[논문]지방질다당류로 자극한 RAW 264.7 세포에서 청도반시 땡감 에틸 아세테이트 분획물의 항염증 효과

박예빈; 정하람; 이승환; 김태완; 김대옥

doi:10.9721/kjfst.2019.51.1.90

지방질다당류로 자극한 RAW 264.7 세포에서 청도반시 땡감 에틸 아세테이트 분획물의 항염증 효과
Anti-inflammatory effects of ethyl acetate fraction of unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo-Bansi) on lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.51 no.1, 2019년, pp.90 - 96

박예빈 (경희대학교 식품생명공학과) , 정하람 (경희대학교 식품생명공학과) , 이승환 (안동대학교 식품생명공학과) , 김태완 (안동대학교 식품생명공학과) , 김대옥 (경희대학교 식품생명공학과)

초록
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본 연구에서는 적과한 청도반시 땡감을 40% (v/v) 에탄올-물 혼합 용액으로 추출하고, 이 추출물을 액체-액체 추출법으로 5개 분획물(노말-헥세인, 클로로폼, 에틸 아세테이트, 노말-뷰탄올, 물)을 얻었다. 5개 분획물 중에서 에틸 아세테이트 분획물이 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 산화방지능이 가장 높았다. 에틸 아세테이트 분획물은 지방질다당류로 자극한 RAW 264.7 세포에서 산화 질소, IL-6, 산화 스트레스를 감소시켰다. UPLC-ESI-MS/MS를 이용하여 땡감 에틸 아세테이트 분획물에서 페놀 화합물로 갈산, 프로토카테츄산, 4-하이드록시벤조산, 쿼서틴-3-O-글루코사이드, 파라-쿠마르산, 쿼서틴을 동정하였다. 본 연구를 통해서 적과 과정에서 부산물로 버려지는 청도반시 땡감이 산화방지능 및 항염증 효과를 보유한 기능성 소재로서 활용될 가능성을 제시하였다. 그러나 향후 적과한 청도반시 땡감의 산화방지능에 기반한 항염증 효과를 좀 더 명확하게 밝히기 위해서는 청도반시 땡감에 존재하는 개별 생리활성물질의 정량 분석 및 항염증에 대한 분자생물학적 메커니즘을 규명할 필요가 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo-Bansi) is a by-product produced when thinning out the superfluous fruit of persimmon. We investigated whether unripe astringent persimmon has antioxidative and anti-inflammatory effects. Unripe astringent persimmon extract was fractionated sequentially in n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, and water. The ethyl acetate fraction had the highest total phenolic content, total flavonoid content, and antioxidant capacity compared to those of the other fractions. Pretreatment of lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages with the ethyl acetate fraction reduced nitric oxide, interleukin-6, and intracellular oxidative stress in a dose-dependent manner. Ultra-high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry analysis revealed gallic acid, protocatechuic acid, 4-hydroxybenzoic acid, quercetin-3-O-glucoside, quercetin, and p-coumaric acid as the phenolic compounds of the ethyl acetate fraction. Collectively, these findings suggest that unripe astringent persimmon is a source of functional materials that can promote antioxidative and anti-inflammatory effects.

주제어

표/그림 (6)

$Fig. 1. Inhibitory effects of the ethyl acetate fraction from unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo- Bansi) on nitrite production in lipopolysaccharide (LPS)- stimulated RAW 264.7 cells.$ 그림 Fig. 1. Inhibitory effects of the ethyl acetate fraction from unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo- Bansi) on nitrite production in lipopolysaccharide (LPS)- stimulated RAW 264.7 cells.
$Table 1. Total phenolic and flavonoid contents, and antioxidant capacities of five fractions of unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo-Bansi)$ 표 Table 1. Total phenolic and flavonoid contents, and antioxidant capacities of five fractions of unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo-Bansi)
$Fig. 2. Inhibitory effects of the ethyl acetate fraction from unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo- Bansi) on inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6) production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells.$ 그림 Fig. 2. Inhibitory effects of the ethyl acetate fraction from unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo- Bansi) on inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6) production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells.
$Fig. 3. Effects of the ethyl acetate fraction from unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo- Bansi) on intracellular oxidative stress in RAW 264.7 cells against oxidative stress induced with AAPH using the DCFHDA assay.$ 그림 Fig. 3. Effects of the ethyl acetate fraction from unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo- Bansi) on intracellular oxidative stress in RAW 264.7 cells against oxidative stress induced with AAPH using the DCFHDA assay.
$Fig. 4. UPLC-ESI-MS/MS chromatogram of the ethyl acetate fraction from unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo-Bansi).$ 그림 Fig. 4. UPLC-ESI-MS/MS chromatogram of the ethyl acetate fraction from unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo-Bansi).
$Table 2. Identification of phenolic compounds in the ethyl acetate fraction of unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv.Cheongdo-Bansi) using UPLC-ESI-MS/MS$ 표 Table 2. Identification of phenolic compounds in the ethyl acetate fraction of unripe astringent persimmon (Diospyros kaki Thunb. cv.Cheongdo-Bansi) using UPLC-ESI-MS/MS

AI 본문요약
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문제 정의

UPLC-ESIMS/MS를 이용하여 땡감 에틸 아세테이트 분획물에서 페놀 화합물로 갈산, 프로토카테츄산, 4-하이드록시벤조산, 쿼서틴-3-O-글루코사이드, 파라-쿠마르산, 쿼서틴을 동정하였다. 본 연구를 통해서 적과 과정에서 부산물로 버려지는 청도반시 땡감이 산화방지능 및 항염증 효과를 보유한 기능성 소재로서 활용될 가능성을 제시하였다. 그러나 향후 적과한 청도반시 땡감의 산화방지능에 기반한 항염증 효과를 좀 더 명확하게 밝히기 위해서는 청도반시 땡감에 존재하는 개별 생리활성물질의 정량 분석 및 항염증에 대한 분자생물학적 메커니즘을 규명할 필요가 있다.

제안 방법

10% (v/v) FBS가 포함된 인산완충 식염수 200 μL씩 분주하여 1시간 동안 블로킹(blocking)하고 PBS-T로 세척한 후 배양 상층액을 100 μL씩 분주하였다.
10% (w/v) 염화 알루미늄 용액 150 μL를 첨가하여 1분간 추가로 반응시킨 후, 1 M 수산화 소듐 용액 1 mL를넣고 혼합하여 510 nm에서 분광광도계(SPECTRONIC 200)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
여과액은 회전식 진공농축기(N-1000; Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 항온수조 40℃에서 감압 농축하였다. 200 mL의 증류수를 가한 후, 노말-헥세인,클로로폼, 에틸 아세테이트, 노말-뷰탄올, 물(water)의 순으로 동일한 양으로 가해주어 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction)법으로 분획을 시행하여 분획물을 얻었다. 각 분획물은 회전식 진공 농축기(N-1000)로 농축한 후 −20℃에 저장하여 실험에 사용하였다.
ABTS 라디칼 용액 980 μL와 각 분획물 용액 20 μL를 혼합하고, 항온수조 37℃에서10분간 반응 후, 734 nm에서 흡광도 감소를 측정하였다.
DPPH 라디칼을 이용한 산화방지능은 Brand-Williams 등(1995)의 방법을 변형하여 측정하였다. 200 mL 80% (v/v) 메탄올-물 혼합 용액을 사용하여 1.
MTT 시약 100 μL을 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후, DMSO를 50 μL씩 분주하여 보라색의 포마잔(formazan)을 용해시켰으며, 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200; Tecan Austria GmbH, Grödig, Austria)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
청도반시 땡감에서 얻어진 에틸 아세테이트 분획물에 존재하는 페놀 화합물을 분석하고자 UPLC-ESI-MS/MS를 이용하였다. UPLC-ESI-MS/MS 분석을 통해 땡감 에틸 아세테이트 분획물에서 갈산, 프로토카테츄산, 4-하이드록시벤조산, 쿼서틴-3-O-글루코사이드(quercetin-3-O-glucoside), 파라-쿠마르산, 쿼서틴을 확인하였다(Fig. 4, Table 2).
7 세포에서 산화 질소, IL-6, 산화 스트레스를 감소시켰다. UPLC-ESIMS/MS를 이용하여 땡감 에틸 아세테이트 분획물에서 페놀 화합물로 갈산, 프로토카테츄산, 4-하이드록시벤조산, 쿼서틴-3-O-글루코사이드, 파라-쿠마르산, 쿼서틴을 동정하였다. 본 연구를 통해서 적과 과정에서 부산물로 버려지는 청도반시 땡감이 산화방지능 및 항염증 효과를 보유한 기능성 소재로서 활용될 가능성을 제시하였다.
MTT 시약 100 μL을 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후, DMSO를 50 μL씩 분주하여 보라색의 포마잔(formazan)을 용해시켰으며, 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200; Tecan Austria GmbH, Grödig, Austria)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(control)의 세포 생존율 대비 90% 이상의 생존율을 보인 땡감 에틸 아세테이트 분획물의 최대무독성 농도 이하에서 세포 실험을 수행하였다.
하지만 적과 과정에서 발생되어 버려지는 땡감에 대한 연구는 미미하다. 따라서 본 연구는 각종 유기용매를 이용하여 적과한 청도반시 땡감(unripe Diospyros kaki Thunb. cv. Cheongdo-Bansi)의분획물을 확보한 후, 가장 높은 산화방지능을 갖는 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 분획물을 이용하여 지방질다당류(lipopolysaccharide; LPS)로 자극한 RAW 264.7 세포에서 항염증 효과를 평가하였다. 에틸 아세테이트 분획물에 존재하는 페놀 화합물은 ultra-high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS)를 이용하여 분석하였다.
땡감 에틸 아세테이트 분획물에 존재하는 페놀 화합물을 UPLCESI-MS/MS (ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro IVDSystem; Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 분리는 C₁₈ 역상 컬럼(Polar C18 Luna Omega, 150×2.
땡감 에틸 아세테이트 분획물의 RAW 264.7 대식세포에 대한 독성은 Heo 등(2001)의 MTT법을 변형하여 측정하였다. 땡감 에틸 아세테이트 분획물의 세포 독성 평가를 위해 96-well plate에 RAW 264.
땡감 에틸 아세테이트 분획물의 세포 독성 평가를 위해 96-well plate에 RAW 264.7 세포를 5.0×103 cells/well로 분주하여 24시간 배양하였으며, 배지 제거 후, 땡감 에틸 아세테이트 분획물이 포함된 배지를 10, 20, 50, 100 μg/mL의 농도로 100 μL씩 분주하여 다시 24시간 동안 배양하였다.
배지 제거 후, 땡감 에틸 아세테이트 분획물을 전처리 하여 24시간 동안 추가로 배양한 뒤, 50 μM DCFH-DA가 포함된HBSS를 100 μL씩 분주하여 1시간 동안 처리하였다.
본 연구에서는 적과한 청도반시 땡감을 40% (v/v) 에탄올-물 혼합 용액으로 추출하고, 이 추출물을 액체-액체 추출법으로 5개분획물(노말-헥세인, 클로로폼, 에틸 아세테이트, 노말-뷰탄올, 물)을 얻었다. 5개 분획물 중에서 에틸 아세테이트 분획물이 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 산화방지능이 가장 높았다.
상온에서 30분 동안 암반응시킨 후, 2 N 황산 50 μL씩 분주하여 반응을 종결시켰으며, 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
10% (w/v) 염화 알루미늄 용액 150 μL를 첨가하여 1분간 추가로 반응시킨 후, 1 M 수산화 소듐 용액 1 mL를넣고 혼합하여 510 nm에서 분광광도계(SPECTRONIC 200)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 플라보노이드 함량은 카테킨을 이용하여 표준 곡선으로 정량하였으며, mg 카테킨 당량(catechin equivalents)/100 g 분획물로 나타내었다.
7 세포에서 항염증 효과를 평가하였다. 에틸 아세테이트 분획물에 존재하는 페놀 화합물은 ultra-high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS)를 이용하여 분석하였다.
ESI의 조건은 음이온 모드(negative ion mode)를, 커튼 가스(curtain gas)는 질소 가스를, 건조 가스(dry gas)는 350℃로 가열된 질소 가스를 사용하였다. 이동상 용매 A와 B를 98% A/2% B에서 시작하여 5분 98% A/2% B, 20분 10% A/90% B, 23분 10% A/90% B, 26분 98% A/2% B, 30분 98% A/2% B와 같은 조건으로 흘리며 사용하였다.
이동상 용매는 0.1% (v/v) 폼산이 포함된 증류수(A)와 0.1% (v/v) 폼산이 포함된 아세토나이트릴(B)을 이용하였으며, 2 μL의 시료를 주입하여 이동상 용매 조건에 따라 0.2 mL/min의 유속으로 흘려주었으며, 컬럼 오븐의 온도는 25℃로 설정하였다.
적과 땡감의 에틸 아세테이트 분획물이 RAW 264.7 대식세포에 미치는 독성을 확인하기 위해 여러 농도(10, 20, 50, 100 μg/mL) 분획물을 처리한 후, MTT법을 이용해 세포 독성을 평가하였다.
48-well plate에 포함된 배지 상층액들은 96-well plate에 50 μL씩 옮긴 후 50 μL 그리스 시약을 처리하여 23℃ 암실에서 15분간 반응시켰으며, 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 지방질다당류로 자극한 RAW 264.7 대식세포에서 발생된 배지 내 아질산염 농도를 확인하기 위해 아질산 소듐의 표준 곡선을 이용하여 정량하였다.
청도반시 땡감에서 얻어진 에틸 아세테이트 분획물에 존재하는 페놀 화합물을 분석하고자 UPLC-ESI-MS/MS를 이용하였다. UPLC-ESI-MS/MS 분석을 통해 땡감 에틸 아세테이트 분획물에서 갈산, 프로토카테츄산, 4-하이드록시벤조산, 쿼서틴-3-O-글루코사이드(quercetin-3-O-glucoside), 파라-쿠마르산, 쿼서틴을 확인하였다(Fig.

대상 데이터

2 mL/min의 유속으로 흘려주었으며, 컬럼 오븐의 온도는 25℃로 설정하였다. ESI의 조건은 음이온 모드(negative ion mode)를, 커튼 가스(curtain gas)는 질소 가스를, 건조 가스(dry gas)는 350℃로 가열된 질소 가스를 사용하였다. 이동상 용매 A와 B를 98% A/2% B에서 시작하여 5분 98% A/2% B, 20분 10% A/90% B, 23분 10% A/90% B, 26분 98% A/2% B, 30분 98% A/2% B와 같은 조건으로 흘리며 사용하였다.
Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS), 둘베코의 인산완충 식염수(Dulbecco’s phosphate bufferedsaline; DPBS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM),페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)은 Welgene Inc. (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다.
본 실험에 사용한 RAW 264.7 세포는 설치류 유래 대식세포주로 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양을 위해서 10% (v/v) 열 불활성 FBS, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였다.
본 연구에 사용된 청도반시 땡감은 경북 청도군에서 2017년도 8월말에 적과하여 실험재료로 사용하였다. 동결 건조한 후 분쇄기(FM-909W; Hanil Electric, Seoul, Korea)를 이용하여 분쇄하여−20℃에서 보관하였다.
분리는 C18 역상 컬럼(Polar C18 Luna Omega, 150×2.1 mm, 2.7μm; Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 이용하였다.
세포 배양을 위해서 10% (v/v) 열 불활성 FBS, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였다.
에탄올(ethyl alcohol, 95%), 노말-헥세인(nhexane, 95%), 클로로폼(chloroform, 99.5%), 에틸 아세테이트(99%), 노말-뷰탄올(n-butanol, 99%), 아세토나이트릴(acetonitrile,HPLC grade), 수산화 소듐(sodium hydroxide)은 Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Siheung, Korea)로부터 구입하였다.
인터류킨-6(interleukin-6; IL-6) 효소 결합 면역 흡착 검사(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 키트, 3,3',5,5'-테트라메틸벤자이딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine; TMB)은 BD Biosciences (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
(Siheung, Korea)로부터 구입하였다. 탄산 소듐(sodium carbonate)은 Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd. (Kyoto, Japan)에서 구입하였다. Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS), 둘베코의 인산완충 식염수(Dulbecco’s phosphate bufferedsaline; DPBS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM),페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)은 Welgene Inc.
Louis, MO,USA)에서 구입하였다. 트윈 20(polyoxyethylene sorbitan monolaurate; Tween 20)은 Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA,USA)에서 구입하였다. 에탄올(ethyl alcohol, 95%), 노말-헥세인(nhexane, 95%), 클로로폼(chloroform, 99.

데이터처리

4)Mean with different superscripts in the same column indicate significant difference by Duncan’s multiple range test (p<0.05).
각 평균값의 차이를 검증하기 위하여 일원 배치분산분석(one-way analysis of variance)을 실시하였고, p<0.05유의수준에서 던컨다중검정법(Duncan’s multiple range test)으로 유의차를 검증하였다.
모든 실험은 3회 반복하여 평균±표준편차로 나타내었으며 통계 분석은 SPSS 프로그램(version 23.0; SPSS Inc., Chicago, IL,USA)을 이용하였다.

이론/모형

산화방지능은 라디칼 소거능에 기반한 ABTS법과 DPPH법을이용하여 측정하였다. ABTS법을 이용한 산화방지능은 Kim 등(2002)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 100 mL 인산완충 식염수에 1.
땡감 분획물들의 총 페놀 함량은 폴린-시오칼토 페놀 시약을 이용한 발색법(Singleton과 Rossi, 1965)으로 측정하였다. 200 μL의 각 분획물 용액에 2.
땡감 분획물들의 총 플라보노이드 함량은 변형된 Kim 등(2003)의 방법으로 측정하였다. 500 μL의 각 분획물 용액과 3.
산화 질소 측정은 그리스 시약 반응을 통해서 측정하였다. RAW 264.
산화방지능은 라디칼 소거능에 기반한 ABTS법과 DPPH법을이용하여 측정하였다. ABTS법을 이용한 산화방지능은 Kim 등(2002)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다.
세포 내 산화 스트레스 측정은 DCFH-DA를 이용한 형광 탐침법(fluorescence probe method)을 사용하였다. RAW 264.
세포 배양액 내의 IL-6의 분비량은 ELISA 키트를 사용하여 샌드위치 ELISA (sandwich ELISA) 방식으로 측정하였다. ELISA를 위한 96-well microplate에 100 μL의 포획 항체(capture antibody)를 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 정치하였다.

성능/효과

50 μg/mL의 농도로 땡감 에틸 아세테이트 분획물을 처리한 군에서는 지방질다당류만 처리한 군과 비교했을 때 약 44%까지 산화 질소 생성이 유의적(p<0.05)으로 감소하였다.
50과100 μg/mL의 농도로 땡감 에틸 아세테이트 분획물을 처리한 군에서 AAPH만을 처리군 대비하여 산화 스트레스는 각각 128%와 170% 감소하였으며, 대조군과는 유의적(p<0.05) 차이를 보이지 않았다
본 연구에서는 적과한 청도반시 땡감을 40% (v/v) 에탄올-물 혼합 용액으로 추출하고, 이 추출물을 액체-액체 추출법으로 5개분획물(노말-헥세인, 클로로폼, 에틸 아세테이트, 노말-뷰탄올, 물)을 얻었다. 5개 분획물 중에서 에틸 아세테이트 분획물이 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 산화방지능이 가장 높았다. 에틸 아세테이트 분획물은 지방질다당류로 자극한 RAW 264.
ABTS법과 DPPH법을 이용한 산화방지능은 땡감 각 분획물에서 에틸 아세테이트>노말-뷰탄올>물>클로로폼>노말-헥세인 순서로 낮아졌다.
땡감 에틸 아세테이트 분획물을 50과 100 μg/mL 농도로 처리한 군에서 지방질다당류만을 처리한 군과 비교했을 때, 각각 69%와 79% 수준까지 IL-6 생성이 유의적(p<0.05)으로 감소하였다.
7 대식세포 내 산화 스트레스의 완화에 기여했을 것으로 여겨진다. 본 연구에 사용한 땡감 에틸 아세테이트 분획물은 산화 질소 및 IL-6의 생성을 저해하여 항염증 효과를 가지는 것으로 나타났다.
Comalada 등(2006)은 지방질다당류로 자극한 BALB/c 마우스의 골수유래 대식세포(bone marrowderived macrophages)에서 핵 인자-카파 B 경로 저해와 관련이 있는 산화 질소 및 종양 괴사 인자-알파의 생성을 쿼서틴이 저해하여 항염증 작용을 한다고 보고하였다. 본 연구에서 사용한 적과 청도반시 땡감 에틸 아세테이트 분획물에 존재하는 쿼서틴과같은 페놀 화합물들은 산화방지능 및 항염증 효과에 기여하는 것으로 판단된다.
이는 감 유래 소재들의 페놀 화합물이 다른 분획물에 비해 에틸 아세테이트 분획물에 많이 존재하는 것을 의미한다. 본 연구에서 사용한 적과한 청도반시 땡감 에틸 아세테이트 분획물의 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 산화방지능은 기존에 보고된 곶감 및 떫은 감 에틸아세테이트 분획물에 비해 상대적으로 낮은 결과치를 보였다(Kim 등, 2011a; Lee 등, 2014). 이는 상이한 품종, 가공 조건, 재배지역 차이 등의 요인에서 비롯된 것으로 판단된다.
Kim 등(2011b)은 청도반시 감과 감꼭지 추출물이 IL-6의 생성을 저해한다고 보고하였다. 본 연구에서 지방질다당류에 의해 유도되는 주요 염증성 사이토카인 IL-6의 생성량이 땡감 에틸 아세테이트 분획물에 의해 저해되었으며, 땡감 에틸 아세테이트 분획물이 항염증 효과를 가지는 것을 확인하였다.
Jeong등(2018)은 감 껍질의 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 산 화방지능 역시 에틸 아세테이트 분획물에서 가장 높았다고 보고하였다. 본 연구에서도 땡감을 이용한 각 분획물 중에 에틸 아세테이트 분획물이 가장 높은 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 산화방지능을 보였다. 이는 감 유래 소재들의 페놀 화합물이 다른 분획물에 비해 에틸 아세테이트 분획물에 많이 존재하는 것을 의미한다.
에틸 아세테이트 분획물은 유의적으로(p<0.05) 가장 높은 총 페놀 함량을 보였으며, 이는 가장 낮은 함량을 나타낸 노말-헥세인 분획물보다 약 37배 높은 값이었다.
에틸 아세테이트 분획물이 유의적(p<0.05) 차이를 보이며 가장 높은 활성을 보였으며, 에틸 아세테이트 분획물의 산화방지능은 노말-헥세인 분획물보다 ABTS법에서 약 182배, DPPH법 약 159배 더 높은 수치를 보였다.
땡감 각 분획물의 총 플라보노이드 함량은 에틸 아세테이트>노말-뷰탄올>물>클로로폼>노말-헥세인 순서로 낮아졌다. 에틸아세테이트 분획물의 총 플라보노이드 함량은 가장 낮은 값을 보인 노말-헥세인 분획물보다 약 200배 높았다.
처리한 각 농도에서 에틸 아세테이트 분획물은 무처리군인대조군과 비교하여 모두 유의적(p<0.05) 차이가 없는 세포 생존율을 보여 독성이 없는 것을 확인하였다(data not shown).
총 페놀 함량은 에틸 아세테이트>노말-뷰탄올>물>클로로폼>노말-헥세인 순서로 낮아졌다.

후속연구

본 연구를 통해서 적과 과정에서 부산물로 버려지는 청도반시 땡감이 산화방지능 및 항염증 효과를 보유한 기능성 소재로서 활용될 가능성을 제시하였다. 그러나 향후 적과한 청도반시 땡감의 산화방지능에 기반한 항염증 효과를 좀 더 명확하게 밝히기 위해서는 청도반시 땡감에 존재하는 개별 생리활성물질의 정량 분석 및 항염증에 대한 분자생물학적 메커니즘을 규명할 필요가 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염증 반응이란 무엇인가?	염증 반응(inflammatory response)은 병원균에 대한 주요한 방어 기작이며, 인체 내에서 미생물, 바이러스 감염으로부터 보호하는 주요 반응이다(Azad 등, 2008). 일반적으로 염증 반응은 병리학적으로 손상된 조직 제거 또는 복구하는 역할을 하지만, 만성 염증 반응은 염증세포에서 활성 산소/질소(reactive oxygen/nitrogen species)를 과도하게 발생시켜 산화 스트레스(oxidative stress)를 유발하고, 이로 인해 단백질, 지질, DNA, RNA의 변형을 초래하며 세포 구조와 기능의 손상을 야기한다(Ryter 등, 2007).
	감의 생리활성 효능은 무엇이 있는가?	상품성을 가지는 감이 생산되기 위해서는 미숙과인 땡감의 상태에서 적과의 과정을 거치는데, 이 과정 중에 생기는 부산물은 대부분 폐기되어 땡감의 활용성이 요구되고 있는 실정이다(Shin 등, 2000). 감으로부터 각종 유기용매를 이용하여 얻은 분획물(fraction)에는 산화방지능, 항염증, 간세포 보호능이 있다고 보고 되었으며(Kim 등, 2011a; Lee 등, 2014), 감잎, 감껍질, 감꼭지 등과 같은 비가식 부분을 활용한 산화방지능, 항염증 및 신경세포 보호능에 대한 연구도 보고되고 있다(Hossain 등, 2018; Jeon 등, 2014; Jeong 등, 2018). 하지만 적과 과정에서 발생되어 버려지는 땡감에 대한 연구는 미미하다.
	감의 페놀 화합물은 무엇이 있는가?	감은 바이타민 C (vitaminC), 카로테노이드(carotenoids), 테르페노이드(terpenoids), 파이토스테롤(phytosterols), 나프토퀴논(naphthoquinones) 등과 같은 생리활성물질을 함유하고 있다(Mallavadhani 등, 1998). 감의 페놀 화합물(phenolic compounds)로는 타닌(tannins), 쿼서틴(quercetin), 캄페롤(kaempferol), 에피카테킨(epicatechin), 페룰산(ferulic acid), 갈산(gallic acid), 프로토카테츄산(protocatechuic acid), 바닐산(vanillic acid), 파라-쿠마르산(p-coumaric acid) 등이 존재하는 것으로 보고되었다(Butt 등, 2015; Jeong 등, 2018).

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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