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문제 정의
- 동굴 내 세 지점에서 채취한 점토, 동굴산호, 붕암 시료 내에 서식하는 호기성미생물의 탁도 변화를 관찰하고, 농화배양된 미생물의 탄산염광물 형성능을 평가하기 위한 실험을 진행하였다. 미생물성장배지는 D-1 배지를 이용하고, Ca 이온의 공급을 위해 칼슘 아세테이트(Calcium acetate monohydrate, Ca(CH3CO2)2⋅H2O, MW = 176.
- 그러므로 국내 석회 동굴 환경에서 서식하는 토착 탄산염광물형성 미생물의 균주 발굴과 광물학적/생지화학적 특성에 대한 연구는 동굴생성물 형성 과정을 이해할 수 있는 생지화학적 정보를 제공할 뿐만 아니라, 최근 주목받는 이산화탄소 고정 및 오염물질 격리를 위한 광물탄산화 기술에 활용될 수 있는 가능성이 높아 다양한 연구의 필요성이 제기되는 실정이다. 이 연구에서는 화순 백아산에 위치한 백아산 아천동굴 내부에 존재하는 동굴생성물(동굴산호, 붕암) 및 주변 퇴적물(점토)의 광물학적 특성을 확인하고, 동굴생성물 내에 서식하는 호기성미생물을 농화 배양하여 탄산염광물 형성을 위한 생광물화작용을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 입구에서 5 m 정도 진입하기까지는 건조한 환경이었고 안으로 들어갈수록 점차 상대습도가 높아졌다. 동굴 내부 약 7 m 지점의 동굴 벽면 아래 부분에서 방해석 결정이 포함된 습윤 상태의 점토 퇴적물을 소량 채취하여 플라스틱 지퍼백에 담았다(Fig.1-B). 그리고 조금 더 내부로 진입하였을 때, 동굴벽면에서 동굴산호(cave coral)들이 발견되었다.
- 동굴 내부에서 채취한 동굴생성물 및 퇴적물과 미생물에 의해 형성된 침전물은 X-선 회절 분석(XRD, X-ray diffraction analysis)을 통해 구성광물을 동정하였다. XRD는 Bragg 방정식(nλ =2dsinθ)를 이용하여 광물 내 회절 간격(d-spacing)을 측정함으로써 광물의 동정이 가능한 방법이다.
- 2 kgf/cm2의 압력조건에서 멸균 후 생지화학적 연구에 사용하였다. 동굴 내에 서식하는 토착 미생물을 농화배양하기 위해 D-1 배지 100 mL가 담긴병에 백아산 아천동굴에서 채취한 퇴적물 및 동굴생성물 시료(동굴산호, 붕암)를 분쇄하여 주입하고 실온의 호기성 조건에서 1주일간 배양하였다.
- 동굴생성물 및 주변 퇴적물 내 탄산염광물형성미생물(carbonate forming microorganisms)의 농화배양과 탄산칼슘 형성 실험을 위해 미생물 배지를 제조하였다. 기존연구에서 D-1배지는 탄산염광물인 백운석(dolomite) 형성 실험에 이용된 것으로, 자연 상태에서 형성되는 백운석이 미생물 분비물질인 바이오필름(biofilm) 위에 형성되기 때문에 이와 비슷한 조건을 제공하기 위해 만든 반-겔(semi-gel) 타입의 배지이다(Sanchez-Roman et al.
- 미생물에 의해 형성된 침전물의 형태 및 화학적 조성을 알아보기 위해 주사전자현미경 및 에너지분산 분광 분석(FE-SEM & EDS, scanning electron microscopy and energy dispersive X-ray spectroscopy)을 실시하였다.
- 일차 실험은 D-1 배지가 담긴 코니컬튜브(conical tube)에 30 mM의 칼슘 아세테이트와 동굴 시료에서 농화배양된 각각의 미생물 배양액을 1% (v/v)씩 주입한 후, 30℃로 고정된 배양기에서 200 rpm으로 교반하며 2주 동안 배양하였다. 미생물의 영향을 비교하기 위해 미생물을 주입하지 않은 동일조건의 대조군을 설정하여 실험을 진행하였다. 이차 실험에서는 붕암에서 유래한 미생물만을 이용하여 칼슘 공급원을 칼슘 락테이트(30 mM)로 바꾸어 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
- 백아산 아천동굴 내 세 지점에서 채취한 동굴산호, 점토, 붕암 시료는 XRD 분석을 통해 구성 광물을 동정하였다(Fig. 2). 백아산 아천동굴의 붕암(A)과 동굴산호(C) 시료는 XRD 분석 결과 방해석(calcite)이 주를 이루고 석영(quartz)이 함께 부성분광물로 수반되는 양상을 보였다.
- 백아산 아천동굴의 내부 지형을 파악하기 위해강원대 지질유산환경연구소에서 측량 및 지도 제작을 수행하였으며, Fig. 1-A 지도 내 격자의 1 unit은 가로 × 세로가 10 m × 10 m이다(Fig.1-A).
- 분석기기는 3D 고분 해능 X선 회절분석기(3D High resolution X-ray diffractometer)로 Cu-Kα선과 Ni-filter를 이용하여 전압 32 kV와 전류 40 mA의 조건으로 분석하였다.
- XRD는 Bragg 방정식(nλ =2dsinθ)를 이용하여 광물 내 회절 간격(d-spacing)을 측정함으로써 광물의 동정이 가능한 방법이다. 분석을 위해 퇴적물은 자연건조 시킨 후 분말시료를 제작하였고, 동굴산호와 붕암 시료는 초음파처리(ultrasonication)를 통해 표면을 세척한 후 건조하여 분말시료로 제작하였다. 생지화학적 실험을 통해 형성된 광물은 XRD 분석을 위해 미생물 생장배지 병을 잘 흔들어 섞은 시료를 채취하여 플라스틱 튜브(conical tube)에 넣고 3,000 rpm에서 5분간 원심분리를 하였다.
- 1-C). 생지화학적 실험을 위해 그중 일부를 채취하여 플라스틱 지퍼백에 담았다. 이어서 폭이 좁고 굴곡이 심한 구간(10-30 m)을 따라 동굴 내부로 진입하여 폭포지점에 도달하기 전 동굴 바닥 면에서 30 cm상층부에 붕암(shelfstone)이 발견되었다(Fig.
- ,2009). 실험을 위한 미생물 성장배지는 기존의D-1배지에 요소(urea)를 추가하였고, 제조 방법은 다음과 같다. 증류수가 담긴 플라스크에 yeastextract 10 g, proteose peptone 5 g, glucose 1 g, NaCl 35 g, urea 20 g을 주입하여 1 L의 수용액으로 맞춘 후 가열교반기에 올려 약 100℃에서 가열하면서 stir bar로 휘저어 잘 섞이도록 하였다.
- 미생물의 영향을 비교하기 위해 미생물을 주입하지 않은 동일조건의 대조군을 설정하여 실험을 진행하였다. 이차 실험에서는 붕암에서 유래한 미생물만을 이용하여 칼슘 공급원을 칼슘 락테이트(30 mM)로 바꾸어 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
대상 데이터
- 이 때문에 동굴의 명칭은 화순 아천산 천연동굴, 백아산 자연동굴, 백아산 석회동굴, 아천동굴 등으로 다양하게 칭해지나, 본문에서는 문화재청 자료와 지리적 위치를 고려하여 ‘백아산 아천동굴’로 명하기로 하였다. 동굴의 위치는 화순군북면 수리 산 412-1번지이며, 현재 전라남도 기념물 제 24호(1979. 9. 30. 지정)로 지정된 상태이다. 백아산 아천동굴 일대는 고생대 지층이 분포하고 있으며, 운모편암에 렌즈상의 석회암층이 협재된 설옥리층과 규암으로 이루어진 용암산층이 분포하고 있다(Lee, 1992).
- 미생물성장배지는 D-1 배지를 이용하고, Ca 이온의 공급을 위해 칼슘 아세테이트(Calcium acetate monohydrate, Ca(CH3CO2)2⋅H2O, MW = 176.18 g/mol)와 칼슘 락테이트(Calcium L-lactate, C6H12CaO6,MW = 220.234 g/mol)를 1 M의 표준 용액으로 만들어 실험에 이용하였다.
- 연구지역인 화순 백아산은 예로부터 아천산으로 불려졌다. 이 때문에 동굴의 명칭은 화순 아천산 천연동굴, 백아산 자연동굴, 백아산 석회동굴, 아천동굴 등으로 다양하게 칭해지나, 본문에서는 문화재청 자료와 지리적 위치를 고려하여 ‘백아산 아천동굴’로 명하기로 하였다.
- 증류수가 담긴 플라스크에 yeastextract 10 g, proteose peptone 5 g, glucose 1 g, NaCl 35 g, urea 20 g을 주입하여 1 L의 수용액으로 맞춘 후 가열교반기에 올려 약 100℃에서 가열하면서 stir bar로 휘저어 잘 섞이도록 하였다. 제조한 배지는 1 L 배지병(serum bottle)에 옮겨 담고 고온고압멸균기(autoclave)를 이용하여 121℃와 1.2 kgf/cm2의 압력조건에서 멸균 후 생지화학적 연구에 사용하였다. 동굴 내에 서식하는 토착 미생물을 농화배양하기 위해 D-1 배지 100 mL가 담긴병에 백아산 아천동굴에서 채취한 퇴적물 및 동굴생성물 시료(동굴산호, 붕암)를 분쇄하여 주입하고 실온의 호기성 조건에서 1주일간 배양하였다.
- 1-A). 조사가 실시된 동굴의 총 연장은 약 120 m이며, 약 80 m 진입 이후부터는 유수에 의한 수로와 동굴폭포가 존재한다. 국내에 분포하는 동굴들과 비교하였을 때 크기는 중소규모 동굴에 해당하며, 동굴 내부 가장 안쪽 부분은 연장이 가능하지만 안전상 진입은 불가능한 상태로 확인되었다.
이론/모형
- 미생물에 의해 형성된 침전물의 형태 및 화학적 조성을 알아보기 위해 주사전자현미경 및 에너지분산 분광 분석(FE-SEM & EDS, scanning electron microscopy and energy dispersive X-ray spectroscopy)을 실시하였다. 분석을 위한 시료는 XRD시료와 같은 방법으로 준비하였으며, 탄소 테이프위에 수분이 제거된 침전물 시료를 올리고 백금(Pt) 코팅을 한 후 Hitachi사 Ultra-high-resolution analytical FE-SEM SU-70을 이용하여 분석하였다. 이때 가속전압은 15-20 kV로 하였다.
성능/효과
- 그 결과 미생물이 증식하면서 탁도가 증가하고 동시에 흰색의 침전물이 가라앉는 변화가 비슷하게 일어났다. 2주 후 흰색의 침전물을 회수하여 생성량을 측정한 결과2.16 g/L로 칼슘 아세테이트보다 약간 적은 양이 형성되었다. 건조된 침전물은 XRD 분석 결과 주로 방해석이며 바테라이트의 피크가 수반되는 양상이 칼슘 아세테이트를 이용한 경우와 같았다(Fig.
- XRD 분석 결과 흰색의 침전물은 탄산칼슘(CaCO3)이며, 모든 실험 조건에서 방해석(2Ɵ =23.05, 29.40, 35.96)이 형성된 것으로 나타났다. 그러나 붕암과 동굴산호 유래 미생물을 이용한 경우에서는 바테라이트(vaterite)도 일부 포함(2Ɵ =24.
- 16 g/L로 칼슘 아세테이트보다 약간 적은 양이 형성되었다. 건조된 침전물은 XRD 분석 결과 주로 방해석이며 바테라이트의 피크가 수반되는 양상이 칼슘 아세테이트를 이용한 경우와 같았다(Fig. 6-A). SEM-EDS 분석에서도 약 15 µm 크기의 구형 입자와 2~3 µm 크기의 능면체 결정들이모여 커다란 구형 입자를 형성하는 것으로 특징을 보였다(Fig.
- 조사가 실시된 동굴의 총 연장은 약 120 m이며, 약 80 m 진입 이후부터는 유수에 의한 수로와 동굴폭포가 존재한다. 국내에 분포하는 동굴들과 비교하였을 때 크기는 중소규모 동굴에 해당하며, 동굴 내부 가장 안쪽 부분은 연장이 가능하지만 안전상 진입은 불가능한 상태로 확인되었다.
- 붕암 유래 미생물을 이용한 이차 실험에서는, 요소가 포함된 D-1 배지에 칼슘 공급원으로 칼슘 락테이트(Ca-lactate)를 30 mM 주입한 후 동일한 조건에서 미생물을 배양하였다. 그 결과 미생물이 증식하면서 탁도가 증가하고 동시에 흰색의 침전물이 가라앉는 변화가 비슷하게 일어났다. 2주 후 흰색의 침전물을 회수하여 생성량을 측정한 결과2.
- 백아산 아천동굴의 붕암(A)과 동굴산호(C) 시료는 XRD 분석 결과 방해석(calcite)이 주를 이루고 석영(quartz)이 함께 부성분광물로 수반되는 양상을 보였다. 그러나 석영의 피크 강도가 매우 낮은 것으로 보아 쇄설성 이물질이 붕암 성장 동안 일부 포함되었을 것으로 추정할 수 있었으며, 주구성 광물은 방해석임을 알 수 있었다. 이때, 방해석의 저면간격(d-spacing, Å)은3.
- 반면, 동굴 내 점토 퇴적물(B)에서는 석영의 피크 강도가 높게 나타나고, 질석(vermiculite)과 백운모(muscovite)가 수반되는 특징을 보였다. 동굴산호와 붕암은 석회동굴에서 형성되는 생성물로서 주 구성 광물이탄산염광물(방해석)로 확인되었지만, 점토 퇴적물은 변성암류 기반암인 운모편암의 풍화산물로서, 일차 광물(석영, 운모) 및 이차 광물(질석)들로 구성된 특징을 보였다.
- 동굴 내 점토 퇴적물에서는 방해석 결정이 포함되어 있었지만, 동굴생성물을제거한 점토질 부분은 주로 기반암에서 풍화되어 잔류된 것으로 사료되는 석영, 운모, 장석과 2차광물인 질석이 포함되어 있었다. 동굴에서 채취한 위의 동굴생성물 및 점토에서 토착 탄산염형성미생물(carbonate forming microorganisms)의 존재를 확인하였으며, 이 미생물들은 호기성 조건에서 생장하면서 요소 분해를 포함한 대사작용을 통해 배양액 내의 지화학적 환경을 변화시켜 탄산염광물형성에 유리한 조건을 만드는 것으로 나타났다. 따라서 48시간 이내에 탄산칼슘 침전물이 가라앉기 시작하였으며, 약 2주 후 탄산칼슘 생성량을 측정한 결과 30 mM의 칼슘 이온(Ca-acetate 또는Ca-lactate)이 공급되었을 때 1.
- 동굴에서 채취한 위의 동굴생성물 및 점토에서 토착 탄산염형성미생물(carbonate forming microorganisms)의 존재를 확인하였으며, 이 미생물들은 호기성 조건에서 생장하면서 요소 분해를 포함한 대사작용을 통해 배양액 내의 지화학적 환경을 변화시켜 탄산염광물형성에 유리한 조건을 만드는 것으로 나타났다. 따라서 48시간 이내에 탄산칼슘 침전물이 가라앉기 시작하였으며, 약 2주 후 탄산칼슘 생성량을 측정한 결과 30 mM의 칼슘 이온(Ca-acetate 또는Ca-lactate)이 공급되었을 때 1.69-2.77 g/L의 탄산칼슘 만들어졌다. 또한 점토유래 미생물을 제외한 붕암과 동굴산호 유래 미생물은 방해석뿐만 아니라 바테라이트도 형성하는 경향을 보였다.
- 77 g/L의 탄산칼슘 만들어졌다. 또한 점토유래 미생물을 제외한 붕암과 동굴산호 유래 미생물은 방해석뿐만 아니라 바테라이트도 형성하는 경향을 보였다.
- 3-B). 반면 미생물을 주입하지 않은 대조군에서는 탁도 변화나 침전물 생성 등의 변화가 관찰되지 않아, 침전물 형성에 미생물의 생장이 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.
- 백아산 아천동굴에서 채취한 동굴산호, 점토, 붕암 시료를 이용하여 미생물을 농화배양한 결과 약24시간 이후부터 탁도가 증가하고(Fig. 3-A), 배양액의 초기 pH 8.6에서 pH 9.01-9.03으로 증가된 것을 통해 미생물이 활발하게 생장함을 알 수 있었다. 농화배양된 미생물은 요소가 포함된 성장배지(D-1 medium)에서 칼슘 아세테이트(Ca-acetate)를 첨가하여 배양한 결과 2-3일 이내에 탁도 증가와 더불어 흰색의 침전물이 형성되기 시작하였다.
- 점토시료를 이용하여 농화배양한 미생물이 형성한 탄산칼슘은 구형의 집합체와 길이 약 5-10 µm를 가지는 능면체 결정들이 함께 관찰되었고(Fig. 5-D,E, F), 동굴산호를 이용하여 농화배양한 미생물이형성한 탄산칼슘은 주로 작은 입자들이 뭉쳐져 약20 µm 크기의 구형 입자를 형성하는 특징을 보였다(Fig. 5-G, H, I).
- 주자전자현미경(SEM-EDS)으로 탄산칼슘 침전물을 관찰한 결과, 붕암을 이용하여 농화배양한 미생물이 형성한 탄산칼슘은 구형 집합체뿐만 아니라 10 µm 이하의 작은 입자들도 많이 관찰되었는데 단일 구형 입자와 구멍 뚫린 주상의 결정들이 특징적으로 관찰되었다(Fig. 5-A, B).
- 농화배양된 미생물은 요소가 포함된 성장배지(D-1 medium)에서 칼슘 아세테이트(Ca-acetate)를 첨가하여 배양한 결과 2-3일 이내에 탁도 증가와 더불어 흰색의 침전물이 형성되기 시작하였다. 형성된 흰색 침전물의 양은 붕암 유래 미생물에서2.77 g/L, 점토 유래 미생물에서 2.60 g/L, 동굴산호 유래 미생물에서 1.69 g/L 형성되었으며, 동일한 양의 칼슘 이온이 공급되었지만 각각의 물질을 이용한 배양한 미생물 종류와 생장속도에 따라 생성된 침전물의 양에 차이가 있음을 알 수 있었다(Fig. 3-B). 반면 미생물을 주입하지 않은 대조군에서는 탁도 변화나 침전물 생성 등의 변화가 관찰되지 않아, 침전물 형성에 미생물의 생장이 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 그러므로 화순 백아산 아천동굴 내의 탄산염형성미생물의 존재와 이들의 생광물화작용은 화순지층 내 석회동굴의 형성 및 동굴생성물 형성과정에도 관련이 있을 것으로 사료되며 추후, 동굴에 서식하는 호기성 미생물의 종분석을 포함한 미생물학적 연구와 다양한 지질학적 분야에 대한 정밀조사가 필요할 것으로 판단된다.
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