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문제 정의
- Cellvibrio 속[1], Cytophaga 속[3] 등 이다. 이에 본 연구에서는 국내 남해안의 해수로부터 40℃ 이상의 고온에서 한천을 분해할 수 있는 능력을 가진 해양미생물을 분리 및 동정하였고, 이 미생물이 생산하는 한천분해효소의 산업적 이용 가능성을 조사하고 생화학적 특성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- PCR primer로는 1492R (5'-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 와 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편은 PCR/Gel Combo Kit (NucleoGen, Siheung, Korea)로 정제하였다. DNA 염기서열 분석은 Cosmogenetech (Seoul, Korea)에서 수행하였다. 분석된 염기서열은 BLAST를 사용하여 보고된 균주들과 유사도를 검토하였으며, Clustal 프로그램 (ClustalW2)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후 Neighbor-joining method와 Bootstrap method (n=1,000)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다.
- PCR primer로는 1492R (5'-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 와 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편은 PCR/Gel Combo Kit (NucleoGen, Siheung, Korea)로 정제하였다.
- The reactions were carried out at 20, 30, 40, 50, 60 and 70℃ in 1,000 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.2% agarose and 500 μl of raw enzyme solution for 30min.
- 기질용액을 중탕 가열한 후 20-70℃의 온도별로 냉각한 후 효소활성을 측정하였다. pH에 따른 한천분해 효소의 활성측정 pH에 따른 한천분해 효소의 활성을 측정하기 위하여 20mM sodium acetate 완충용액(pH 4.0-5.0), 20 mM Tris- HCl 완충용액(pH 5.0-8.0), 20 mM GTA (3,3-dimethyl-glutamic acid, Tris (hydroxymethyl)-aminomethane, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol) 완충용액(pH 8.0-9.0)을 이용하였다. 각 완충용액에 최종농도 0.
- 0)을 이용하였다. 각 완충용액에 최종농도 0.2%(w/v)의 agarose를 첨가하고 50℃에서 효소활성을 측정하였다.
- 0) 완충용액을 이용하였다. 기질용액을 중탕 가열한 후 20-70℃의 온도별로 냉각한 후 효소활성을 측정하였다. pH에 따른 한천분해 효소의 활성측정 pH에 따른 한천분해 효소의 활성을 측정하기 위하여 20mM sodium acetate 완충용액(pH 4.
- 4) zymogram으로 가시화하기에는 단백질의 농도가 낮은 것으로 판단되었다. 따라서 균주 배양과 원심분리로 수확한 세포를 초음파 파쇄기로 파쇄하여 제조한 세포추출물로 zymogram을 실시하였다. 분자량이 약 130 kDa, 80 kDa, 및 69 kDa인 3개의 한천분해효소가 있는 것으로 나타났고, 가장 높은 활성을 가진 한천분해효소의 크기는 130 kDa으로 확인되었다.
- 배양액을 원심분리하여(3,000× g, 4℃, 30 min) 균체를 제거한 후 얻어진 상층액 15 ml를 Snake Skin Dialysis Tubing(Thermo Scientific, USA)에 넣고 l,000 ml 비커에 20 mM Tris-HCl (pH 7.0)를 900 ml 첨가하고, 4℃의 냉장실에 2시간 정치하는 것을 2번 반복한 후 세번째에는 12시간 이상 투석을 시행하였다.
- 세포추출물 10 μl에 SDS가 첨가되지 않은 시료 완충용액 5 μl를 첨가하여 0.1%(w/v) SDS를 함유한 running 완충용액에서 실시하였다.
- 5% 한천을 첨가한 Marine agar 2216 배지에 시료액을 도말한 후 27℃에서 배양하면서 한천분해활성으로 Marine agar 2216 배지를 함몰시키는 KC-1균주를 3차례 이상 순수분리하여 선별하였다. 순수분리된 균체로부터 Wizard Genomic DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 genomic DNA를 획득하고, 16S rDNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. PCR primer로는 1492R (5'-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 와 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편은 PCR/Gel Combo Kit (NucleoGen, Siheung, Korea)로 정제하였다.
- 순수분리한 KC-1 균주를 진탕배양하면서 24시간마다 일부 배양액을 채취하여 배양시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소의 활성을 측정하였다.
- 전기영동이 완료된 후 0.1%(v/v) Triton X-100 (USB, USA) 및 증류수로 1시간씩 세척하여 SDS를 제거한 후 4℃에서 24시간 반응시켰고 루골용액(Lugol's solution)을 이용하여 한천이 분해된 위치를 확인하였다.
- 0) 완충용액을 이용하였다. 조효소액 0.5 ml를 첨가하여 각 온도별로 0.5, 1.0, 1.5, 2.0시간 열처리한 후, 50℃에서 효소활성을 측정하였다. 측정된 효소활성은 열처리전의 효소활성과 비교하였다.
- 조효소액을 이용한 agarose의 분해산물을 TLC로 분석하였다. 조효소액과 0.2%(w/v)의 agarose가 포함된 20 mM TrisHCl (pH 6.0) 완충용액을 50℃에서 0, 1, 3, 5, 10, 15, 30, 60분 반응시킨 후, Silica gel 60 TLC plate (Merck, Darmstadt, Germany)로 분석을 수행하였다. n-Butanol/acetic acid/H2O(2/1/1(v/v/v))를 이용하여 전개시켰고, 10%(v/v) H2SO4로 가시화시켰다.
- 조효소액을 이용하여 온도별 노출시간에 따른 한천분해효소의 잔존활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 0.
- 조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해효소의 활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 0.
- 조효소액을 이용한 agarose의 분해산물을 TLC로 분석하였다. 조효소액과 0.
- 07 g을 증류수 1,000 ml에 녹여서 제조하였다. 최종농도 0.2%(w/v)의 agarose가 포함된 완충용액을 중탕 가열한 후 반응온도까지 냉각하고 반응수조를 이용하여 온도를 유지하면서 기질용액 1 ml에 조효소액 0.5 ml을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다. 1 ml의 효소 반응액에 3 ml의 DNS solution을 첨가하여 100℃에서 10분간 가열한 후 550 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 0시간 열처리한 후, 50℃에서 효소활성을 측정하였다. 측정된 효소활성은 열처리전의 효소활성과 비교하였다.
- 한천분해효소의 분자량을 확인하기 위하여 10% polyacrylamide 겔에 SDS를 첨가하지 않고 0.1%(w/v)의 agarose(LMP, Promega, USA)를 첨가하여 전기영동을 시행하였다[14]. Zymogram에 사용된 세포추출물은 균주 배양액 4 ml을 원심분리(14,000× g, 4℃, 5 min)하여 상층액을 제거하고 여기에 50 mM Tris-HCl (pH 7.
대상 데이터
- 이후부터 Agarivorans sp. KC-1 균주의 한천분해효소는 진탕배양 시작 이후 2일까지 배양한 조효소액을 이용하였다.
- 경상남도 사천시 남일대해수욕장에서 한천분해활성을 가지는 세균의 분리를 위한 시료를 채취하였으며, Marine broth 2216 (Difco, Detroit, USA) 배지에 1.5% 한천을 첨가한 Marine agar 2216 배지에 시료액을 도말한 후 27℃에서 배양하면서 한천분해활성으로 Marine agar 2216 배지를 함몰시키는 KC-1균주를 3차례 이상 순수분리하여 선별하였다. 순수분리된 균체로부터 Wizard Genomic DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 genomic DNA를 획득하고, 16S rDNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다.
- 경상남도 사천시 남일대해수욕장의 해수 시료를 Marine agar 2216 배지에 도말하여 한천 분해능이 우수한 균주를 선별하였다. 분리된 한천분해능 KC-1 균주의 16S rDNA 염기서열 분석결과 1,437 bp의 염기서열을 얻었고, BLAST 탐색으로 Agarivorans albus AP84 및 Agarivorans sp.
- n-Butanol/acetic acid/H2O(2/1/1(v/v/v))를 이용하여 전개시켰고, 10%(v/v) H2SO4로 가시화시켰다. 표준물질로는 D-galactose (Sigma) 및 neoagarooligosaccharides [14]를 사용하였다. TLC에서 나타난 가수분해산물의 농도비율을 계산하기 위하여 Image J 1.
- 1 ml의 효소 반응액에 3 ml의 DNS solution을 첨가하여 100℃에서 10분간 가열한 후 550 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준적정곡선으로 D-galactose를 사용하였다. 한천분해 효소의 활성은 1분당 1 µM의 galactose를 생산하는 한천분해 효소의 양을 1 unit (U)으로 나타내었다.
데이터처리
- DNA 염기서열 분석은 Cosmogenetech (Seoul, Korea)에서 수행하였다. 분석된 염기서열은 BLAST를 사용하여 보고된 균주들과 유사도를 검토하였으며, Clustal 프로그램 (ClustalW2)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후 Neighbor-joining method와 Bootstrap method (n=1,000)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다.
이론/모형
- Agarase 활성은 DNS법을 이용하여 측정하였다. DNS법은 3,5-dinitrosalicylic acid method의 변형법으로 환원당을 측정하는 방법이다[2].
- 표준물질로는 D-galactose (Sigma) 및 neoagarooligosaccharides [14]를 사용하였다. TLC에서 나타난 가수분해산물의 농도비율을 계산하기 위하여 Image J 1.44o (Wayne Rasband, Bethesda, USA)프로그램을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 0에서의 활성을 100%로 하였을 때, 5, 7, 8에서도 80% 이상의 활성을 보였다. pH 5.0에선 20 mM Soduim acetate 와 20 mM Tris-HCl 두 완충용액이 비슷한 활성을 보였고, pH 8.0에선 20 mM Tris-HCl 그리고 20 mM GTA 두 완충용액이 활성에서 차이를 보였다. 다른 한천분해효소의 최적 pH는 Agarivorans sp.
- 4에 나타냈다. pH 5~8 사이에서 높은 활성을 보였으며, 최적인 pH 6.0에서의 활성을 100%로 하였을 때, 5, 7, 8에서도 80% 이상의 활성을 보였다. pH 5.
- 7에 나타냈다. 반응 1분째부터 활발한 분해를 보였으며, 30분과 1시간 반응 후에는 기질이 거의 안 보이는 것을 확인할 수 있었다. 한천분해효소는 β-agarase와 α-agarase 두 종류가 존재한다고 알려져 있으며[4], 기질을 agarose로 사용할 경우에 α-agarase는 agarotriose 및 agaropentose를 생성하고, β-agarase는 neoagarohexaose, neoagarotetraose 및 neoagarobiose를 생성하는데[4, 6, 14] 본 연구에 사용된 조효소액이 neoagarohexaose, neoagarotetraose 그리고 neoagarobiose를 생성하는 것으로 보아 Agarivorans sp.
- 본 연구에서 보고하는 130 kDa, 약 80 kDa, 및 69 kDa의 크기를 나타내는(Fig. 6) 3개의 β-agarase는 신규성이 높다고 할 것이다.
- 경상남도 사천시 남일대해수욕장의 해수 시료를 Marine agar 2216 배지에 도말하여 한천 분해능이 우수한 균주를 선별하였다. 분리된 한천분해능 KC-1 균주의 16S rDNA 염기서열 분석결과 1,437 bp의 염기서열을 얻었고, BLAST 탐색으로 Agarivorans albus AP84 및 Agarivorans sp. HJ-6와 99%의 가장 높은 유사성을 나타냈으므로, 분리균주를 Agarivorans sp.
- 따라서 균주 배양과 원심분리로 수확한 세포를 초음파 파쇄기로 파쇄하여 제조한 세포추출물로 zymogram을 실시하였다. 분자량이 약 130 kDa, 80 kDa, 및 69 kDa인 3개의 한천분해효소가 있는 것으로 나타났고, 가장 높은 활성을 가진 한천분해효소의 크기는 130 kDa으로 확인되었다. Alteromonas sp.
- 2에 나타냈다. 시간에 따른 한천분해 균주의 효소활성과 생장곡선의 측정결과를 살펴보면, 1일차에서 성장기가 끝나고, 이후 지체기가 시작되었음을 알 수 있었다. 효소활성은 2~4일 까지 최고활성을 보이고, 이후 감소하였다.
- 3에 나타냈다. 실험에 사용된 효소는 50℃에서 최대활성을 보였고, 50℃에서의 활성을 100%로 하였을 때, 상대활성이 40℃ 에선 약 95%, 30℃에서 약 90%를 나타내었고, 20 과 60℃에서 60% 이상의 활성을 보였다. 다른 균주들의 한천분해효소의 최적온도를 보면 Simiduia sp.
- 6에 나타냈다. 조효소를 이용한 zymogram에서는 한천이 분해된 단백질의 밴드들이 관찰되지 않았는데, 이는 조효소액이 한천분해활성을 보였지만(Fig. 3, Fig. 4) zymogram으로 가시화하기에는 단백질의 농도가 낮은 것으로 판단되었다. 따라서 균주 배양과 원심분리로 수확한 세포를 초음파 파쇄기로 파쇄하여 제조한 세포추출물로 zymogram을 실시하였다.
- 5에 나타냈다. 최적온도와 최적 pH에서 열처리를 하지 않은 효소의 활성을 100%로 간주하였을 때, 20, 30, 40℃는 해당온도에 2시간 노출되어도 90% 이상의 잔존활성을 보였다. 50℃에서는 노출시간에 따라 활성이 감소되는 것을 볼 수 있었고, 2시간 노출되었을 때 67%의 잔존활성을 보였다.
- NA4의 생산은 반응 1분째부터 관찰되었고 NA2의 생산 은 반응 15분째부터 관찰되었으며, 반응시간에 따라 NA2와 NA4의 농도가 증가하는 것을 알 수 있었다. 최종적으로 neoagarohexaose : neoagarotetraose : neoagarobiose는 각각 21.6%, 32.2% 및 46.2%로 생산되는 것을 알 수 있었다. 본 연구에 이용된 Agarivorans sp.
후속연구
- KC-1 균주가 생산하는 50℃에서 최적활성을 보이는 β-agarase를 이용하여 전분노화방지, 세균성장 억제, 대식세포 활성화 기능, 미백효과 및 보습 기능을 가진 소재로 개발될 것이 기대된다[8].
- 일반적으로 기질로 사용되는 한천은 40℃ 이상의 온도에서 겔(gel)상태가 아닌 졸(sol)상태로 존재하고, 졸 상태에서 일반적으로 효소가 더 높은 활성을 나타낸다는 보고들이 있다[9, 15]. 따라서 본 연구의 균주가 생산하는 한천분해효소는 50℃의 최적온도를 보여 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
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