[논문]소 난자의 체외성숙시 난구세포와 난세포질에서 다르게 발현되는 Matrix Metalloproteinases의 분석

김상환; 윤종택

doi:10.12750/jet.2018.33.3.99

[국내논문] 소 난자의 체외성숙시 난구세포와 난세포질에서 다르게 발현되는 Matrix Metalloproteinases의 분석
The Expression of Matrix Metalloproteinases Activated Differently on In-Vitro Maturation of oocytes Cytoplasm and Cumulus Cells in Bovine 원문보기

Journal of embryo transfer = 한국수정란이식학회지, v.33 no.3, 2018년, pp.99 - 105

김상환 (한경대학교 유전공학 연구소) , 윤종택 (한경대학교 유전공학 연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

To determine the differences in the in-vitro ovum maturation process of bovine, we compared the expression of MMPs in these oocytes and cumulus cell throughout oocytes maturated. In an attempt to investigate the effect of MMP activation and inhibitors in total protein of cumulus cell and, oocytes during oocytes maturation, we examined and monitored the localization and expression of MMPs (MMP-2 and MMP-9), TIMPs (TIMP-2 and TIMP-3), as well as their expression profiles (Real-time PCR, Gelatin Zymography and ELISA). Our results that the bovine oocytes MMP-2 and MMP-9 level was significantly associated with the rate of maturity of oocytes (P<0.05). In cumulus cell, MMP-2 was highly expressed in all stages of the oocyte's maturation. The final oocytes maturation exhibited strong gelatinase activity. There was no significant correlation between cumulus cell MMP-9 and the maturation rate of oocytes. However, for the oocyte cytoplasm MMP-9 expression was significant correlation to the maturation oocytes. There was no significant correlation between cumulonimbus cells MMP-9 and oocyte maturation rates; however, for oocyte cytoplasm, MMP-9 expression was significantly correlated with mature oocyte. However, the TIMP-1 and TIMP-2 protein expression patterns are not correlated with the maturation rate of the oocyte. Our results suggest that MMP different expression pattern may regulate the morphological remodeling of oocyte's in the cumulus cell. Further, the MMP-2 expression has a strong relation with a higher maturation rate of the oocyte.

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AI 본문요약
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문제 정의

, 1994). 본 연구는 난자의 체외성숙 시 난구세포 및 난자의 세포질에서 MMPs의 발현 양상을 분석하고 이를 통하여 난자의 성숙과정에 난구세포 및 난자에서의 MMPs의 역할을 분석하고자 하였다.

제안 방법

난자의 선별은 난구세포의 침밀도에 따라 Wiemer 등(1991)의 방법에 따라 구별하여 선별하였다. 선별된 난자는 Hepes-buffered tissue culture medium-199(TCM-199;Gibco, 락빌, 메릴랜드, 미국)에 50 μg/ml의 gentamycin(SK chemical, 경기도, 한국), 0.3%(w:v) fatty acid free bovine serum albumin(BSA : Sigma, 세인트 루이스, 미주리, 미국)이 첨가된 기본 배양액으로 3∼4회 세정한 후, 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco), 2.5 μg/ml FSH(Sigma), 1 μg/ml estradiol-17β (Sigma), 20 μg/ml epidermal growth factor(Sigma) 및 50 μg/ml gentamycin(SK chemical)을 첨가한 TCM-199 성숙 배양액에 1∼2회 세정 후 같은 배양액이 well당 500 μl 담겨있는 4-well dish(Nunc, 로스킬레, 덴마크)에 각 well당 20∼25개의 난포란을 넣고, 39℃, 5% CO2 배양기 내에서 24시간 동안 체외 성숙을 유도하였다(Table 1).

대상 데이터

도축장에서 도축된 한우의 난소를 35℃의 생리식염수 (0.85%)에 넣어 2시간 이내에 실험실로 운반하여 생리식염수로 3∼4회 세정하고 19 gauge 주사침이 부착된 10 ml 주사기로 2∼6 mm의 난포에서 난포 액과 난자를 흡입, 채취하였다. 난자의 선별은 난구세포의 침밀도에 따라 Wiemer 등(1991)의 방법에 따라 구별하여 선별하였다.

데이터처리

본 논문에서 얻어진 데이터들은 SPSS Statistics 20(SPSS, Korea)를 이용하여 T-test와 GLM(Generalized linear model) 방법으로 통계적 유의성을 분석하였다(p<0.05)

이론/모형

난자세포와 난구세포를 두 그룹으로 분리하여 각 그룹의 세포에서 RNA를 추출하기 위해 RNAqueous™Kit(Invitrogen, Grand Island, NY)의 실험방법을 응용하여 추출하였다. 이후 SupreScrip Ⅱ RT(Invitrogen, Grand Island, NY) 1μl(50units)을 첨가한 뒤 42℃에서 3분간 정치 시킨 후 남아있는 RNA를 제거하기 위해 RNaseA 1μl를 넣어 37℃에서 25분간 반응한 후 4℃에 정치한 후 합성된 cDNA는 RT-PCR을 실시할 때까지 -20℃에 보관하였다.
MMPs와 TIMPs mRNA의 분석을 위하여 On step SYBR RT-PCR Kit(TaKaRa, Japan)의 실험방법에 따라 실행되었으며, 사용된 유전자는 Table 2와 같다. Real-Time PCR 반응은 먼저 95℃에서 2분 동안 1회 실시하였고, 이후 증폭 step으로 95℃에 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 15초로 40회 반복하였으며, 끝으로 72℃에서 5분 동안 1회 실시하여 분석하였다.

성능/효과

이러한 결과는 난자 및 난구세포를 배양한 배양액에서 MMP-9과 TIMP-3의 발현양상에서 차이를 보이고 있는데, 이는 난구 세포에서 형성되는 MMP-9의 발현이 난자에서 형성되는 MMP-9에 비하여 높게 발현함으로써 난자 성숙의 형태학적 변화를 이루는 것으로 사료되며, 이로 인하여 TIMP-3의 작용이 현저히 낮아지는 것으로 볼 수 있다. 따라서 본 연구결과를 종합해볼 때 난자의 성숙에 MMPs의 기전은 난구세포에서 매우 높게 활성화되어 난자의 성숙을 유도하여 난자의 세포질을 성숙할 것이라 본다.
, 2013) 이에 대한 MMPs의 활성은 수정에 관련된 기전에 밀접한 연관성을 가지는 것으로 사료된다. 즉 본 연구 결과에서 난자의 성숙 시 난구세포에서 MMP-2의 발현이 급증하는 것은 난구세포 팽화를 활성화함으로써 난자 성숙 및 성숙된 난자의 대사과정에 중요한 역할을 할 것이라 사료된다. 즉, 체외수정 시 성숙된 난포에서 MMPs 특히 MMP-9의 수치가 급증한 것이 수정률 및 임신률에 효과적이라는 보고처럼 난자의 성숙에 난구세포의 MMPs 활성은 매우 중요하다는 우리의 결과와 같다고 볼 수 있다(Lee et al.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	난자의 성숙은 어떤 과정을 통해 난자의 발생이 이루어지는가?	난자의 체외 성숙은 수정에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 특히 난자의 성숙은 몇 가지의 난구세포의 발달과정을 통해 난자의 발생이 이루어진다. 이런 성숙단계에서 난자는 호르몬에 의한 생리학적 특성을 가지게 되는데 이는 난구세포의 팽화와 더불어 감수분열이 촉진되는 것으로 시사되고 있다 (Eppig, 1996).
	난자의 성숙은 어떤 용어로 불리는가?	이런 성숙단계에서 난자는 호르몬에 의한 생리학적 특성을 가지게 되는데 이는 난구세포의 팽화와 더불어 감수분열이 촉진되는 것으로 시사되고 있다 (Eppig, 1996). 특히 난자의 성숙은 cytoplasmic maturation으로 불리우며, 이는 cytoplasm에서 발생되는 survival 혹은 cell death process에 의한 성숙을 야기 시키는 것이다 (Eppig, 1996; Eppig et al., 1996).
	cell break이 형성되면 난 세포질에서는 핵의 분열을 중단 시키고 necrosis에 접어들게되는 이유는?	그러나 난 세포질 내에서 발생되는 IGF-receptor에 의한 기전이 TNF-a나 혹은 apoptosis의 유발 등에 의하여 cell break이 형성되면 난 세포질에서는 핵의 분열을 중단 시키고 necrosis에 접어들게 된다. 이러한 현상들의 발생의 원인은 바로 난구세포의 부족으로 인한 원활한 호르몬 및 영양의 공급이 부족해지는 것으로 사료되고 있는데 난구세포와 난 세포질간의 상호 연계과정(microtubule에 의한 metabolism) 이 부족할 때 형성된다. 난자 성숙 및 cell break현상에 있어 세포사멸과정은 매우 중요한 기전으로 보고 있는데, 특히 난구세포와 결합되어 성숙하는 난자의 경우 적절한 세포사멸이 형성된다고 알려져 있다 (Klionsky et al.

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Wiemer KE, Watson AJ, Polanski V, McKenna AI, Fick GH and Schultz GA. 1991. Effects of maturation and co-culture treatments on the developmental capacity of early bovine embryos. Mol. Reprod. Dev. 30:330-338.

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