[논문]Pseudomonas aeruginosa BCNU 1204의 항균활성과 활성 물질

신화진; 주우홍

doi:10.5352/jls.2019.29.1.84

Pseudomonas aeruginosa BCNU 1204의 항균활성과 활성 물질
Antimicrobial Activity of Pseudomonas aeruginosa BCNU 1204 and Its Active Compound 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.1 = no.225, 2019년, pp.84 - 89

신화진 (창원대학교 생물학화학융합학부) , 주우홍 (창원대학교 생물학화학융합학부)

초록
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신규 항세균물질을 탐색하는 사전조사에서 몇몇 분리균주들이 그람양성 세균과 그람음성 세균 모두에 항균활성을 보이며, 심지어 methicillin내성 Staphylococcus aureus (MRSA)에도 항균활성을 나타내었다. 이들 균주 중에서 한 균주가 표현형과 계통분석을 이용하여 특히 16S 리보좀 RNA 유전자 염기서열에 기초하여 Pseudomonas aeruginosa로 동정되었다. BCNU 1204 균주의 항균물질은 King's medium B (pH 7.0)에서 $35^{\circ}C$의 온도 조건으로 4일 배양 후 가장 최대로 생산되었다. 항균물질을 각종 유기용매로 분획한 결과, P. aeruginosa BCNU 1204의 dichloromethane (DCM)분획과 ethylacetate (EA) 분획이 그람 양성 세균에 강력한 항균활성을 보였으며, 특히 ethylacetate (EA) 분획이 methicillin내성 Staphylococcus aureus (MRSA)에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다. Recycling preparative LC와 preparative TLC 로 활성물질 하나(분획 5-2)를 분리하여 GC-MS 분석한 결과 phenazine 화합물에 속하는 phenazine-1-carboxylic acid 로 동정하였다. 그리고 MRSA 균주에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)가 MRSA균주인 CCARM 3089, 3090, 3091 그리고 3095 균주에 대하여 각각 $25{\mu}g/ml$, $50{\mu}g/ml$, ${\geq}25{\mu}g/ml$ 그리고 ${\geq}50{\mu}g/ml$ 임을 확인하였다. 그러므로 P. aeruginosa BCNU 1204 분리균주는 항 MRSA 항생물질을 개발하기 위한 잠재 가치가 높은 생물자원으로 기대되며, P. aeruginosa BCNU 1204 균주로부터 리더 화합물을 획득하기 위한 보다 많은 연구가 요구된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Previous screening of novel antibacterial agents revealed that some bacterial isolates exhibited antibiotic activity against both gram-positive and gram-negative bacteria and that they showed antibacterial activity, even against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Among these isolates, one bacterial strain, BCNU 1204, was identified as Pseudomonas aeruginosa using phenetic and phylogenetic analysis, based on 16S ribosomal RNA gene sequences. The maximum productivities of antimicrobial substances of BCNU 1204 were obtained after being cultured at $35^{\circ}C$ and pH 7.0 for 4 d in King's medium B (KMB). Dichloromethane (DCM) and ethylacetate (EA) extracts of P. aeruginosa BCNU 1204 exhibited strong antimicrobial activity, particularly against gram-positive bacteria. The EA extracts exhibited broad-spectrum activity against antibiotic resistant strains. Fraction 5-2, was obtained by recycling preparative liquid chromatography (LC) and preparative thin-layer chromatography (TLC) and was identified as phenazine-1-carboxylic acid belonging to phenazines using gas chromatography and mass spectrometry (GC/MS). Its minimum inhibitory concentration (MIC) values were $25{\mu}g/ml$, $50{\mu}g/ml$, ${\geq}25{\mu}g/ml$, and ${\geq}50{\mu}g/ml$ for MRSA CCARM 3089, 3090, 3091, and 3095 strains, respectively. P. aeruginosa BCNU 1204 may be a potential resource for the development of anti-MRSA antibiotics. Additional research is required to identify the active substance from P. aeruginosa BCNU 1204.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Phylogenetic position of Pseudomonas sp. BCNU 1204 based on 16S ribosomal RNA gene sequences.
표 Table 1. Antimicrobial activity of Pseudomonas aeruginosa BCNU 1204 against test bacteria
그림 Fig. 2. Cell growth of Pseudomonas aeruginosa BCNU 1204 cultured in a King's medium B and antibiotic activity of its crude extract. ●: cell growth of BCNU 1204, ■: pH of culture medium, ◇: its inhibitory activity against S. aureus CCARM 3090 , △: its inhibitory activity against S. aureus CCARM 3091, ○: its inhibitory activity against S. aureus CCARM 3115, □: its inhibitory activity against S. aureus CCARM 3561.
표 Table 2. Antimicrobial activity of HA, DCM and EA extract of Pseudomonas aeruginosa BCNU 1204 against test bac-teria
표 Table 3. Minimal inhibitory concentration of purified 5-2 com-pound
그림 Fig. 3. Gas chromatographic and gas chromatographic-mass spectrometric (GC-MS) analysis of purified phenazine-1-carboxylic acid. (A) Gas chromatogram of purified phenazine-1-carboxylic acid, (B) GC-MS chromatogram of purified phenazine-1-carboxylic acid.

AI 본문요약
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문제 정의

그러나 macrolides, aminoglycosides, polyenes 및 quinone-type 계열의 항생물질 등은 생산하지 않는 특징을 가지고 있다[9]. 본 연구에서는 Pseudomonas 속을 대상으로 항생물질 생산균주를 탐색하여 그 중 MRSA에 항균활성을 가지고 있는 분리균주에서의 활성물질의 생산조건을 확립하였으며, 나아가 항균 활성물질의 분리 및 정제를 통하여 그 구조 및 효능을 확인하여 보고하고자 한다.

제안 방법

가장 활성이 뛰어난 EA 추출물을 recycling prep LC를 이용하여 Fr. 1-6까지 6개의 분획물로 나누었으며, 그람양성 세균 2종(B. cereus, L. monocytogenes)과 항생제내성균주 4종(S. aureus CCARM 3089, S. aureus CCARM 3090, S. aureus CCARM 3091, S. aureus CCARM 3095)에 대한 MIC를 조사하였다. 그 결과 Fr.
Multi column (Jaigel-GS 310, 21.5×500 mm, JAI, Japan)을 이용하여 methanol로 전개 하였으며, 245 nm (LC-310, JAI)에서 검출하였다.
각 추출물은 S. aureus와 Escherichia coli에 대해 1차 항균력을 조사하였으며, 활성분획은 재분획한 뒤, preparative thin layer chromatography (prep TLC, 20×20 cm, 0.2 mm, silica gel 60 F254, Merck, USA)를 사용하여 DCM, EA 및 methanol의 전개비율 (5:1:0.3-1:1:0.1)을 조절하여 정제하였다.
각각의 배양액을 24시간 간격으로 회수하여 0.22 μm filter로 여과하고 70℃에 서 10분간 열처리하여 효소활성을 제거한 후 항균활성 시료로 사용하였다.
보다 자세한 동정을 위해 27F (5'-AGAG TTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3') primer를 사용하여 16S 리보좀 DNA를 PCR로 증폭하여 염기서열을 결정하였고, National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA) BLAST 프로그램으로 비교 분석하였다. 또한 bioedit (USA), clustal X 2.0 (CLC bio, Denmark), mega 4를 사용하여 상동성을 분석한 후 최종적으로 neighbor joining method를 기반으로 계통수를 작성 하였다[15].
생리활성물질을 안정적으로 생산할 수 있는 배양조건을 확립하기 위해 다양한 배지(Nutrient Broth (NB), Luria-Bertani (LB), Brain heart infusion broth (BHI) 그리고 King's medium B(KMB)), 배양기간(14일), pH (6-9) 및 온도(28, 30, 35 및 37 ℃)의 조건하에서 최적조건을 검토하였다.
성분 분석과 질량분석은 gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS, HP 6890&5973, Agilent, USA)를 이용하였으며, 활성물질에 대한 항균활성은 최종적으로 MIC를 측정함으로써 확인하였다.
용매추출물에 대한 1차 항균활성을 조사하고 활성물질 분리를 위하여 preparative liquid chromatography (prep LC: LC 9104; JAI, Japan)를 사용하였다.
5 macfarland의 농도로 맞추어 최적배지에 100 μl 도말 한 후 그 위에 항균 활성 균주를 접종한 paper disc 또는 항균물질(10 mg/ml)을 희석한 시료를 10 μl 접종한 paper disc를 얹었다. 이후 최적조건에서 배양 후 증식여부를 확인함으로써 측정하였다.
활성물질 추출은 최적 배양조건에서 배양하여 원 심분리(8,000× g, 10분, 4℃)후, 배양상등액을 n-hexane (HX), dichloromethan (DCM) 및 ethyl acetate (EA)를 이용하여 순차적으로 용매분획하였다.

대상 데이터

aureus CCARM 3095)를 사용하였다. 각 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC), 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC), 서울대학교 미생물연구소(Institute of Microbiology Seoul National University, IMSNU) 및 서울여자대학교 항생제 내성균주은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes , CCARM)에서 분양받아 사용하였다.
강원도 청옥산 일대에서 채취한 토양 1 g을 9 ml의 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2)으로 희석한 후 희석액 200 μl를 nutrient agar (NA) 배지에 도말하였고 28℃에서 24-36 시간 동안 배양하였다.
병원성 세균에 대한 항균활성 측정을 위한 테스트 균주로 각각 4종의 그람양성 세균(Bacillus cereus KCTC 3624, Clavibacter michiganensis KACC 20122, Listeria monocytogenes KACC 10764 그리고 Micrococcus luteus KACC 10488)과 그람 음성 세균(E. coli IMSNU 10080, Proteus vulgaris IMSNU 13025, Shigella sonnei KCTC 2518 및 Salmonella typhimiurium KCTC 1926) 및 항생제내성균주(S. aureus CCARM 3089, S. aureus CCARM 3090, S. aureus CCARM 3091 및 S. aureus CCARM 3095)를 사용하였다. 각 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC), 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC), 서울대학교 미생물연구소(Institute of Microbiology Seoul National University, IMSNU) 및 서울여자대학교 항생제 내성균주은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes , CCARM)에서 분양받아 사용하였다.
2)으로 희석한 후 희석액 200 μl를 nutrient agar (NA) 배지에 도말하였고 28℃에서 24-36 시간 동안 배양하였다. 순수분리 후, 병원성 세균에 대한 항균력을 측정하여 활성이 우수한 균주를 최종 선별하여 본 실험에 사용하였다. 보다 자세한 동정을 위해 27F (5'-AGAG TTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3') primer를 사용하여 16S 리보좀 DNA를 PCR로 증폭하여 염기서열을 결정하였고, National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA) BLAST 프로그램으로 비교 분석하였다.
정제된 phenazine-1-carboxylic acid (Fr. 5-2)는 MRSA 3089와 3090균주에 대해 MIC 값이 각각 25와 50 μg/ml로 조사되었다(Table 3).

데이터처리

보다 자세한 동정을 위해 27F (5'-AGAG TTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3') primer를 사용하여 16S 리보좀 DNA를 PCR로 증폭하여 염기서열을 결정하였고, National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA) BLAST 프로그램으로 비교 분석하였다.

이론/모형

항균효능과 최소저해농도(minimal inhibitory concentration, MIC)는 paper disc 법으로 측정하였다[17]. 테스트 균주를 0.

성능/효과

청옥산 토양시료에서 다수의 각종 미생물을 분리하여 그 중에서 항균력이 좋은 한 균주를 선별하여 균주의 특성을 조사한 결과 균주는 그람음성 간균으로 청녹색, 노란색 그리고 갈색 색소를 생성하는 특성을 가지고 있었다. 16S 리보좀 DNA 염기서열 분석 후 type strain과 상동성을 비교해 본 결과, Pseudomonas aeruginosa와 99%의 상동성을 가지는 것으로 확인되었으며, 계통적으로 Pseudomonas aeruginosa임이 확인되었다(Fig. 1). 또한 생리생화학적 특성 조사에서도 Pseudomonas aeruginosa에 속함이 확인되었다(unpublished data).
그리고 HX, EA 및 DCM 추출물은 100 μg/disc의 농도에서 항균력을 측정한 결과, EA와 DCM 추출물은 그람양성 세균과 MRSA 균주에 대해 넓은 항균 스펙트럼을 보였으며, 특히 EA 추출물의 활성이 뛰어난 것으로 조사되었다. HX 추출물은 항균활성이 없었으며, 그람 음성 세균에 대한 활성도 대체로 낮은 것으로 확인되었다 (Table 2).
P. aeruginosa BCNU 1204 균주의 항균활성은 KMB 배지에서 pH 7.0, 35℃에서 4일간 배양했을 때 가장 높았으며, 5일부터 감소하는 것으로 나타났으며, 배양기간 중 pH는 7.0-6.0 내에서 변동을 보였다(Fig. 2). 그리고 HX, EA 및 DCM 추출물은 100 μg/disc의 농도에서 항균력을 측정한 결과, EA와 DCM 추출물은 그람양성 세균과 MRSA 균주에 대해 넓은 항균 스펙트럼을 보였으며, 특히 EA 추출물의 활성이 뛰어난 것으로 조사되었다.
그람양성 세균 4종, 그람음성 세균 4종 및 MRSA 균주 4종을 대상으로 P. aeruginosa BCNU 1204 균주의 항균 활성을 조사한 결과, 그람음성 세균에 대하여도 항균활성을 나타내었으나, 그람양성 세균 B. cereus, C. michiganensis, L. monocytogenes 그리고 M. luteus에 대하여 저해환이 각각 20 mm, 14 mm, 18 mm 및 21 mm으로 항균활성이 보다 높았다. 또한 MRSA 세균인 S.
또한 생리생화학적 특성 조사에서도 Pseudomonas aeruginosa에 속함이 확인되었다(unpublished data). 그러므로 최종적으로 Pseudomonas aeruginosa BCNU 1204로 명명하였다.
그리고 HX, EA 및 DCM 추출물은 100 μg/disc의 농도에서 항균력을 측정한 결과, EA와 DCM 추출물은 그람양성 세균과 MRSA 균주에 대해 넓은 항균 스펙트럼을 보였으며, 특히 EA 추출물의 활성이 뛰어난 것으로 조사되었다.
luteus에 대하여 저해환이 각각 20 mm, 14 mm, 18 mm 및 21 mm으로 항균활성이 보다 높았다. 또한 MRSA 세균인 S. aureus CCARM 3089, CCARM 3090, CCARM 3091 및 CCARM 3095 균주에 대하여 저해환이 각각 15 mm, 11 mm, 22 mm 그리고 12 mm으로 조사되었다(Table 1).
1). 또한 생리생화학적 특성 조사에서도 Pseudomonas aeruginosa에 속함이 확인되었다(unpublished data). 그러므로 최종적으로 Pseudomonas aeruginosa BCNU 1204로 명명하였다.
청옥산 토양시료에서 다수의 각종 미생물을 분리하여 그 중에서 항균력이 좋은 한 균주를 선별하여 균주의 특성을 조사한 결과 균주는 그람음성 간균으로 청녹색, 노란색 그리고 갈색 색소를 생성하는 특성을 가지고 있었다. 16S 리보좀 DNA 염기서열 분석 후 type strain과 상동성을 비교해 본 결과, Pseudomonas aeruginosa와 99%의 상동성을 가지는 것으로 확인되었으며, 계통적으로 Pseudomonas aeruginosa임이 확인되었다(Fig.

후속연구

Phenazine 계열 물질들의 항균력과 항균 스펙트럼은 잘 보고되어 있으며, phenazine-1-carboxylic acid의 Fusarium 등의 식물병원균에 대한 biocontrol 인자로써의 중요성은 보고되고 있으나[18], phenazine-1-carboxylic acid의 항생제 내성균주에 대한 항균효과는 보고된 바가 없어 본 연구는 학문적으로 의의가 있다고 판단된다. P. aeruginosa BCNU 1204 균주의 EA 추출물은 그람양성 세균과 특히 항생제내성 균주에 넓은 항균스펙트럼을 가지고 있으며, 추후 유효 물질의 보다 정확한 구조 규명 나아가 기능과 구조 상관관계에 대한 검토가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
aureus (VRSA)도 이들 MRSA에서 다수 있는 것으로 조사되어 감염병 치료에 있어서 심각한 문제로 대두되고 있다[7]. 현재 항생제 내성 균주에 대한 감염병 치료와 관리를 위해 새로운 항생물질의 탐색과 상용화가 절실히 요구되고 있으나 미생물 기원의 항생물질에 대한 연구는 많이 위축되어 있으며, 주로 방선균을 대상으로 항생물질의 탐색연구가 이루어지고 있어 보다 다양한 세균 및 균류를 대상으로 한 항생물질 연구가 필요하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Pseudomonas 속에서 광범위하게 연구되고 있는 종은 무엇이 있는가?	Pseudomonas 속에 속하는 균종들은 인체병원성이 있거나 다양한 물질 분해능이 있거나 식물병원균에 대한 biocontrol을 한다고 알려져 있으나, 일부 균종은 각종 식물에 병원성도 있는 것으로 알려져 있다. Pseudomonas 속에서 광범위하게 연구되고 있는 종으로는 P. aeruginosa, P. fluorecens, P. putida, P. chlororaphis 그리고 식물 병원성균인 P. cichorii와 P. syringae가 있다[9]. 한편 Pseudomonas 속에 속하는 균종들은 작물보호 물질, 색소화합물 및 항생물질 등 다양한 2차 대사산물들을 생산하는 것으로 보고되어 있으며[9, 11], Pseudomonas sp.
	Pseudomonas 속 세균은 어디에 이용되는 미생물인가?	Pseudomonas 속 세균은 석탄과 오일 연료의 주성분인 phenanthrene을 비롯한 다가방향족화합물을 분해할 수 있는 능력을 가지고 있으므로 생물정화에 사용되는 환경미생물이며 [4], 유해물질의 분해 및 무기질화 능력 외에도 다양한 대사능력을 가지고 있어, 식물성장을 촉진하며 식물에 있어서의 질병저항성을 높여주기도 한다[8]. Pseudomonas 속에 속하는 균종들은 인체병원성이 있거나 다양한 물질 분해능이 있거나 식물병원균에 대한 biocontrol을 한다고 알려져 있으나, 일부 균종은 각종 식물에 병원성도 있는 것으로 알려져 있다.
	메티실린 내성 황색포도알균은 어떤 물질에 내성을 가지는가?	특히 국내 분리 황색 포도알균(Staphylococcus aureus)의 약 70%가 메티실린 내성 황색포도알균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)로 밝혀져 있으며 MRSA 는 병원 감염의 주요 원인균으로 조사되어 있고 MRSA 감염과 원내 전파 경로인 비강에서의 정착을 막기 위해 사용하는 뮤피로신에 대해서도 내성을 나타내어 원내감염의 차단에 어려움이 많다[10]. MRSA는 ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, gentamicin 및 tetracycline 등에 내성을 가지는 다약제 내성균 (multidrug resistant bacteria)으로 특히, MRSA 치 료의 마지막 보루인 vancomycin에도 내성을 보이는 vancomycin-resistant S. aureus (VRSA)도 이들 MRSA에서 다수 있는 것으로 조사되어 감염병 치료에 있어서 심각한 문제로 대두되고 있다[7]. 현재 항생제 내성 균주에 대한 감염병 치료와 관리를 위해 새로운 항생물질의 탐색과 상용화가 절실히 요구되고 있으나 미생물 기원의 항생물질에 대한 연구는 많이 위축되어 있으며, 주로 방선균을 대상으로 항생물질의 탐색연구가 이루어지고 있어 보다 다양한 세균 및 균류를 대상으로 한 항생물질 연구가 필요하다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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