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문제 정의
- coli O157과 같은 일부 항원형의 경우 식중독을 일으키고 심하면 사망에 까지 이르게 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 전북지역 농업용수 내 위생지표세균을 파악을 통해 미생물학적 오염도를 파악하고자 하였다. 또한 온도와 수질이 농업용수에 존재하는 E.
가설 설정
- 2. Effect of water quality on survival of E. coli O157:H7.
제안 방법
- 균주 밀도 조사는 접종한 샘플로부터 시료를 1 mL 취한 뒤 0.1% Peptone water에 10⁻¹, 10⁻² 희석하고, Rifampicin (50㎍/mL)이 첨가된 LB 배지에서 35±0.5℃, 22~24시간 조건으로 배양 후 집락을 계수하였다.
- D600=1)로 맞춘 뒤 혼합하고 PBS(Phosphate Buffered Saline) 용액(Difco Laboratories, MI, USA)에 10⁵ CFU/mL 농도로 희석한 뒤 용수가 담긴 centrifuge tube에 첨가한 후 균질화하였다. 균주를 접종한 농업용수의 균주 밀도를 조사한 뒤 밀봉상태를 유지하며 5℃, 15℃, 25℃, 35℃ 조건의 배양기에 넣고 총 60일 동안 매 5일마다 주기적으로 E. coli O157:H7 접종 균주 밀도를 조사하였다. 균주 밀도 조사는 접종한 샘플로부터 시료를 1 mL 취한 뒤 0.
- 대장균은 총대장균군 정량분석에서 이용한 여과지를 NA-MUG (Nutrient Agar with MUG) 배지(Difco Laboratories, MI, USA)에 올 려 35±0.5℃의 배양기에서 4시간 배양한 후 UV (366nm)상에서 형광을 나타내는 붉은색 금속성 집락을 계수하였다.
- -N, Chloride, TOC 분석을 수행하였다. 또한 각 샘플은 기존에 오염되어 있는 미생물을 제거하기 위해 0.45 ㎛ 여과막으로 거른 뒤 각각 centrifuge tube (Daihan Scientific, Korea)에 50 mL씩 담아 온도별, 지점별, 경과시간별로 나누어 실험하였다.
- 따라서 본 연구에서는 전북지역 농업용수 내 위생지표세균을 파악을 통해 미생물학적 오염도를 파악하고자 하였다. 또한 온도와 수질이 농업용수에 존재하는 E. coli O157:H7의 생존력에 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구 결과는 우리나라 농업용수의 미생물학적 안전성과 위해성 평가를 위한 기초 자료로 활용될 수 있고, 병원성 세균의 발생예측을 위한 과학적 근거로 활용될 것으로 기대한다.
- 분원성대장균군은 m-FC Agar (Membrane Fecal Coliform Agar) 배지(Difco Laboratories, MI, USA)에 여과막을 올려 41±0.5℃의 배양기에서 24시간 배양한 후 청색 집락을 계수하였다.
- 지표수 시료는 비커봉(Angular beaker, Bürkle GmbH, Germany)을 이용해 중앙지점에서 수면으로부터 2 m 이내로 채수하였고, 지하수 시료는 지하수 펌프를 5분 이상 가동하여 취수정 내의 고인물을 제거한 후 채수병을 이용하여 채수하였다. 시료별 교차오염을 예방하기 위해 각각 지점별로 각기 다른 멸균된 비커와 무균채수병을 사용하였다. 시료는 시료채집 후 아이스박스에 보관하였고 실험실로 이송하여 4℃에 보관 후 24시간 이내에 분석하였다.
- 5℃, 22~24시간 조건으로 배양 후 집락을 계수하였다. 온도 조건별 집락 계수는 3반복으로 실시하였다.
- coli O157:H7 (ATCCⓇ43889, ATCCⓇ43890, ATCCⓇ13890, ATCCⓇ43894) 4종에 대해 Rifampicin (50 ㎍/mL)에 저항성이 있는 균주를 제작하여 실험에 사용하였다. 저항성 유도는 TSA (Tryptic Soy Agar; Oxoid, Basingstoke, England)에서 배양한 균주(E. coli O157:H7 표준균주 4종)를 1 loop 취하여 50 ㎍/mL의 rifampicin이 함유된 LB broth (Luria bertani broth; Oxoid, England)에 접종한 뒤 37℃에서 24시간 배양하는 방법을 이용했다. 실험에 사용된 균주는 50 μg/mL의 Rifampicin을 첨가한 TSB에 접종하여 37℃ 조건에서 배양한 뒤 이용하였다.
- 총대장균군은 m-Endo LES(Membrane Endo’s Lawerence Experimental Station Agar) Agar 배지(Difco Laboratories, MI, USA)에 여과막을 올려 35±0.5℃의 배양기에서 24시간 배양한 후 금속성의 붉은 집락을 계수하였다.
대상 데이터
- 2018년 4월 부터 2018년 10월 까지 지표수 93점, 지표수 40점의 샘플에서 총대장균군, 분원성대장균군, 대장균을 조사하였고, 조사시기별 지표수와 지하수 내 평균 검출량(log CFU/100 mL)과 표준편차, 분리검출 지점수를 Tables 1 ~ 3에 나타내었다. 평균값과 표준편차는 불검출 데이터를 제외한 후 산정하였다.
- 본 실험에 이용된 농업용수는 전북지역의 조사대상 농업용수 중 미생물 오염도가 가장 높은 지역(SW1, GW1), 중간 지역(SW2, GW2), 낮은 지역(SW3, GW3)을 선택해 지표수와 지하수 각각 3지점씩 8 L를 채수하였다.
- 농업용수는 채소류의 식중독세균 오염의 주요 경로 중 하나임에도 불구하고 우리나라에서는 농업용수의 미생물학적 안전성 대한 기초 자료가 부족한 실정이다. 본 연구에서는 전라북도에서 2018년 4월, 7월, 10월에 31지점에서 수집한 지표수 시료와 2018년 4월 7월에 20지점에서 수집한 지하수 시료의 위생지표세균 밀도를 조사하였다. 지표수에서는 평균적으로 대장균군이 2.
- 환경부고시 제2017-57호, 2017)에 따라 선정되었다. 시료 수집 지점은 Fig. 1과 같이 전북지역 내 지표수 31지점, 지하수 20지점으로 하였다. 조사 시기는 2018년 4월부터 2018년 10월까지 지표수는 4월, 7월, 10월에 걸쳐 총 3차례 시료를 수집하였고 지하수는 4월, 7월로 총 2차례 시료를 수집하였다.
- 시험균주는 E. coli O157:H7 (ATCCⓇ43889, ATCCⓇ43890, ATCCⓇ13890, ATCCⓇ43894) 4종에 대해 Rifampicin (50 ㎍/mL)에 저항성이 있는 균주를 제작하여 실험에 사용하였다. 저항성 유도는 TSA (Tryptic Soy Agar; Oxoid, Basingstoke, England)에서 배양한 균주(E.
- 실험에 사용된 균주는 50 μg/mL의 Rifampicin을 첨가한 TSB에 접종하여 37℃ 조건에서 배양한 뒤 이용하였다.
- 1과 같이 전북지역 내 지표수 31지점, 지하수 20지점으로 하였다. 조사 시기는 2018년 4월부터 2018년 10월까지 지표수는 4월, 7월, 10월에 걸쳐 총 3차례 시료를 수집하였고 지하수는 4월, 7월로 총 2차례 시료를 수집하였다.
- 지표수 시료는 비커봉(Angular beaker, Bürkle GmbH, Germany)을 이용해 중앙지점에서 수면으로부터 2 m 이내로 채수하였고, 지하수 시료는 지하수 펌프를 5분 이상 가동하여 취수정 내의 고인물을 제거한 후 채수병을 이용하여 채수하였다.
데이터처리
- 2018년 4월 부터 2018년 10월 까지 지표수 93점, 지표수 40점의 샘플에서 총대장균군, 분원성대장균군, 대장균을 조사하였고, 조사시기별 지표수와 지하수 내 평균 검출량(log CFU/100 mL)과 표준편차, 분리검출 지점수를 Tables 1 ~ 3에 나타내었다. 평균값과 표준편차는 불검출 데이터를 제외한 후 산정하였다.
이론/모형
- 농업용수의 조사 지점은 농촌진흥청에서 시행하고 있는 농업환경변동조사(환경부 수질오염공정시험기준. 환경부고시 제2017-57호, 2017)에 따라 선정되었다. 시료 수집 지점은 Fig.
- 채취한 시료는 수질오염공정시험기준(환경부, 2017)에 따라 pH, DO, BOD, COD, T-P, T-N, NO3-N, Chloride, TOC 분석을 수행하였다. 또한 각 샘플은 기존에 오염되어 있는 미생물을 제거하기 위해 0.
- 총대장균군(Total coliforms; TC), 분원성대장균군(Fecal coliforms; FC), 대장균(Escherichia coli; EC)의 정량분석은 막여과법을 이용하였다. 시료 100 mL를 0.
성능/효과
- 시료수집지점에 따른 회귀직선의 기울기를 비교하면 SW2>SW3>GW1>GW3>SW1>GW2 순으로 높은 감소율을 보였다. SW2 시료에 처리한 병원성 대장균이 가장 높은 감소율을 보였고, GW2에서 가장 낮은 감소율을 보였다. 시료별 이화학성 분석 결과와 비교해 보면 NO3-N 항목과 가장 연관성이 높았다.
- Czajkowska 등(2005)과 Clavero와 Beuchat (1996)은 실험을 통해 높은 온도에서 균 밀도가 급격하게 줄어들고 낮은 온도에서 균 밀도가 장기간 유지된다는 결과를 내었다. 본 실험의 경우 상대적으로 고온인 25℃와 35℃가 상대적으로 저온인 5℃와 15℃ 보다 균 밀도가 급격하게 줄어드는 결과가 나타났지만 온도에 따른 정비례적인 생존력 변화는 확인할 수 없었다.
- 분원성대장균군은 지표수의 경우 7월>4월>10월 순으로 많은 지점에서 검출되었고 세균 밀도 또한 앞에 순서와 일치하여 7월에 가장 높은 밀도를 보였고 10월에 가장 낮은 밀도를 보였다.
- 9 범위로 pH와 DO 모두 지표수와, 지하수, 지점별 큰 차이가 나타나지 않았다. 생물학적산소요구도(BOD)와 화학적산소요구량(COD)은 지표수의 경우 각각 7.9 ~ 11.1, 11 ~ 20.5 범위, 지하수의 경우 각각 2.8 ~ 3.9, 3 ~ 5.4 범위로 지표수의 경우 지하수보다 BOD, COD가 높게 측정되었다. 총 인(T-P)은 모든 지역에서 0.
- 실험에 이용한 농업용수(지표수 3지점, 지하수 3지점)의 이화학성 조사 결과는 Table 5에 나타냈다. 수소이온농도(pH)는 지표수의 경우 6.63 ~ 6.82 범위, 지하수는 6.09 ~ 6.68 범위로 나타났고, 용존산소량(DO)은 지표수 7.11 ~ 8.67 범위, 지하수 7.79 ~ 8.9 범위로 pH와 DO 모두 지표수와, 지하수, 지점별 큰 차이가 나타나지 않았다. 생물학적산소요구도(BOD)와 화학적산소요구량(COD)은 지표수의 경우 각각 7.
- 시료를 지표수와 지하수로 나누어 분석한 결과, 지하수에서 지표수보다 균의 감소율이 낮고 더 오래 생존하는 것으로 나타났다(Fig. 3). 지표수와 지하수의 이화학적 조사결과를 비교해보면 지표수는 지하수에 비해 BOD, COD, TOC 항목이 높고, T-N, NO3-N 항목이 낮게 나왔다.
- 시료별 NO3-N의 함량은 GW2>GW3>GW1>SW1>SW3>SW2로 NO3-N가 높게 측정된 시료에서 대장균 감소율이 낮고 NO3-N가 낮게 측정된 시료에서 대장균 감소율이 높은 결과를 보였다.
- SW2 시료에 처리한 병원성 대장균이 가장 높은 감소율을 보였고, GW2에서 가장 낮은 감소율을 보였다. 시료별 이화학성 분석 결과와 비교해 보면 NO3-N 항목과 가장 연관성이 높았다. 시료별 NO3-N의 함량은 GW2>GW3>GW1>SW1>SW3>SW2로 NO3-N가 높게 측정된 시료에서 대장균 감소율이 낮고 NO3-N가 낮게 측정된 시료에서 대장균 감소율이 높은 결과를 보였다.
- 시료수집지점에 따른 회귀직선의 기울기를 비교하면 SW2>SW3>GW1>GW3>SW1>GW2 순으로 높은 감소율을 보였다.
- 온도에 따른 회귀직선의 기울기를 비교하면 25℃>35℃>5℃>15℃ 순으로, 25℃에서 가장 급격히 밀도가 감소하고 15℃에서 가장 오래 생존하는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 위의 결과를 종합해보면 7월의 지표수는 4월과 10월의 지표수에 비해 미생물학적 오염도가 상대적으로 높았고, 지하수의 경우 지표수에 비해 미생물학적 오염도가 낮았으며 통계적으로 계절에 따른 미생물학적 오염도 차이는 없었다. 7월에 세균밀도가 높은 원인에는 계절에 따른 강우량, 기온, 수질 변화 등이 있을 수 있다(LeChevallier et al.
- , 1989). 이화학적 데이터 중 SW3 시료에서 특이적으로 높은 Chloride가 검출되었지만 이번 연구에서는 미생물 생존과 Chloride 간 특이적인 반응은 관찰되지 않았다.
- 7 범위로 지표수에서 높은 경향을 나타냈다. 종합적으로 BOD, COD, TOC 항목의 경우 지표수가 더 높은 경향을 보였고, T-N, NO3-N 항목의 경우 지하수가 더 높은 경향을 보였다. Chloride의 경우 SW3 한 지점에서 높은 경향을 보였고 다른 지역 간에는 큰 차이가 없었다.
- 종합적으로 보면 E. coli O157:H7은 상대적으로 질소 등의 유기물 함량이 높은 시료에서 더 장기간 생존하였고, 온도별로 비교해보면 높은 온도에서는 처음에 밀도가 증가하지만 급격히 사멸하여 짧은 생존기간을 보였고 낮은 온도에서는 밀도의 증가는 적었지만 긴 생존기간을 보였다. 이번 실험결과를 토대로 볼 때 농산물의 미생물학적 안전성을 확보하기 위해서는 농업용수 내 유기물 유입을 최소화하는 방안 마련이 필요하고 계절별 온도에 따른 농업용수와 농산물의 유해 미생물 오염도에 관한 연구가 추가적으로 이뤄져야 될 것으로 생각된다.
- 지표수에서는 평균적으로 대장균군이 2.7±0.55 log CFU/100 mL, 분원성대장균군 1.9±0.71 log CFU/100 mL, 대장균 1.4±0.58 log CFU/100 mL로 나타났고, 7월에 가장 높은 밀도를 보였다.
- 3). 지표수와 지하수의 이화학적 조사결과를 비교해보면 지표수는 지하수에 비해 BOD, COD, TOC 항목이 높고, T-N, NO3-N 항목이 낮게 나왔다. 이 결과는 앞선 시료종류에 따른 생존률 차이와 같은 양상을 보였다.
- 4 범위로 지표수의 경우 지하수보다 BOD, COD가 높게 측정되었다. 총 인(T-P)은 모든 지역에서 0.33 ~ 0.10 범위로 지표수와 지하수 간 차이가 크지 않았고, 질산성질소(NO3-N)는 지표수에서 0.47 ~ 1.08 범위, 지하수에서 4.67 ~ 26.71 범위로 지하수에서 더 높은 경향이 보였다. 염화물(Chloride)은 SW3 지점을 제외하고 22.
- 65로 나타났다. 총대장균군은 대부분의 지점에서 검출되었는데 지표수의 경우 모든 지점에서 검출되었고, 지하수에서는 4월 60%, 7월 75%의 지점에서 검출되었다. 채수시기별 밀도를 비교해보면 지표수의 경우 7월에 평균 3±0.
- 33 log CFU/100 mL로 나타났고 조사시기간의 유의한 차이가 나타나지 않았다. 총질소량(T-N), 질산성질소(NO3-N) 등 유기물 함량이 높은 용수에서 E. coli O157:H7의 생존이 연장되는 것으로 나타났다. 물에서의 E.
후속연구
- 하지만 본 실험의 경우 조사주기가 길고 수온과 수질과 연계한 분석이 부족하기 때문에 정확한 오염도 증가 원인 파악이 어렵다. 따라서 정확한 오염도 증가 원인을 파악하고 오염원을 추적하기 위해서는 주기적인 모니터링이 필요하고 수온과 수질에 관한 데이터도 연계한 연구도 수행되어야 한다.
- 이번 실험결과를 토대로 볼 때 농산물의 미생물학적 안전성을 확보하기 위해서는 농업용수 내 유기물 유입을 최소화하는 방안 마련이 필요하고 계절별 온도에 따른 농업용수와 농산물의 유해 미생물 오염도에 관한 연구가 추가적으로 이뤄져야 될 것으로 생각된다. 또한 본 연구는 E. coli O157:H7을 인위적으로 접종하여 농업용수에서의 생존력을 확인한 것으로써 실제 농업환경 내 생존력을 알기 위해서는 지속적인 환경요인 및 유해미생물 오염도 조사와 분석을 통해 환경요인과 병원성 세균 간의 상관관계를 구명할 필요가 있다.
- coli O157:H7의 생존력에 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구 결과는 우리나라 농업용수의 미생물학적 안전성과 위해성 평가를 위한 기초 자료로 활용될 수 있고, 병원성 세균의 발생예측을 위한 과학적 근거로 활용될 것으로 기대한다.
- coli O157:H7의 생존에 미치는 영향을 보여준다. 이러한 결과는 농업용수의 미생물학적 오염도를 예측하고 미생물 제어 기술 개발의 기초 자료로서 활용될 수 있다.
- coli O157:H7은 상대적으로 질소 등의 유기물 함량이 높은 시료에서 더 장기간 생존하였고, 온도별로 비교해보면 높은 온도에서는 처음에 밀도가 증가하지만 급격히 사멸하여 짧은 생존기간을 보였고 낮은 온도에서는 밀도의 증가는 적었지만 긴 생존기간을 보였다. 이번 실험결과를 토대로 볼 때 농산물의 미생물학적 안전성을 확보하기 위해서는 농업용수 내 유기물 유입을 최소화하는 방안 마련이 필요하고 계절별 온도에 따른 농업용수와 농산물의 유해 미생물 오염도에 관한 연구가 추가적으로 이뤄져야 될 것으로 생각된다. 또한 본 연구는 E.
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