[논문]낙동강 수계에서 분리한 녹조류 2종의 질소와 인의 결핍에 따른 생장 및 지방산 변화 연구

임경준; 박한울; 이창수; 조복연; 남승원; 이철균; 김지훈

doi:10.15433/ksmb.2019.11.2.081

[국내논문] 낙동강 수계에서 분리한 녹조류 2종의 질소와 인의 결핍에 따른 생장 및 지방산 변화 연구
Effects of Nitrogen and Phosphorus Starvation on Growth and Fatty Acid Production in Newly Isolated Two Freshwater Green Microalgae from Nakdonggang River 원문보기

한국해양바이오학회지 = Journal of marine bioscience and biotechnology, v.11 no.2, 2019년, pp.81 - 88

임경준 (국립낙동강생물자원관 미생물연구실) , 박한울 (인하대학교 해양과학.생물공학과) , 이창수 (국립낙동강생물자원관 미생물연구실) , 조복연 (국립낙동강생물자원관 산업화지원실) , 남승원 (국립낙동강생물자원관 미생물연구실) , 이철균 (인하대학교 해양과학.생물공학과) , 김지훈 (국립낙동강생물자원관 미생물연구실)

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, effects of nitrogen (N) and phosphorus (P) starvation on the cell growth and fatty acid (FA) production of newly isolated freshwater microalgae were investigated. The microalgae were identified as Chlorella sp. and Parachlorella sp. through 18S rRNA sequencing. Optimal culture temperature and light intensity were investigated using a high-throughput photobioreator, and the result was validated in 0.5 L bubble column photobioreactors using BG-11 without NaNO3 and/or K2HPO4. Under nutrient starvation conditions, total FA contents of the microalgae were significantly changed rather than FA composition. Starvation of both N and P was most effective for increasing FA contents in Parachlorella sp (24.4±0.1%) whereas highest FA contents (42.6±1.8%) was achieved when only P was starved in Chlorella sp. among tested conditions. These results suggest an effective strategy for increasing FA production from microalgae using appropriate nutrient starvation.

Keyword

표/그림 (5)

표 Table 1. Experimental condition of nitrogen and phosphorus starvation in BG-11 media for this study
그림 Figure 1. Microscope figures x1000 of Chlorella sp. (a) and Parachlorella sp. (b) isolated from Nakdonggang River. Phylogenetic Analysis of the 18S rDNA of Chlorella sp. and Parachlorella sp. isolated from Nakdonggang River (c).
그림 Figure 2. Growth profiles of Chlorella sp. (left) and Parachlorella sp. (right) under various light intensity and temperature.
그림 Figure 3. Time profiles of Chlorella sp.(a) and Parachlorella sp.(b) dry cell weight cultured under nitrogen and/or phosphorus starvation.
그림 Figure 4. Fatty acid composition (a) and content (b) of Chlorella sp. and Parachlorella sp. cultured under nitrogen and/or phosphorus starvation.

AI 본문요약
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문제 정의

와 Parachlorella sp.를 이용하여 질소와 인의 결핍조건에서 생장, 지방산의 함량과 생산성에 미치는 연구를 진행하고자 하였다. 이를 통해 효과적인 스트레스 인자를 선별하여 고지질 미세조류 생산에 적용하고자 한다.
를 이용하여 질소와 인의 결핍조건에서 생장, 지방산의 함량과 생산성에 미치는 연구를 진행하고자 하였다. 이를 통해 효과적인 스트레스 인자를 선별하여 고지질 미세조류 생산에 적용하고자 한다.
질소, 인, 광원 등 단일 스트레스 인자에 대한 미세조류의 생장과 지방산 생산 연구는 많이 진행되어 있는데 반해, 복합적인 스트레스를 통한 미세조류의 생장과 지방산의 변화 연구는 미비하다. 본 연구에서는 낙동강 상주보에서 녹조류 2종을 분리·동정하였으며, 분리한 2종의 배지 내 질소 또는 인의 단일과 복합결핍 조건에 따른 생장과 지방산의 변화에 대해 분석하고자하였다. 연구 결과로부터 Chlorella sp.

제안 방법

3"E)에서 담수 시료를 채집하였다. 채집한 담수 시료는 광학현미경 관찰을 통해 Pasteur pipette을 이용하여 단일종을 분리하였다. 배양배지는 미세조류 배양에 널리 사용되는 BG-11 배지를 사용하였다.
5기압에서 15분간 멸균한 뒤 사용하였다. 분리된 미세조류는 형태적 관찰을 위해 광학현미경 (Nikon Eclipse Ni-U, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 정확한 종 동정을 위하여 18S rRNA sequence 분석을 하였다.
분리된 미세조류는 형태적 관찰을 위해 광학현미경 (Nikon Eclipse Ni-U, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 정확한 종 동정을 위하여 18S rRNA sequence 분석을 하였다. 18S rRNA 유전자 분석은 코스모진텍㈜에 의뢰하여 수행하였다.
정확한 종 동정을 위하여 18S rRNA sequence 분석을 하였다. 18S rRNA 유전자 분석은 코스모진텍㈜에 의뢰하여 수행하였다. 염기서열 분석은 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)의 nucleotide BLAST search를 이용하였으며, MEGA6 소프트웨어를 사용하여 계통도를 작성하였다[14].
신규로 분리·동정된 미세조류의 온도와 광도별 배양조건 탐색을 위해 고처리 광생물반응기(PhotoBiobox; Shinhwa Science, Daejeon, Korea)를 이용하였다[15].
2종의 미세조류는 온도 10°C에서 35°C로 설정하였으며, 광도의 경우 75 ~ 750 μ mol/m2/s로 각각 2일 동안 배양하였다.
신규로 분리·동정된 미세조류의 온도와 광도별 배양조건 탐색을 위해 고처리 광생물반응기(PhotoBiobox; Shinhwa Science, Daejeon, Korea)를 이용하였다[15]. 분리된 미세조류는 BG-11 배지에서 OD₆₈₀ 1.0까지 배양하였으며 배양된 미세조류는 BG11 배지로 희석하여 OD₆₈₀ 0.5로 조절한 후, 24-well culture plate (Eppendorf, Hamburg, Germany)에 접종하였다. 2종의 미세조류는 온도 10°C에서 35°C로 설정하였으며, 광도의 경우 75 ~ 750 μ mol/m²/s로 각각 2일 동안 배양하였다.
2종의 미세조류는 온도 10°C에서 35°C로 설정하였으며, 광도의 경우 75 ~ 750 μ mol/m²/s로 각각 2일 동안 배양하였다. 배양 후 microplate absorbance reader (Multiskan GO Microplate Spectrophotometer, Thermo Scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 배양전과 후의 흡광도 값을 파장 680 nm에서 측정하여 생장성을 비교하였다.
배지내의 질소와 인의 유무에 따른 미세조류 생장 및 지방산 생산 변화를 분석하기 위해 Table 1과 같이 배지를 준비하여 배양하였다. 질소 또는 인 결핍조건은 NaNO₃와 K₂HPO₄를 제거된 BG-11 배지에서 NaNO₃ 1.5 g/L와 K₂HPO₄ 0.04 g/L를 각각 첨가하여 배양하였고, 질소와 인 결핍조건은 NaNO₃와 K₂HPO₄를 제거한 배지에서 배양하였다. 배양 조건은 고처리 광생물반응기를 통해 결정된 최적 배양조건인 Chlorella sp.
두 미세조류의 질소와 인의 결핍조건에 따른 생장성과 지방산 생산에 대한 영향을 평가하기 위해 균체를 3,000 rpm, 15분간 원심 분리하여 균체만을 회수하였다. 균체에 남아 있는 질소와 인 성분을 제거하기 위해 증류수를 이용하여 세척 후 다시 원심 분리하였다.
균체에 남아 있는 질소와 인 성분을 제거하기 위해 증류수를 이용하여 세척 후 다시 원심 분리하였다. 이 과정을 2회 반복한 뒤 질소와 인이 결핍된 BG-11배지에 접종하여 같은 배양조건으로 실험을 진행하였다. 샘플은 24시간 간격으로 O.
이 과정을 2회 반복한 뒤 질소와 인이 결핍된 BG-11배지에 접종하여 같은 배양조건으로 실험을 진행하였다. 샘플은 24시간 간격으로 O.D680 측정을 통해 성장을 분석하였다. 각 조건에서 추가적으로 4일 동안 배양한 뒤 배양액에서 세포만을 수집하여 지방산 분석을 수행하였다.
D680 측정을 통해 성장을 분석하였다. 각 조건에서 추가적으로 4일 동안 배양한 뒤 배양액에서 세포만을 수집하여 지방산 분석을 수행하였다.
녹조류 2종의 스트레스 처리된 각각의 배양액 400 mL를 채취하여 고속원심분리기를 이용하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리를 통해 바이오매스를 수확하였다. 수확된 바이오매스는 잔류 염분을 제거하기 위해 증류수로 2회 세척하고 원심분리를 2회 반복하였고, 동결건조기를 이용하여 2일 동안 건조시켰다. 동결 건조된 세포 20 mg과 내부표준물질인 C19:0 지방산(Supelco, Bellefonte, PA, USA)을 2 mL의 5%(w/v) 아세틸클로라이드(acetyl chloride)/메탄올(methanol)과 혼합 후 오븐에 80°C에서 1시간 동안 반응시켰다.
반응이 끝난 후 2 mL의 n-hexane을 넣어 FAME을 추출하였다. FAME 함량과 지방산 조성은 기체 크로마토그래프(gas chromatograph; Acme 6000 GC, Younglin, Seoul, Korea)를 이용해 분석하였다. 지방산 분석을 위해 capillary column(HP-INNOWax, Agilent, CA, USA)을 이용하였고, 유량 3 mL/min의 헬륨가스를 이동상으로 이용하였다.
오븐의 분석조건은 초기 오븐 온도 140°C에서 1분간 정치하여 240°C까지 5 °C/min로 승온하여 최종온도에서 10분간 정치하였다. FAME의 정성분석을 위해 FAME standards mixture (F.A.M.E. MixC4-C24, SUPELCO, Bellefonte, PA, USA)와 미세조류 유래 FAME의 체류 시간을 비교하였다.
녹조류 2종은 낙동강 상주보 인근 담수 시료로 부터 Pasteur pipette을 이용하여 단일 종을 분리한 다음 광학현미경을 통해 형태학적 분류를 수행하였다. 형태를 관찰한 결과, Chlorella sp.
녹조류 2종의 최적 온도 및 광을 탐색하기 위해 고처리 광생물반응기를 이용하여 온도 10 ~ 35°C, 광도 75 ~ 500 μmol/m2/s의 조건에서 각각 2일 동안 배양하였다.
1 μm의 타원형의 형태로 관찰되었다(Figure 1a and 1b). 또한 진핵 미세조류 분류의 신뢰성을 높이기 위해 18S rRNA의 염기서열의 계통도 분석을 하였다. 결과는 Figure 1c와 같이 Chlorella sp.
는 25±1°C, 300 μmol/m²/s, 22±1°C, 300 μmol/m²/s에서 각각 가장 높은 생장 속도를 보였다(Figure 2). 상기 실험에서 얻은 결과를 질소와 인의 결핍에 따른 생장성 및 지방산 생산실험에 적용하였다.
본 실험에서도 마찬가지로 낙동강에서 분리한 녹조류 2종의 배지 내에 질소와 인의 유무에 따른 차이를 확인하기 위해서 질소와 인이 첨가된 BG-11 배지에서 7일간 배양한 뒤 균체만을 회수하여 NaNO₃ 또는 K₂HPO₄를 제거된 BG-11 배지에 재접종하여 4일간 추가적으로 배양하였다(Figure 3a and 3b의 화살표 참조). Chlorella sp.

대상 데이터

본 연구에 사용된 미세조류를 분리하기 위해 경상북도 낙동강 상주보(36°26'02.6"N128°14'54.3"E)에서 담수 시료를 채집하였다.
배지의 조성은 NaNO3 1.5 g/L, K2HPO4 0.04 g/L, MgSO4·7H2O 0.075 g/L, CaCl2·2H2O 0.036 g/L, Citric acid 0.006 g/L, Ferric ammonium citrate 0.006 g/L, EDTA (disodium magnesium salt) 0.001 g/L, Na2CO3 0.02 g/L, Trace-metal mix A5 (H3BO3 2.86 g, MnCl2·4H2O 1.81 g, ZnSO4·7H2O 0.222 g, Na2MoO4·2H2O 0.39 g, CuSO2·5H2O 0.079 g, Co(NO3)2·6H2O 0.0494 g/L) 1 mL 121°C, 1.5기압에서 15분간 멸균한 뒤 사용하였다.
채집한 담수 시료는 광학현미경 관찰을 통해 Pasteur pipette을 이용하여 단일종을 분리하였다. 배양배지는 미세조류 배양에 널리 사용되는 BG-11 배지를 사용하였다. 배지의 조성은 NaNO₃ 1.

이론/모형

18S rRNA 유전자 분석은 코스모진텍㈜에 의뢰하여 수행하였다. 염기서열 분석은 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)의 nucleotide BLAST search를 이용하였으며, MEGA6 소프트웨어를 사용하여 계통도를 작성하였다[14].
균체 내 지방산을 직접 전이에스테르화법으로 측정하였고, fatty acid methyl ester(FAME) 양으로 나타내었다. 녹조류 2종의 스트레스 처리된 각각의 배양액 400 mL를 채취하여 고속원심분리기를 이용하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리를 통해 바이오매스를 수확하였다.

성능/효과

의 주요한 지방산의 조성은 palmitic acid (C_16:0), linolenic acid (C_18:3), oleic acid (C_18:1) 순으로 많은 것으로 분석되었다(Figure 4a). 녹조류 2종 모두 질소와 인을 첨가한 배양 조건보다 질소 또는 인의 결핍 배양 조건에서 포화 지방산 비율이 감소하는 반면, 불포화 지방산 비율은 증가하였다. 질소 또는 인의 결핍조건에서 배양시 특징적인 것은 Chlorella sp.
의 질소 또는 인의 결핍 조건에서 oleic acid의 비율이 증가하는 것과 일치한다. 이 결과를 통해 미세조류의 특정 지방산을 생산 시 질소 또는 인의 결핍 조건에서 배양하여 생산하는 것이 효과적이라고 판단된다.
기존의 문헌에서 미세조류의 경우 질소 또는 인 결핍 조건에서 세포내의 탄수화물, 단백질, 지질 등이 증가한다고 알려져 있으며, 이는 본 연구의 결과와 일치한다. 이러한 결과는 미세조류의 지방산 생산 시 질소와 인 첨가한 배양 조건보다 질소 또는 인의 선택적 첨가를 통해 지방산을 생산하는 것이 효과적이라고 판단된다.

후속연구

는 질소와 인의 복합결핍조건이 지방산 생산에 가장 효과적인 것으로 나타났다. 또한 질소 또는 인 결핍조건에 따른 불포화 지방산의 조성변화는 미세조류 유래 지방산 생산 시 특정 지방산의 생산을 촉진시키거나 전체 지방산의 생산성을 향상시키는데 기여할 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	미세조류란?	미세조류는 수서환경에서 이산화탄소, 물, 무기영양염 및 태양에너지를 이용하여 생장을 하며, 무기탄소를 흡수 및 고정할 수 있는 광합성 미생물이다. 지구 생태계의 1차 생산자이며, 전체 생산의 약 절반을 담당하고 있다.
	최근 대기 중 이산화탄소 농도가 증가한 주된 원인은?	최근 들어 급격하게 상승한 대기 중 이산화탄소 농도는 인류와 생태계에 심각한 위협이 되고 있다. 이러한 이산화탄소 농도는 대부분이 화석연료의 과도한 사용에 기인한 것이다. 이와 동시에 현대 산업사회를 떠받히는 화석연료의 감소로 인해 이를 대체할 미래의 에너지원에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
	산업적으로 미세조류가 가지고있는 장점은?	육상식물보다 빠른 광합성작용을 통해 지구 탄소 순환에 중요한 역할을 하여 지구 대기환경에 큰 영향을 미친다고 알려져 있다[1,2]. 산업적으로 불포화 지방산, 단백질, 색소 등과같은 고부가가치 생리활성물질 생산과 대량배양이 용이하다는 장점을 통해 바이오에너지, 건강보조식품, 화장품, 식약품 등으로 활용 가치가 더욱 높아지고 집중적인 연구가 활발히 진행 중에 있다[3-5].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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