[논문]일루미나에서 제작된 TSLRH (Truseq Synthetic Long-Read Haplotyping)와 10X Genomics에서 제작된 The Chromium Genome 시퀀싱 플랫폼을 이용하여 생산된 한우(한국 재래 소)의 반수체형 페이징 및 단일염기서열변이 비교 분석

박원철; 크리스나무티 스리칸스; 박종은; 신동현; 고해수; 임다정; 조인철

doi:10.5352/jls.2019.29.1.1

일루미나에서 제작된 TSLRH (Truseq Synthetic Long-Read Haplotyping)와 10X Genomics에서 제작된 The Chromium Genome 시퀀싱 플랫폼을 이용하여 생산된 한우(한국 재래 소)의 반수체형 페이징 및 단일염기서열변이 비교 분석
A Comparative Analysis of the Illumina Truseq Synthetic Long-read Haplotyping Sequencing Platform versus the 10X Genomics Chromium Genome Sequencing Platform for Haplotype Phasing and the Identification of Single-nucleotide variants (SNVs) in Hanwoo (Korean Native Cattle) 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.1 = no.225, 2019년, pp.1 - 8

박원철 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과) , 크리스나무티 스리칸스 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과) , 박종은 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과) , 신동현 (전북대학교 동물공학과) , 고해수 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과) , 임다정 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과) , 조인철 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과)

초록
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한우(한국 재래 소)에서 반수체형 페이징을 위한 고밀도 시퀀싱을 이용한 비교 분석 논문은 많지가 않다. 이런 고밀도 시퀀싱 플랫폼 중에서, 일루미나에서 서비스 하는 Truseq Synthetic Long-Read Haplotyping 시퀀싱 플랫폼(TSLRH)과 10X Genomics에서 서비스하는 The Chromium Genome 시퀀싱 플랫폼을 특별히 비교 분석하는 논문은 없다. 우리는 한우 연구소의 한우 종모우(아이디: TN1505D2184 or 27214)의 정액에서 DNA를 추출하였으며, 이 DNA로부터 각각의 시퀀싱 플랫폼을 이용하여 시퀀싱 데이터를 생산하였다. 그 후, 우리는 각각의 시퀀싱 플랫폼에 맞는 분석 방법을 이용하여 단일염기서열변이들은 찾아냈다. 그 결과, TSLRH과 10XG의 전체 리드 수는 각각 355,208,304, 1,632,772,004, 맵핑 리드의 개수는 351,992,768(99.09%), 1,526,641,824(93.50%), Q30(%)은 89.04%, 88.60%, 평균 밀도는 13.04X, 74.3X, 가장 긴 페이즈 블락은 1,982,706bp, 1,480,081 bp, N50 페이즈 블락은 57,637 bp, 114,394 bp, 전체 단일염기서열변이는 4,534,989, 8,496,813, 전체 페이징 비율은 72.29%, 87.67%였다. 더욱이, 우리는 각각의 시퀀싱 플랫폼을 비교해서 각각의 시퀀싱 플랫폼의 고유한 단일염기서열변이와 두 시퀀싱 플랫폼에서 공통적으로 존재하는 단일염기서열변이를 각 염색체 별로 확인하였으며, 단일염기서열변이의 개수는 염색체 길이에 정비례한다는 결과를 확인하였다. 결론적으로, 본 연구에서 추천하는 바는 연구비가 충분하지 않을 시에는 TSLRH 보다 10XG을 사용하는 것을 추천한다. 왜냐하면 전체 리드 및 단일염기서열변이 개수, N50 페이즈 블락, 가장 긴 페이즈 블락, 페이즈 비율 그리고 평균 밀도 등이 TSLRH 보다 10XG가 더 높거나 좋기 때문이다.

Abstract ▼ AI-Helper

In Hanwoo cattle (Korean native cattle), there is a scarcity of comparative analysis papers using highdepth sequencing and haplotype phasing, particularly a comparative analysis of the Truseq Synthetic Long-Read Haplotyping sequencing platform serviced by Illumina (TSLRH) versus the Chromium Genome Sequencing platform serviced by 10X Genomics (10XG). DNA was extracted from the sperm of a Hanwoo breeding bull (ID: TN1505D2184/27214) provided by Hanwoo research canter and used for the generation of sequence data from both the sequencing platforms. We then identified SNVs using an appropriate analysis pipeline tailored for each platform. The TSLRH and 10XG platforms generated a total of 355,208,304 and 1,632,772,004 reads, respectively, corresponding to a Q30 (%) of 89.04% and 88.60%, respectively, of which 351,992,768(99.09%) and 1,526,641,824(93.50%) were successfully mapped. For the TSLRH and 10XG platforms, the mean depth of the sequencing was 13.04X and 74.3X, the longest phase block was 1,982,706 bp and 1,480,081 bp, the N50 phase block was 57,637 bp and 114,394 bp, the total number of SNVs identified was 4,534,989 and 8,496,813, and the total phased rate was 72.29% and 87.67%, respectively. Moreover, for each chromosome, we identified unique and common SNVs using both sequencing platforms. The number of SNVs was directly proportional to the length of the chromosome. Based on our results, we recommend the use of the 10XG platform for haplotype phasing and SNV identification, as it generated a longer N50 phase block, in addition to a higher mean depth, total number of reads, total number of SNVs, and phase rate, than the TSLRH platform.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. The graphical scheme of the experimental design, sequencing and bioinformatics method.
표 Table 1. Summary of the basic performance results of The Chromium Genome of 10X Genomics and TSLRH of Illumina
그림 Fig. 2. Histogram of the number of SNVs from TSLRH of Illumina and The Chromium Genome of 10X Genomics: (A) Histogram of the number of SNPs of TSLRH, 10X and common. (B) Histogram of the number of Indels of TSLRH, 10X and common.
표 Table 2. Summary of the number of SNVs and the rate of type SNVs and phasing result from The Chromium Genome of 10X Genomics and TSLRH of Illumina sequencing data
그림 Fig. 3. Visualization of phasing block, haplotype, structural variant and mapped read from The Chromium Genome of 10X Genomics by using Loupe program: (A) Phasing block of each chromosome. (B) Structural variant. (C) Haplotype. (D) Mapped read.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 반수체형 및 단계적 정보를 이용한 최신의 시퀀스 플랫폼인 TSLRH 그리고 10XG을 이용하여 한국 단일 소품종인 한우의 형질 예측 및 반수체형 지도를 구축하기 위해 최적화된 시퀀스 플랫폼을 제안하는 것이 본 연구의 목적이다. 뿐만 아니라, 본 연구에서 분석된 한우 반수체형 정보를 기반으로 추후 한우 집단 유전적 특성을 규명하는 연구에 기초자료로 활용될 것이라 사료된다.

대상 데이터

한우 연구소에서 보유하고 있는 후보종모우 중에 자손의 수가 가장 많은 대표개체를 선정하였다. 한우 연구소에서 제공해 준 대표 종모우의 개체 식별 번호는 2702214이며, 이 개체의 동결 정액에서 DNA를 추출하여 차세대염기서열 자료를 생산하였다(Fig.
한우 연구소에서 보유하고 있는 후보종모우 중에 자손의 수가 가장 많은 대표개체를 선정하였다. 한우 연구소에서 제공해 준 대표 종모우의 개체 식별 번호는 2702214이며, 이 개체의 동결 정액에서 DNA를 추출하여 차세대염기서열 자료를 생산하였다(Fig. 1).

데이터처리

7) Prism 프로그 램으로 6번째 분석 결과의 해당 부분의 statistic-based global phasing을 수행하였다[8]. 10XG에서 생산된 차세대 염기서열 데이터의 분석 과정은 크게 2가지 프로그램을 이용하며, 10X Genomics에서 제공하는 Long Ranger (v.2.1.6) 프로그램과 Loupe genome browser (v.2.1.1) 이용하여 분석하였다. 첫 번째 Long Ranger의 분석 순서는 다음과 같다.
두 번째로, Loupe genome browser는 Long Ranger의 결과 파일을 이용하여 시각화 해주는 프로그 램으로써 haplotype, phasing block, 구조 변이 등을 시각화 해주며 전체적인 수치를 요약해서 보여준다. 최종적으로 TSLRH 과 10XG 방법으로 생산된 차세대 염기서열 데이터를 비교 분석 하기 위해 vcftools (v.0.1.12a)을 이용하여 분석하였다(Fig. 1) [2].

이론/모형

네 번째 단계인 라이브러리 제작에서는 총 7단계, 말단 보정(End repair), A-tailing, 아답터 결합, 결합물 세척, 샘플 인덱스 PCR, 샘플 인덱스 후 양쪽 사이즈 선택(SPRIselect), 라이브러리 제작 후 quality control을 거친 후 정량화 단계로 진행된다. 마지막 단계인 시퀀싱은 HiSeqX 플랫폼을 사용하여 Paired-end 방법, 염기서열 길이는 151 bp, 한우 참조서열 대비 약 40배수로 시퀀싱을 진행 하였다(Fig. 1) [19].

성능/효과

또한, 발굴한 단일염기서열 변이가 기존에 존재하는 변이인지 확인하기 위해 참조 단일염 기서열변이의 정보를 이용하여 확인하였다(Table S1). 그 결과, 10XG과 TSLRH의 전체 단일염기다형성에서 90% 정도가 기존에 알려져 있었고 10% 정도만이 알려지지 않은 단일염기다형성 이었다. 그러나 Indels은 10XG가 77%, TSLRH는 34% 로 10XG가 높게 보이지만 알려지지 않은 Indels의 개수에서는큰 차이를 보이지 않았다.
1). 그 결과, TSLRH으로 발굴한 전체 단일염기다형성의 개수는 4,061,597 개 였다. 그리고 이 단일염기다형성 중 동형접합체(Homozygous)의 개수는 219,582개로 비율은 5.
본 연구의 결과를 통해 비용의 절감, 많은 단일염기서열변이 발굴, 반수체의 길이, 페이징 비율 등이 TSLRH보다 상대적으로 좋은 10XG가 한국의 단일 소 품종인 한우의 반수체형 지도 작성 및 형질 예측 분석에 필요한 시퀀싱 플랫폼으로 적당할 것이라고 사료 된다. 다만 예산이 풍부할 때에는 상호 보완적인 부분이 있는 두 시퀀싱 플랫폼을 같이 쓰는 것이더 좋은 방법이라고 사료된다.
67%인 것을 확인 하였다(Table 2). 이 결과를 바탕으로, 10XG이 TSLRH 보다 더 많은 단일염기 다형성과 Indels을 발굴할 수 있으며, 더 높은 비율로 페이징을 한다는 것을 확인하였다. 각각의 시퀀싱 플랫폼의 단일염기서열변이를 비교하기 위해 염색체 별로 분포가 어떻게 되어 있는지 확인하였다.
여기까지 결과를 비교하면 두 가지 시퀀싱 플랫폼 모두 신뢰할 수 있는 양질의 시퀀싱 데이터를 생산하는 것을 알수 있다. 조금 더 세부적인 부분을 살펴보면 전체 리드 개수, 평균 리드의 중첩, 전체 리드가 유전체 전체를 차지는 하는 영역 비율, 가장 긴 페이징 블락, N50 페이징 블락 그리고 가격을 비교 했을 때에는 압도적으로 10XG가 TSLRH 보다 좋은 것을 확인 할 수 있었다(Table 1).
여기서 상호보완적인 부분은 크게 두 가지로 나뉘어 진다. 첫 번째로 두 플랫폼에서 같은 영역의 단일염기서열변이도 발굴 할 수 있지만 서로 다른 영역의 단일염기서열변이들도 발굴하기 때문에 두 시퀀싱 플랫폼을 다 사용함으로써 더 많은 영역의 단일염기서열 변이들을 발굴 수 있다는 것이다. 두 번째로 양쪽 모든 시퀀싱 플랫폼에서 발굴된 단일염기서열변이들은 두 플랫폼 모두에서 검증된 단일염기서열변이 이기 때문에 높은 신뢰 값을 가진다고 할수 있겠다.
63%였다. 최종적으로 10XG의 페이징 비율은 87.67%인 것을 확인 하였다(Table 2). 이 결과를 바탕으로, 10XG이 TSLRH 보다 더 많은 단일염기 다형성과 Indels을 발굴할 수 있으며, 더 높은 비율로 페이징을 한다는 것을 확인하였다.
19%였다. 최종적으로 TSLRH 에서 페이징 비율은 72.29%인 것으로 확인되었다. 10XG으로 발굴한 전체 단일염기다형성의 개수는 7,548,893개였다.

후속연구

또한본 연구와 같이 반수체형 분석을 위한 시퀀싱 플랫폼을 비교한 논문은 아직까지 많이 보고 된 바가 없다. 따라서 본 연구는 앞으로 반수체형 분석을 하는 연구자들이 어떠한 시퀀싱 플랫 폼을 따라야 할 지, 예산에 맞는 시퀀싱 플랫폼은 무엇인지를 알려주는 선행 연구라고 사료된다.
본 연구는 반수체형 및 단계적 정보를 이용한 최신의 시퀀스 플랫폼인 TSLRH 그리고 10XG을 이용하여 한국 단일 소품종인 한우의 형질 예측 및 반수체형 지도를 구축하기 위해 최적화된 시퀀스 플랫폼을 제안하는 것이 본 연구의 목적이다. 뿐만 아니라, 본 연구에서 분석된 한우 반수체형 정보를 기반으로 추후 한우 집단 유전적 특성을 규명하는 연구에 기초자료로 활용될 것이라 사료된다.

참고문헌 (19)

Armstrong, E. E., Taylor, R. W., Prost, S., Blinston, P., van der Meer, E., Madzikanda, H., Mufute, O., Mandisodza, R., Steulpnagel, J. and Sillero-Zubiri, C. 2017. Entering the era of conservation genomics: Cost-effective assembly of the African wild dog genome using linked long reads. bioRxiv 195180.
Danecek, P., Auton, A., Abecasis, G., Albers, C. A., Banks, E., DePristo, M. A., Handsaker, R. E., Lunter, G., Marth, G. T. and Sherry, S. T. 2011. The variant call format and VCFtools. Bioinformatics 27, 2156.

상세보기
Elsik, C. G., Tellam, R. L. and Worley, K. C. 2009. The genome sequence of taurine cattle: a window to ruminant biology and evolution. Science 324, 522.

상세보기
Greer, S. U., Nadauld, L. D., Lau, B. T., Chen, J., , C., Ford, J. M., Kuo, C. J.Wood- Bouwens and Ji, H. P. 2017. Linked read sequencing resolves complex genomic rearrangements in gastric cancer metastases. Genome Med. 9, 57.

상세보기
Jo, C., Cho, S., Chang, J. and Nam, K. 2012. Keys to production and processing of Hanwoo beef: A perspective of tradition and science. Animal Frontiers 2, 32.

상세보기
Kim, D., Kim, Y., Chung, Y., Yoo, Y. and Park, B. 1993. A study on the consumer's attitude to beef-(1)-Consumer's purchasing pattern and preference. RDA Journal of Agricultural Science (Korea Republic).
Kuhn, C., Freyer, G., Weikard, R., Goldammer, T. and Schwerin, M. 1999. Detection of QTL for milk production traits in cattle by application of a specifically developed marker map of BTA6. Anim. Genet. 30, 333.

상세보기
Kuleshov, V., Xie, D., Chen, R., Pushkarev, D., Ma, Z., Blauwkamp, T., Kertesz, M. and Snyder, M. 2014. Whole-genome haplotyping using long reads and statistical methods. Nat. Biotechnol. 32, 261.

상세보기
Lee, K. T., Chung, W. H., Lee, S. Y., Choi, J. W., Kim, J., Lim, D., Lee, S., Jang, G. W., Kim, B. and Choy, Y. H. 2013. Whole-genome resequencing of Hanwoo (Korean cattle) and insight into regions of homozygosity. BMC Genomics 14, 519.

상세보기
Lee, S. H., Choi, B. H., Lim, D., Gondro, C., Cho, Y. M., Dang, C. G., Sharma, A., Jang, G. W., Lee, K. T. and Yoon, D. 2013. Genome-wide association study identifies major loci for carcass weight on BTA14 in Hanwoo (Korean cattle). PLoS One 8, e74677.

상세보기
Lim, D., Lee, S. H., Kim, N. K., Cho, Y. M., Chai, H. H., Seong, H. H. and Kim, H. 2013. Gene co-expression analysis to characterize genes related to marbling trait in Hanwoo (Korean) cattle. Asian-Australas. J. Anim. Sci. 26, 19.

원문보기 상세보기
Mostovoy, Y., Levy-Sakin, M., Lam, J., Lam, E. T., Hastie, A. R., Marks, P., Lee, J., Chu, C., Lin, C. and Dzakula, Z. 2016. A hybrid approach for de novo human genome sequence assembly and phasing. Nat. Methods 13, 587.

상세보기
Nielsen, R., Paul, J. S., Albrechtsen, A. and Song, Y. S. 2011. Genotype and SNP calling from next-generation sequencing data. Nat. Rev. Genet. 12, 443.

상세보기
Romiguier, J., Ranwez, V., Douzery, E. J. and Galtier, N. 2010. Contrasting GC-content dynamics across 33 mammalian genomes: relationship with life-history traits and chromosome sizes. Genome Res. 20, 1001.

상세보기
Snyder, M. W., Adey, A., Kitzman, J. O. and Shendure, J. 2015. Haplotype-resolved genome sequencing: experimental methods and applications. Nat. Rev. Genet 16, 344.

상세보기
Tewhey, R., Bansal, V., Torkamani, A., Topol, E. J. and Schork, N. J. 2011. The importance of phase information for human genomics. Nat. Rev. Genet 12, 215.

상세보기
Xia, L. C., Bell, J. M., Wood-Bouwens, C., Chen, J. J., Zhang, N. R. and Ji, H. P. 2017. Identification of large rearrangements in cancer genomes with barcode linked reads. Nucleic Acids Res. 46, e19.
Yeo, J. S., Kim, J. W., Chang, T. K., Park, Y. A. and Nam, D. H. 2000. Utilization of DNA marker-assisted selection in Korean native animals. Biotechnol. Bioprocess Eng. 5, 71.

원문보기 상세보기
Zheng, G. X., Lau, B. T., Schnall-Levin, M., Jarosz, M., Bell, J. M., Hindson, C. M., Kyriazopoulou-Panagiotopoulou, S., Masquelier, D. A., Merrill, L. and Terry, J. M. 2016. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nat. Biotechnol. 34, 303.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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