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문제 정의
- 본 연구의 목적은 소아의 치아우식 부위별로 채취한 치면세균막에서 세균을 분리하여 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열을 분석함으로써, 치아우식 부위별 우점 세균을 파악하고 기존의 보고된 종 이외에 치아우식에 관여하는 종을 탐색하고자 하였다.
- 따라서 본 연구는 치아우식 네 부위 40 검체및 건전한 치아에서 5 검체를 대상으로 두 가지 배지를 이용하여 분리하였다. 그리고 분리된 세균은 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하고 동정하여 우식 부위별로 어떠한 세균이 분리되고 우점 하는지 파악하고자 하였다.
- 본 연구는 소아의 치아우식 부위별 우점 세균을 분리하고 기존의 보고된 종 이외에 치아우식에 관여하는 종을 탐색하고자 하였다. 각각의 치아우식 부위 즉 소와열구 우식, 심부 상아질 우식, 평활면 우식, 우식 치아의 치은연상 치면세균막과 대조군으로 건전한 치아의 치은연상 치면세균막에서 채취한 검체로부터 세균을 배양하고, 분리된 세균의 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석 및 동정하였다.
제안 방법
- 치과분야에서 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 기반으로 한 분자생물학적 연구는 오래 전부터 진행되어 왔다. 이 분자생물학적 방법을 통해 동정되지 않은 많은 구강 내 세균과 함께 치은연하 세균 집단의 다양성을 확인했다. 현재 분자생물학적 방법으로 약 620종의 구강 내 세균 종을 확인하였고 그 중 35%는 아직 분리 배양되지 않은 상태이다.
- 세균의 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 특이적으로 부착하는 27F (AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) 및 1492R (5’-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) primer를 사용하여 증폭하였다[9].
- 0 이었다. 우식 치아는 각각 발생 양태를 구분한 소와열구 우식, 평활면 우식의 시료는 탐침기 및 범용 스켈러를 이용하여 채취하였고, 심부상아질 우식의 시료는 spoon excavator를 이용, 추가로 우식치아의 치은연상 치면세균막의 시료는 특수큐렛을 이용하여 채취, 모두 4부위에서 시료를 채취하였다. 그리고 대조군으로는 치아우식이 없고 수복된 치아가 없는 건전한 치아의 구치부 협면 및 설면의 치은연상 치면세균막을 특수큐렛을 이용하여 채취하였다.
- 우식 치아는 각각 발생 양태를 구분한 소와열구 우식, 평활면 우식의 시료는 탐침기 및 범용 스켈러를 이용하여 채취하였고, 심부상아질 우식의 시료는 spoon excavator를 이용, 추가로 우식치아의 치은연상 치면세균막의 시료는 특수큐렛을 이용하여 채취, 모두 4부위에서 시료를 채취하였다. 그리고 대조군으로는 치아우식이 없고 수복된 치아가 없는 건전한 치아의 구치부 협면 및 설면의 치은연상 치면세균막을 특수큐렛을 이용하여 채취하였다. 시료 채취에 사용된 모든 기구는 멸균하여 사용하였다.
- 시료를 생리식염수에 10배 간격으로 단계별 희석하여 tryptic soy agar (TSA; Becton Dickinson) 및 brain heart infusion agar (BHI; Becton Dickinson) 배지에 도말하여 37℃에서 3일간 5% CO2 배양기에 배양하였다. 육안으로 다른 colony 형태를 보인 세균 균체를 확인하였고, 각 샘플마다 5% 이상의 점유율을 보인 세균을 BHI 배지에 다시 순수 배양될 때까지 계대배양 하였다.
- 시료를 생리식염수에 10배 간격으로 단계별 희석하여 tryptic soy agar (TSA; Becton Dickinson) 및 brain heart infusion agar (BHI; Becton Dickinson) 배지에 도말하여 37℃에서 3일간 5% CO2 배양기에 배양하였다. 육안으로 다른 colony 형태를 보인 세균 균체를 확인하였고, 각 샘플마다 5% 이상의 점유율을 보인 세균을 BHI 배지에 다시 순수 배양될 때까지 계대배양 하였다. 순수 분리된 균체는 20% glycerol 용액에 넣은 후 –80℃에 냉동 보존하였다.
- 순수 분리된 미생물 균체 1~2 loop를 lysis buffer [10 mM Tis-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 10 mM NaCl, 2% SDS] 100 ㎕와 2 small spoon의 glass bead (size: 0.4 mm)를 혼합한 후 10분간 TOMY mixer (TOMY, USA)를 이용하여 균체를 파쇄 하였다. 1× TE buffer 200 ㎕와 phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1) 300 ㎕를 첨가하여 3 분간 TOMY mixer에 다시 혼합한 후 원심분리(12,000 rpm, 10 min) 하였다.
- polymerase 그리고 forward와 reverse primer 각각 20 pmole을 첨가하고 멸균 증류수로 최종 50 ㎕로 맞춰 준비 하였다. PCR은 TP600 (TaKaRa, Japan)을 이용하였으며, PCR 조건은 predenaturation 과정으로 94℃에서 5 분간 수행하였고, denaturation (94℃, 30 초), annealing (55℃, 30 초), extension (72℃, 40 초) 반응을 총 30 회 반복하고 postextension (72℃, 10 분) 을 수행하였다. PCR 산물은 1% agarose gel 전기영동으로 증폭 크기를 확인하였다.
- PCR은 TP600 (TaKaRa, Japan)을 이용하였으며, PCR 조건은 predenaturation 과정으로 94℃에서 5 분간 수행하였고, denaturation (94℃, 30 초), annealing (55℃, 30 초), extension (72℃, 40 초) 반응을 총 30 회 반복하고 postextension (72℃, 10 분) 을 수행하였다. PCR 산물은 1% agarose gel 전기영동으로 증폭 크기를 확인하였다.
- 16S rRNA 유전자 증폭산물은 Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega, USA)으로 정제하였으며, 염기서열 분석 primer는 773F (5’-GGG AGC RAA CAG GAT TAG ATA-3’) 및 803R (5’-GGA TTA GAT ACC CTG GTA G-3’)을 사용하였으며, 반응 조건은 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분으로 총 25 cycle로 PCR 하였다.
- 16S rRNA 유전자 증폭산물은 Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega, USA)으로 정제하였으며, 염기서열 분석 primer는 773F (5’-GGG AGC RAA CAG GAT TAG ATA-3’) 및 803R (5’-GGA TTA GAT ACC CTG GTA G-3’)을 사용하였으며, 반응 조건은 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분으로 총 25 cycle로 PCR 하였다. 염기서열 분석은 (주)마크로젠에 의뢰하였다.
- 16S rRNA 유전자 염기서열 유사도 분석은 EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/)[10] 및 BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 염기서열을 비교하였다. 결정된 염기서열과 database에서 얻어진 염기서열은 MEGA6.
- 본 연구는 소아의 치아우식 부위별 우점 세균을 분리하고 기존의 보고된 종 이외에 치아우식에 관여하는 종을 탐색하고자 하였다. 각각의 치아우식 부위 즉 소와열구 우식, 심부 상아질 우식, 평활면 우식, 우식 치아의 치은연상 치면세균막과 대조군으로 건전한 치아의 치은연상 치면세균막에서 채취한 검체로부터 세균을 배양하고, 분리된 세균의 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석 및 동정하였다. 전체 45 검체로부터 우점 세균 90 개 균주에 대해 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 본 연구는 광주 S치과에 내원한 12세 미만의 소아 중 보호자에게 실험의 취지를 설명하고 동의를 구한 45명의 소아에서 시료를 채취하였다. 건전한 치아 시료 5, 치아열구 우식 5, 심부상아질 우식 9, 평활면 우식 9, 우식치아의 치은연상 치면세균막 시료 17이었다.
- 따라서 실제 검체 내 살아있는 세균을 대상으로 군집 및 다양성을 파악하고 분리된 세균의 생리적 특징 및 항생제 저항성, 전체 유전체 분석 등의 특성을 파악하기 위해서는 반드시 세균의 배양이 필요하다. 따라서 본 연구는 치아우식 네 부위 40 검체및 건전한 치아에서 5 검체를 대상으로 두 가지 배지를 이용하여 분리하였다. 그리고 분리된 세균은 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하고 동정하여 우식 부위별로 어떠한 세균이 분리되고 우점 하는지 파악하고자 하였다.
데이터처리
- cgi)를 이용하여 염기서열을 비교하였다. 결정된 염기서열과 database에서 얻어진 염기서열은 MEGA6.06 프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X로 정렬한 후 계통수 제작에 이용하였다[11,12]. 염기서열간 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model으로 이용하였으며, Neighbor-joining method로 계통수를 작성하였다[13,14].
이론/모형
- 염기서열간 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model으로 이용하였으며, Neighbor-joining method로 계통수를 작성하였다[13,14].
성능/효과
- 5세 이었다. 건전한 치아 10 균주, 소와열구 우식 10 균주, 심부 상아질 우식 18 균주, 평활면 우식 18 균주 및 우식치아 치은연상 치면세균막 34 균주, 총 90개의 균주를 분리하였다.
- 총 90개의 우점 균주에 대해 염기서열 분석결과 평균 1,350 bp 이상의 부분적인 염기서열을 확인하였다. 유사도 지수를 기준으로 가장 높게 분석된 표준균주와 계통학적 분석 결과 Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria 및 Bacteroidetes로 크게 4개 문(Phylum)으로 분석 되었다.
- 유사도 지수를 기준으로 가장 높게 분석된 표준균주와 계통학적 분석 결과 Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria 및 Bacteroidetes로 크게 4개 문(Phylum)으로 분석 되었다. 각 우식치아 별로는 소와열구 우식에서 Actinobacteria (42.2%) 및 Firmicutes (42.2%) 모두 높게 분리되었으며, 다음으로 Proteobacteria (15.6%)가 분리되었다. 심부상아질 우식에서는 Firmicutes (92.
- 2%) 두 개 문에서만 분리되었다. 평활면 우식에서는 Firmicutes (73.9%) 문이 높게 분리되었고, Proteobacteria (13.6%), Actinobacteria (11.3%) 문 순으로 분리 되었으며, 우식치아 부위 중 유일하게 Bacteroidetes문에 속하는 1 균주가 분리되었다. 마지막으로 치은연상 치면세균막에서는 Firmicutes (54.
- 3%) 문 순으로 분리 되었으며, 우식치아 부위 중 유일하게 Bacteroidetes문에 속하는 1 균주가 분리되었다. 마지막으로 치은연상 치면세균막에서는 Firmicutes (54.8%) 및 Actinobacteria (42.2%) 문이 높은 분리율을 보였고, Proteobacteria (2.9%) 문이 분리 되었다. 대조군인 건전한 치아의 치은연상 치면세균막에서는 그람양성 세균인 Actinobacteria (66.
- 9%) 문이 분리 되었다. 대조군인 건전한 치아의 치은연상 치면세균막에서는 그람양성 세균인 Actinobacteria (66.0%), Proteobacteria (19.1%), Firmicutes (14.9%) 순으로 분리되었다. 우식 치아 4 부위 모두에서 Firmicutes 문에 속하는 종들이 42.
- 9%) 순으로 분리되었다. 우식 치아 4 부위 모두에서 Firmicutes 문에 속하는 종들이 42.2-92.8% 범위로 매우 높게 분리되었다 [Table 1].
- 건전한 치아에서 세균의 종별 점유율을 살펴보면 Acinomyces naeslundii 종(51.1%)은 5개 검체 중 3개 검체에서 70%, 1개 검체는 20%, 전체 평균 66%로 매우 높게 분리되었다. Corynebacterium durum, Ralstonia pickettii, Streptococcus intemedius 종들이 약15%의 비율로 분리되었다.
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통상 세균의 동정 시 16S rRNA 유전자 염기서열이 표준균주와 97% 이하를 보이면 새로운 종으로 동정하며, 진화적 유연관계를 나타내는 계통도에서도 기존 종과 근연관계가 분리된 것을 확인하였다
- 우식치아의 치은연상 치면세균막은 17개 검체를 대상으로 하였으며 가장 높게 분리된 종은 S. sangunis로 26.3%였고, 10% 이상 분리된 종들은 S. mutans, A. oris, A. viscosus종, 그 다음으로 분리된 종은 A. naelundii, Rothia aeria, Streptococcus mitis 순으로 우점 하였으며, 총 13종이 분리 및 동정되었다.
- 우식부위에서 종별 점유율을 살펴보면 소와열구 우식에서는 Streptococcus sanguinis 종이 5개 검체 중 4개 검체에서 20% 이상 우점하였다. 그리고 Rothia dentocariosa, Neisseria macacae, Actinomyces naeslundii, A. oris,Streptococcus oralis, S. mutans 종 순으로 전체 7종이 분리되었다. 심부상아질 우식 및 평활면 우식에서는 S.
- mutans 종 순으로 전체 7종이 분리되었다. 심부상아질 우식 및 평활면 우식에서는 S. mutans 종이 각각 46.4%와 58.4%로 가장 높게 분리되었다. 심부상아질 우식에서 S.
- 4%로 가장 높게 분리되었다. 심부상아질 우식에서 S. mutans 다음 으로 분리된 우점종은 Lactobacillus rhamnosus, S. salivsarius, S. oralis등 이었고 10% 이상씩 점유하였다. 평활면 우식에서는 S.
- oralis등 이었고 10% 이상씩 점유하였다. 평활면 우식에서는 S. sanguinis 15.4%, Neisseria perflava 종이 9% 이상 분리되어 우식부위에 따라 차이가 있었으며, 유일하게 Bacteroidetes 문에 속하는 Capnocytophaga sputigena종이 분리되었다. 또한 평활면에서는 1개 검체에서 Neisseria 속에 속하는 하나의 균주를 분리하였는데, 기존에 분리된 Neisseria 표준균주와 16S rRNA 유전자 염기서열이 97% 이하의 유사도를 보였다.
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4%, Neisseria perflava 종이 9% 이상 분리되어 우식부위에 따라 차이가 있었으며, 유일하게 Bacteroidetes 문에 속하는 Capnocytophaga sputigena종이 분리되었다. 또한 평활면에서는 1개 검체에서 Neisseria 속에 속하는 하나의 균주를 분리하였는데, 기존에 분리된 Neisseria 표준균주와 16S rRNA 유전자 염기서열이 97% 이하의 유사도를 보였다. 통상 세균의 동정 시 16S rRNA 유전자 염기서열이 표준균주와 97% 이하를 보이면 새로운 종으로 동정하며, 진화적 유연관계를 나타내는 계통도에서도 기존 종과 근연관계가 분리된 것을 확인하였다
- 본 연구에서 배양 배지별 세균 분리 수는 건전한 치아의 치면세균막(HS)의 TSA 및 BHA 배지의 분리 수는 각각 5.6×10 7 CFUs/mg과 4.5×105 7 CFUs/mg 으로 배지별로 비슷하게 분리되었으며, 또한 치아우식 부위 각각에서도 배지별 큰 차이는 보이지 않았다.
- 2="">. 본 연구에서 분리된 종 구성은 4 개문, 8 속, 22 종으로 동정되었다 [Table1].
- 각 우식 부위와 건전한 치아의 치면세균막에서의 우점 세균 종은 비교적 차이를 보였다. 특히 Actinomyces naeslundii 종은 건전한 치아에서 51.
- 각 우식 부위로부터 90 개의 우점 균주를 분리하여 염기서열을 분석한 결과 종 구성은 4 개문, 8 속, 22 종으로 다양하게 분석 되었다. 치아 우식을 일으키는 세균은 기회성 감염균으로 작용하는 경우가 많으며, 개인의 위생관리, 가족력, 면역 등 다양한 요소에 따라 치아우식 발생이 복합적으로 작용하며[26], 기존의 알려진 종뿐만 아니라 배양이 이루어지지 않은 세균과도 매우 밀접한 연관성이 있을 것으로 사료된다.
- 그런 관점에서 특히 본 연구에서 주목할 말한 사항은 평활면 우식 부위 1개의 검체에서 Neisseia 속에 속하는 하나의 균주를 분리한 것이다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 확인한 결과 표준균주와 97% 이하의 유사도를 보여 Neisseia 속에 속하는 것으로 확인되었다. 더불어 진화적 유연관계를 나타내는 계통도에서도 기존 종과 근연관계가 분리된 것을 확인하였다.
- 16S rRNA 유전자 염기서열을 확인한 결과 표준균주와 97% 이하의 유사도를 보여 Neisseia 속에 속하는 것으로 확인되었다. 더불어 진화적 유연관계를 나타내는 계통도에서도 기존 종과 근연관계가 분리된 것을 확인하였다. 이는 신규 미생물로서의 의미가 있다고 보여지며, 신규 미생물 등록을 위한 차후 실험을 진행 할 계획이다.
- 1. 건전한 치아, 소와열구 우식, 심부상아질 우식, 평활면 우식 및 우식 치아의 치은연상 치면세균막에서 각각 세균 5, 7, 8, 7 및 13 종을 확인하였다.
- 2. 건전한 치아 에서는 Actinomycs naeslundii 종이 우점 하였고 다음으로 Corynebactrium durum, Ralstonia pickettii, Streptococcus intermedius 종이 유사하게 분포하였다.
- 3. 치아의 우식부위별 우점종으로 소와열구 우식에서는 S. sanguinis 종이 가장 높은 분리율을 보였고, 심부상아질 우식에서는 S. mutans 및 Lactobacillus rhamnosus, 평활면 우식에서는 S. mutans 및 S. sanguinis 그리고 우식치아 치은연상 치면세균막에서는 S. sanguinis 및 S. mutans가 우점 하였다.
- 결론적으로 치아우식 부위로부터 분리된 종 구성은 4 개문, 8 속, 22 종으로 다양하게 분석 되었다. 또한 분리된 균주에서 Neisseria 속에 속하는 SS1-2 균주가 새로운 종으로 확인되었다.
- 결론적으로 치아우식 부위로부터 분리된 종 구성은 4 개문, 8 속, 22 종으로 다양하게 분석 되었다. 또한 분리된 균주에서 Neisseria 속에 속하는 SS1-2 균주가 새로운 종으로 확인되었다.
- 총 90개의 우점 균주에 대해 염기서열 분석결과 평균 1,350 bp 이상의 부분적인 염기서열을 확인하였다. 유사도 지수를 기준으로 가장 높게 분석된 표준균주와 계통학적 분석 결과 Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria 및 Bacteroidetes로 크게 4개 문(Phylum)으로 분석 되었다. 각 우식치아 별로는 소와열구 우식에서 Actinobacteria (42.
후속연구
- mutans가 치아우식을 일으키고 진행성 우식에 관여하는 주요 원인균으로 알려져 있으나 치면세균막에 존재하는 여러 세균들과 환경요인이 더해져 복합적으로 치아우식이 발생하므로 국내에 거주 하면서 탄수화물을 주식으로 생활하는 소아의 치아우식 부위별로 우점하는 세균을 파악하는 것은 중요한 의미가 있다고 사료된다. 우식 부위별로 우점하는 세균을 분리해냄으로써 차후 치아우식 예방을 위한 다양한 예방 및 치료제를 개발하는 실험에 유용하게 활용되어질 수 있을 것으로 생각된다.
- sanguinis의 우식 억제 역할을 뒷받침 할 직접적인 증거는 부족한 실정이다고 하였다[24]. 그런 점에서 S. sanguinis가 우점한 결과는 계속적으로 연구가 이루어져야 할 부분이라고 생각된다. 일반적으로 치아우식 원인 세균으로 A.
- 이러한 균주들의 생리적, 화학적 특성을 파악하는 데는 일단 배양이 이루어져야 한다. 따라서 기존의 DNA 분석법으로 동정되었지만 배양이 안 되는 세균 종들의 분리를 위해서는 다양한 배양법 개발도 이루어져야 할 것으로 본다. 구강 내 미생물 군집 구조 분석 결과 배양하지 않고 DNA 분석법을 이용하여 무수히 많은 세균 종이 보고되고 있고 이것들 중 배양은 안 되고 있지만 16S rRNA 유전자 동정을 통하여 배양 배지에서 분리가 된다면 더욱 많은 신규 미생물이 등록되어 질 것이다[20].
- 더불어 진화적 유연관계를 나타내는 계통도에서도 기존 종과 근연관계가 분리된 것을 확인하였다. 이는 신규 미생물로서의 의미가 있다고 보여지며, 신규 미생물 등록을 위한 차후 실험을 진행 할 계획이다. 차후 이 균의 기본적인 특성, 병원성 유무 등을 확인하는 실험을 진행하고 추가적으로 유전자 특징을 파악하기 위한 전체 유전체 분석 등의 추후 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 이는 신규 미생물로서의 의미가 있다고 보여지며, 신규 미생물 등록을 위한 차후 실험을 진행 할 계획이다. 차후 이 균의 기본적인 특성, 병원성 유무 등을 확인하는 실험을 진행하고 추가적으로 유전자 특징을 파악하기 위한 전체 유전체 분석 등의 추후 연구가 이루어져야 할 것이다.
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