 후보 균주와 KEMB를 통해 분양받은 43종의 균주로 ARA를 실시하여 2종의 질소고정 균을 선별했다. 각 균의 16s rRNA sequencing 결과 Cedecea sp.
- 재현성 실험에서 strain MK7과 Y8에서 지속적인 nitrogenase 활성을 확인했다 (Table 1). 따라서 질소고정 균주로 strain MK7과 Y8을 선별하여 이후 실험을 실시했다. Strain MK7은 gas chromatography 를 이용한 검출에서 초기의 기상층의 acetylene 농도는 9.
- 0 g bacteria/kg soil의 농도로 접종했다. 식물은 perennial ryegrass를 이용했다. 포트당 seed는 3개씩 파종했다.
- 질소고정 균을 분리하기 위해 대한민국 문경의 산간 지역의(36°38'35.0"N 127°58'42.5"E)에서 얻은 부식토와 연천(37°58'10.9"N 127°01'41.6"E)의 콩밭에서 얻은 토양 시료를 사용했다.
- 질소고정 균을 얻기 위해 토양시료의 균을 분리했고 환경미생물은행(KEMB)에서 질소고정 후보 균주를 분양받았다. 질소고정 균을 분리하기 위해 대한민국 문경의 산간 지역의(36°38'35.
성능/효과
- 16s rRNA sequencing 결과를 통해 strain MK7과 Y8을 동정했고 각각 Cedecea lapagei GTC 346 (98.21%)과 Enterobacter ludwigii EN-119 (99.73%)로 동정되었다 (Table 2). 각 균주는 KEMB에 질소고정 균으로 KEMB 1501-001, KEMB 1501-002로 기탁했다.
- Control로 증류수를 첨가한 실험군과 TSB를 첨가한 실험군으로 두고 실험을 실시했다. 49일 후에 줄기의 길이를 측정한 결과 증류수를 첨가한 control, TSB를 첨가한 control, 질소고정 균을 접종한 실험군, 광합성 균을 접종한 실험군에서 각각 17.93 cm, 26.38cm, 28.43 cm, 27.05 cm으로 확인되었다. 건조 중량을 측정한 결과는 각각 16.
- 49일 차까지 증류수를 첨가한 pot에서는 더 이상의 잎 발생이 나타나지 않았고, 광합성 혼합 균주, 질소고정 혼합 균주에서 5번째 잎까지 발생했다. 4번째 잎과 5번째 잎의 성장을 질소고정 혼합 균주에 비해 광합성 혼합 균주에서 더 높은 성장을 보였다(Table 3).
- 영양배지와 함께 접종한 질소고정 균과 광합성 균을 접종한 토양의 균 군집도는 유사하게 나왔지만, 일부 종에서 차이를 보였다. Silvibacterium bohemicum (5.76%), Tepidimonas thermarum (9.19%)는 각각 광합성 균을 접종한 토양에서 약 1.5%, 5.8% 높은 것을 확인했다. 또 Limisphaera ngatamarikiensis (1.
- 2% 증가한 것으로 확인되었다. TSB를 첨가한 control에 비해 약 126.2%, 101.9% 증가한 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 68 mg 으로 측정되었다. 각 균을 접종한 실험군에서 증류수를 첨가한 control에 비해 약 228.2%, 184.2% 증가한 것으로 확인되었다. TSB를 첨가한 control에 비해 약 126.
- 질소고정 균을 접종한 실험군에서 가장 높은 줄기 성장률을 보인 것으로 확인되었다. 건조 중량을 측정한 결과는 contol에서 식물의 건조 중량은 18.65 mg으로 측정되었다. 질소고정 균을 접종한 실험군에서는 34.
- 05 cm으로 확인되었다. 건조 중량을 측정한 결과는 각각 16.11 mg, 29.13 mg, 36.76 mg, 29.68 mg 으로 측정되었다. 각 균을 접종한 실험군에서 증류수를 첨가한 control에 비해 약 228.
- 잎의 길이를 확인한 결과 각 경우에서 모두 첫번째 잎의 성장에서 차이가 없었다. 두번째 잎의 경우 증류수를 첨가한 pot와 광합성 혼합균주를 첨가한 포트에서는 별차이를 보이지 않았고, 질소고정 혼합 균주를 이용한 pot 에서 약 120% 길이 성장을 확인했다. 증류수를 이용한 pot의 경우 세번째 잎에서 성장 속도가 다른 실험군에 비해 낮은 것을 확인했고, 광합성 혼합 균주와 질소고정 혼합 균주의 경우 각각 약 136%, 142% 높은 성장률을 보인 것을 확인했다.
- 따라서 본 실험에서 선별된 질소고정 균들은 식물성장을 촉진하지만 균주 community에는 영향을 주기 않는 것을 확인했다. 이러한 사실은 본 연구에서 선별된 균은 식물 성장을 촉진하는데 도움을 주지만 주변 환경에 영향을 미치지 않는 친환경 미생물 재제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 8% 높은 것을 확인했다. 또 Limisphaera ngatamarikiensis (1.69%)의 경우는 1.5% 낮은 것을 확인했다. 질소고정 박테리아를 접종하지 않은 다른 실험군에서의 토양 내 균 군집은 많은 상당히 많은 차이를 보이고 있다(Fig.
- 2% 증가한 성장률을 보였다. 또 실험에 사용된 토양을 MiSeq을 통해 균 community 분석을 실시한 결과, 균을 접종하지 않은 토양과 유사한 군집을 가진 것을 확인했다.
- 비료 실험 이후 토양을 이용한 미생물 군집 분석의 결과 대조군 토양과 증류수와 질소고정 균을 접종한 토양의 미생물 군집이 유사한 것으로 나타났다. 또 영양배지를 접종한 토양과 영양배지와 함께 광합성 균을 접종한 토양의 미생물 군집이 유사했다.
- Y8을 선별했다. 선별된 질소고정 균을 perennial rye grass의 성장에 적용한 결과 건조중량이 18.65 mg인 대조군에 비해 34.80 mg (186.60%)으로 증가한 것을 확인했다. 식물 성장후, 질소고정 균이 접종된 토양의 미생물 군집 분석은 대조군과 유사했다.
- Y8로 동정되었다. 선별된 질소고정 균을 이용하여 식물 생장 실험을 실시한 결과 균을 접종하지 않은 식물에 비해 약 186.6% 증가했다. 영양배지를 토양에 첨가해 배양한 식물에 비해 126.
- 영양배지를 첨가한 토양의 미생물 군집도와 대조군의 군집도를 비교하면 대조군에서 1% 이상의 군집도를 가진 미생물들이 대부분 1% 이상의 군집도를 나타냈지만 군집도는 대부분 변화한 결과를 나타났다. 영양배지와 함께 접종한 질소고정 균과 광합성 균을 접종한 토양의 균 군집도는 유사하게 나왔지만, 일부 종에서 차이를 보였다.
- 6% 증가했다. 영양배지를 토양에 첨가해 배양한 식물에 비해 126.2% 증가한 성장률을 보였다. 또 실험에 사용된 토양을 MiSeq을 통해 균 community 분석을 실시한 결과, 균을 접종하지 않은 토양과 유사한 군집을 가진 것을 확인했다.
- 4). 이 결과를 보면 질소고정 박테리아를 접종한 토양에서 토양 내 균 군집은 대조군과 유사했지만 식물 성장은 촉진된 것을 알 수 있다.
- 두번째 잎의 경우 증류수를 첨가한 pot와 광합성 혼합균주를 첨가한 포트에서는 별차이를 보이지 않았고, 질소고정 혼합 균주를 이용한 pot 에서 약 120% 길이 성장을 확인했다. 증류수를 이용한 pot의 경우 세번째 잎에서 성장 속도가 다른 실험군에 비해 낮은 것을 확인했고, 광합성 혼합 균주와 질소고정 혼합 균주의 경우 각각 약 136%, 142% 높은 성장률을 보인 것을 확인했다. 49일 차까지 증류수를 첨가한 pot에서는 더 이상의 잎 발생이 나타나지 않았고, 광합성 혼합 균주, 질소고정 혼합 균주에서 5번째 잎까지 발생했다.
- 이는 control에 비해 약 116%의 높은 성장을 보인 것이다. 질소고정 균을 접종한 실험군에서 가장 높은 줄기 성장률을 보인 것으로 확인되었다. 건조 중량을 측정한 결과는 contol에서 식물의 건조 중량은 18.
- 65 mg으로 측정되었다. 질소고정 균을 접종한 실험군에서는 34.80 mg으로 확인되었다. 이는 control에 비해 186.
후속연구
- 또한 본 연구에서는 하지 않았지만 선별된 균의 다른 특정이나 유전자 분석을 통해 질소고정 의외에 식물 성장을 촉진하는 분석이 실시할 수 있을 것이라 생각된다. 또한 도시 녹화에 활용된다면 좋은 효과를 거둘 것으로 기대된다.
- 이러한 사실은 본 연구에서 선별된 균은 식물 성장을 촉진하는데 도움을 주지만 주변 환경에 영향을 미치지 않는 친환경 미생물 재제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 본 연구에서는 하지 않았지만 선별된 균의 다른 특정이나 유전자 분석을 통해 질소고정 의외에 식물 성장을 촉진하는 분석이 실시할 수 있을 것이라 생각된다. 또한 도시 녹화에 활용된다면 좋은 효과를 거둘 것으로 기대된다.
- 따라서 본 실험에서 선별된 질소고정 균들은 식물성장을 촉진하지만 균주 community에는 영향을 주기 않는 것을 확인했다. 이러한 사실은 본 연구에서 선별된 균은 식물 성장을 촉진하는데 도움을 주지만 주변 환경에 영향을 미치지 않는 친환경 미생물 재제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 본 연구에서는 하지 않았지만 선별된 균의 다른 특정이나 유전자 분석을 통해 질소고정 의외에 식물 성장을 촉진하는 분석이 실시할 수 있을 것이라 생각된다.
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