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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 고온 환경에서의 홀스타인종의 젖소 반추위내 미생물 군집 구성 변화를 분석하고, 반추위내 미생물과 고온 스트레스의 연관성을 알아보고자 실시되었다.
- 따라서 반추위 미생물의 균총 조성과 함량은 반추위 발효대사와 숙주의 건강상태를 예측하고 이해하는데 필수적이다(Guarner, 2006; Malmuthuge and Guan, 2017). 본 연구를 통해 다른 사육환경에서 반추위 미생물의 차이를 비교 분석하고자 하였다. 시험에 이용된 샷건 시퀀싱은 2세대 차세대염기 서열분석 방법 중 하나로 긴 DNA를 제한 효소 처리하여 임의로 짧은 절편으로 잘라서 개별적으로 시퀀싱을 하는 방법이다.
제안 방법
- 고온 스트레스 영향 수준 측정을 위해 젖소 사육환경 온도 및 상대습도 그리고 젖소의 직장온도 및 호흡수를 수집하였다. THI 측정을 위해 우사에 설치한 온습도계(testo 174H, Testo Korea Ltd., Republic of Korea)를 이용하였으며, 젖소의 직장온도 및 호흡수는 13시-14시에 측정하였다. 젖소가 열 스트레스 영향을 받는 수준은 다음과 같은 THI 산출식(Bohmanova et al.
- 고온 스트레스 영향 수준 측정을 위해 젖소 사육환경 온도 및 상대습도 그리고 젖소의 직장온도 및 호흡수를 수집하였다. THI 측정을 위해 우사에 설치한 온습도계(testo 174H, Testo Korea Ltd.
- 고온 스트레스에 따른 반추위내 미생물 군집 구성 분석을 위해 반추위액을 수집하였다. 반추위액은 젖소의 경구에 stomach tube를 주입하여 채취하였으며, 반추위액 내 미생물 균총 분석을 위해 분석 시까지 -80℃ 초저온냉장고에 보관하였다.
- 그 후, DNA 라이브러리를 농축 및 정제시키고 HiSeq™ 4000 platform (Illumina, San Diego, USA)을 이용해 염기서열을 분석하였다(Macrogen Inc., Seoul, Korea).
- 4kg)를 선발하여 시험에 이용하였다. 급여사료는 한국가축사양표준(2017)의 영양소 요구량에 따라 국립축산과학원 낙농과에서 조사료와 농후사료를 40:60의 비율로 섬유질배합사료(TMR, Total mixed ration)를 제조하였으며, 공시동물이 자유채식 하도록 하였다. 반추위 미생물 분석을 위한 반추위액 시료 채취는 오후 사료 급여 전에 채취하였으며, 온습도지수(THI, temperature Humidity Index)를 고려하여 적온기(대조구: 5월 초)와 고온기(처리구: 7월 말)의 두 시점에 진행하였다.
- Phylum level 미생 물에서부터 species level 미생물까지 고온 스트레스 영향을 받을 시 상대적 함량이 차이 나는 미생물들을 분석하기 위해 LEfSe 방법을 이용하였다. 두 개 이상의 생물학적 조건 사이의 차이를 특징 짓는 유전자, 경로 또는 분류와 같은 게놈 특징을 확인하기 위해 통계적 유의성, 생물학적 관련성 및 효과 크기를 결합하여 분석하였다(Segate et al., 2011). 적온과 고온 환경 사이의 반추위 내 차이를 나타내는 미생물로 27가지가 발견되었다(Fig.
- 반추위 미생물 균총 분석을 위한 DNA 추출은 PowerSoil® DNA Isolation Kit (Cat. No. 12888, MO BIO)를 이용하였으며, 추출된 DNA는 TruSeq nano DNA library prep guide (Illumina)에 따라 정량화 후 LE220 Focused-ultrasonicator (Covaris, Inc.)를 사용하여 DNA 라이브러리를 구축하였다.
- 급여사료는 한국가축사양표준(2017)의 영양소 요구량에 따라 국립축산과학원 낙농과에서 조사료와 농후사료를 40:60의 비율로 섬유질배합사료(TMR, Total mixed ration)를 제조하였으며, 공시동물이 자유채식 하도록 하였다. 반추위 미생물 분석을 위한 반추위액 시료 채취는 오후 사료 급여 전에 채취하였으며, 온습도지수(THI, temperature Humidity Index)를 고려하여 적온기(대조구: 5월 초)와 고온기(처리구: 7월 말)의 두 시점에 진행하였다. 시료 샘플링 당시 온도와 상대습도는 적온기는 19.
- 염기서열 분석이 완료된 후 품질 평가를 위해 FastQC (FastQC; ver. 0.11.8)를 통해 Q score가 20이상인 부분을 사용하였으며, 분석의 정확성 향상을 위하여 KneadData (KneadData; The Huttenhower Lab)를 이용하여 host 서열 및 adapter 서열을 제거한 후 데이터 분석을 수행하였다. 이렇게 얻어진 DNA 판독 값을 Centrifuge 방법(Kim et al.
- 8)를 통해 Q score가 20이상인 부분을 사용하였으며, 분석의 정확성 향상을 위하여 KneadData (KneadData; The Huttenhower Lab)를 이용하여 host 서열 및 adapter 서열을 제거한 후 데이터 분석을 수행하였다. 이렇게 얻어진 DNA 판독 값을 Centrifuge 방법(Kim et al., 2016)과 NCBI 데이터 베이스를 이용하여 각 샘플의 DNA 판독 값들을 분류하였다. Phylum level에서부터 genus level까지 고온 스트레스 영향에 따른 미생물 균총 변화를 탐색하기 위해 Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test에 기초하여, 선형 판별 분석 효과 크기(Linear discriminant analysis Effect Size, LEfSe) 방법(Segata et al.
- 직장온도는 표준 디지털 온도계(KD-133, Polygreen Co., Ltd., Germany)를 사용하여 측정하였으며, 호흡수는 10초동안 뒷 갈비와 요각 사이의 움직임을 측정하고, 6을 곱하여 분당 호흡수를 측정하였다.
대상 데이터
- 홀스타인종 젖소 10두(60±17.7개월령, 체중717±64.4kg)를 선발하여 시험에 이용하였다.
데이터처리
- , 2016)과 NCBI 데이터 베이스를 이용하여 각 샘플의 DNA 판독 값들을 분류하였다. Phylum level에서부터 genus level까지 고온 스트레스 영향에 따른 미생물 균총 변화를 탐색하기 위해 Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test에 기초하여, 선형 판별 분석 효과 크기(Linear discriminant analysis Effect Size, LEfSe) 방법(Segata et al., 2011)을 사용하여 차별적으로 특정 시점에 증감한 미생물 군의 특성을 분석하였다. 이 분석을 위해 KW 테스트의 중요도 임계 값은 0.
이론/모형
- 또한 genus level 미생물의 상대적 함량을 높게 차지하는 미생물은(상대적 함량 2% 이상) phylum level 미생물에서도 상대적으로 높은 함량을 가진 Bacteroidetes (Prevotella와 Bacteroides), Fimicutes (Ruminococcus, Clostridium 및 Bacillus) Proteobacteria (Pseudomonas)의 하위에 미생물들에 속해 있었다(Actinobacteria의 Streptomyces 제외). Phylum level 미생 물에서부터 species level 미생물까지 고온 스트레스 영향을 받을 시 상대적 함량이 차이 나는 미생물들을 분석하기 위해 LEfSe 방법을 이용하였다. 두 개 이상의 생물학적 조건 사이의 차이를 특징 짓는 유전자, 경로 또는 분류와 같은 게놈 특징을 확인하기 위해 통계적 유의성, 생물학적 관련성 및 효과 크기를 결합하여 분석하였다(Segate et al.
- , Republic of Korea)를 이용하였으며, 젖소의 직장온도 및 호흡수는 13시-14시에 측정하였다. 젖소가 열 스트레스 영향을 받는 수준은 다음과 같은 THI 산출식(Bohmanova et al., 2007; NRC, 1971)을 이용하였다.
성능/효과
- AE2032, Erysipelotrichaceae bacterium NK3D112, Bifidobacterium pseudolongum, Lachnospiraceae bacterium FE2018, XBB2008, and AC2029, Eubacterium celulosolvens, Clostridium hathewayi, and Butyrivibrio hungatei가 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
- Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Euryarchaeota, Cyanobacteria, Spirochaetes, Tenericutes, Fusobacteria 및 Fibrobacteres로 구성되어 있었으며(Fig. 2), 상대적 함량을 가장 높게 차지하는 미생물은 Firmicutes (적온환경평균=29.6±3.12%; 고온환경평균 =28.4± 3.98%), Bacteroidetes (적온환경평균=26.7±6.61%; 고온환경평균=34.5± 6.54%) 및 Proteobacteria (적온환경평균=24.2± 2.83%; 고온환경평균=20.6± 1.83%)의 순으로써 나타났다.
- 05). LefSe 분석의 결과를 phylum level로 정리하면, 적온기에는 Firmicutes와 Actinobacteria와 같은 문 단계의 미생물이 상대적으로 많이 존재하 였으며 고온 스트레스 환경하에서는 Fibrobacteres, Proteobacteria, Cyanobacteria, 및 Caudovirales와 같은 반추위 미생물들이 증가하는 것으로 나타났다. 일반적으로 Firmicutes와 Actinobacteria는 주로 그람 양성균으로 비구조탄수화물인 곡류사료를 대사적으로 처리할 때 증가하며, Fibrobacteres, Proteobacteria, Cyanobacteria 및 Caudovirales는 주로 그람 음성균으로 발효성 구조탄수화물을 대사적으로 처리할 수 있는 박테리아 숫자의 증가시킨다(Bryant, 1959; Stewart et al.
- UWB5, Lachnospiraceae bacterium G41, and arboricola가 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
- 3), 미생물 군집 조성에는 변화가 없었으나, 각 미생물의 상대적 함량 비율에는 차이를 나타내었다. 또한 genus level 미생물의 상대적 함량을 높게 차지하는 미생물은(상대적 함량 2% 이상) phylum level 미생물에서도 상대적으로 높은 함량을 가진 Bacteroidetes (Prevotella와 Bacteroides), Fimicutes (Ruminococcus, Clostridium 및 Bacillus) Proteobacteria (Pseudomonas)의 하위에 미생물들에 속해 있었다(Actinobacteria의 Streptomyces 제외). Phylum level 미생 물에서부터 species level 미생물까지 고온 스트레스 영향을 받을 시 상대적 함량이 차이 나는 미생물들을 분석하기 위해 LEfSe 방법을 이용하였다.
- 반추동물에서 탄수화물 대사는 반추위내 미생물을 통해 휘발성 지방산으로 전환되어, 미생물의 유지와 성장 및 반추동물이 필요로 하는 대사 에너지를 공급하여 숙주에게 영향을 미치지만(맹, 1998), 어떠한 대사과정 또는 대사물질을 통해 환경변화에 따른 반추위내 미생물의 차이가 나타나는지는 추가적인 분석이 필요하다. 본 연구에서 결과에서 보여준 고온 스트레스에 반응한 반추위내 미생물 균총 변화는 젖소의 고온 스트레스 반응성과 밀접한 연관성이 있을 것으로 판단된다. 이러한 특정 반추위 미생물의 균총과 고온 스트레스간은 연관성 규명을 위해서는 고온 스트레스에 대응하여 변화된 특정 미생물들이 담당하는 대사작용과 관련된 미생물 기능성 기반의 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 사육환경온도에 따른 phylum level 미생물 군집 조성 결과에서 Bacteroidetes (적 온환경 평균=26.7± 6.61% vs. 고온환경 평균=34.5±6.54%)와 Proteobacteria (적온환경 평균=24.2±2.83% vs. 고온환경 평균=20.6± 1.83%)가 고온 스트레스 상황에서 각각 수치적으로 증가와 감소를 하였다.
- , 2010). 시료 채취 당일로부터 앞 뒤로 10일간의 THI 지수는 적온기에는 64-69의 범위에 있었으며, 고온기에는 75-88 범위 내에 있었으므로(data not shown) 7월 중 시료 채취 시기에는 젖소들이 고온 스트레스 환경에 노출되었다. 홀스타인종의 직장온도 정상 범위는 38.
- 3 백만의 판독된 DNA 정보가 분석에 이용되었다. 적온과 고온의 사육환경에서 수집된 홀스 타인종 젖소 반추위액의 모든 샘플에서 환경 변화에 관계없이 총 50 가지 미생물이 phylum level에서 확인되었다(Fig. 1). Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Euryarchaeota, Cyanobacteria, Spirochaetes, Tenericutes, Fusobacteria 및 Fibrobacteres로 구성되어 있었으며(Fig.
- , 2016). 총 10마리의 홀스타 인종 젖소 반추위액 샘플을 시퀀싱 한 결과, 평균 샘플 당 84.7 백만의 DNA가 판독되었으며, 분석의 편향을 줄이기 위해 순차 정렬 후 데이터 처리 기준에 따라 67.3 백만의 판독된 DNA 정보가 분석에 이용되었다. 적온과 고온의 사육환경에서 수집된 홀스 타인종 젖소 반추위액의 모든 샘플에서 환경 변화에 관계없이 총 50 가지 미생물이 phylum level에서 확인되었다(Fig.
- Genus level 미생물에서도 앞서 주장한 내용과 일치함을 확인하였다. 총 3,500가지의 다양한 미생물 군집 조성이 확인되었으며 (Fig. 3), 미생물 군집 조성에는 변화가 없었으나, 각 미생물의 상대적 함량 비율에는 차이를 나타내었다. 또한 genus level 미생물의 상대적 함량을 높게 차지하는 미생물은(상대적 함량 2% 이상) phylum level 미생물에서도 상대적으로 높은 함량을 가진 Bacteroidetes (Prevotella와 Bacteroides), Fimicutes (Ruminococcus, Clostridium 및 Bacillus) Proteobacteria (Pseudomonas)의 하위에 미생물들에 속해 있었다(Actinobacteria의 Streptomyces 제외).
후속연구
- 특히, 고온에서는 발효성 구조탄수화물의 대사가 유리할 것으로 판단된다. 반추동물에서 탄수화물 대사는 반추위내 미생물을 통해 휘발성 지방산으로 전환되어, 미생물의 유지와 성장 및 반추동물이 필요로 하는 대사 에너지를 공급하여 숙주에게 영향을 미치지만(맹, 1998), 어떠한 대사과정 또는 대사물질을 통해 환경변화에 따른 반추위내 미생물의 차이가 나타나는지는 추가적인 분석이 필요하다. 본 연구에서 결과에서 보여준 고온 스트레스에 반응한 반추위내 미생물 균총 변화는 젖소의 고온 스트레스 반응성과 밀접한 연관성이 있을 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 결과에서 보여준 고온 스트레스에 반응한 반추위내 미생물 균총 변화는 젖소의 고온 스트레스 반응성과 밀접한 연관성이 있을 것으로 판단된다. 이러한 특정 반추위 미생물의 균총과 고온 스트레스간은 연관성 규명을 위해서는 고온 스트레스에 대응하여 변화된 특정 미생물들이 담당하는 대사작용과 관련된 미생물 기능성 기반의 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- , 2016). 젖소가 고온 스트레스에 노출되면 사료섭취량, 산유량, 유질, 수태율 등 생산성 저하로 이어지므로(Hansen, 2007; Hammami et al., 2013; Nguyen et al., 2016), 앞으로 낙농산업에 기후변화로 인한 고온 스트레스가 미칠 부정적인 영향들에 대한 해결할 방안을 모색해야 할 것으로 보인다. 반추위내 미생물은 반추동물이 필요로 하는 에너지 요구량의 70~80%를 공급한다(Nocek and Russell, 1988).
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