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문제 정의
- 이번 연구의 목적은 건강추출물의 TRPV1과 TRPA1이 발현된 HEK 293T cell에서 TRPV1, TRPA1 발현에 미치는 영향을 확인하고, 신경병증성 통증이 유발된 흰쥐에서 통증반응에 대한 건강약침의 작용을 재검증함으로써 건강추출물의 진통제로서의 개발 가능성을 제시하고자 하는 것이다.
- 이에 저자는 건강약침이 TRPV1과 TRPA1 조절 작용을 통한 신경병증성 통증에 미치는 영향을 연구하고자, in vitro 실험에서 건강추출물의 TRPV1, TRPA1 발현에 미치는 영향을 확인하고, in vivo 실험에서 신경병증성 통증이 유발된 흰쥐의 환도(GB30) 및 족삼리(ST36)에 건강약침을 시술한 후, 이질통과 통각과민에 의한 회피반응 및 뇌 중심 회백질에서 c-fos 발현, 후근신경절(Dorsal Root Ganglion, DRG)에서 TRPV1 및 TRPA1 발현 변화를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1) 건강 추출물 및 약침 제조: 건강추출물은 한국산 건강(Zingiberis Rhizoma) 200 g을 물로 95℃에서 3시간 추출하였으며, 3겹 거어즈 및 와트만 거름종이(Whatman No. 1)로 거른 후 회전식 감압농축기를 이용하여 농축하였다.
- 2) TRPV1, TRPA1의 발현 및 약물처리: Human embryonic kidney(HEK) 293T cells(American Type Culture Collection, Manassas, VA, 미국)에 TRPV1 발현을 위해서 HEK293T 세포는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM을 기본 배양액으로 하여 37℃, 5% CO2 세포 배양기를 이용하여 배양하였다.
- 3) 신경병증성 통증 동물모델제작(spared nerve injury(SNI) model): 흰쥐를 isoflurane 2.5%로 도입, 전신마취 후 우측 고관절 후측의 피부를 면도하고 절개한 후 biceps femoris muscle 사이의 sciatic nerve을 찾아 tibial nerve와 common peroneal nerve 및 sural nerve를 확인한 후 microforcep으로 주변조직 및 혈관으로부터 분리시켰다.
- 4) 군 분리: 모두 30마리의 흰쥐는 정상군(Nor, n=5), SNI 모델 방식으로 신경병증성 통증을 유발시킨 후 처치를 하지 않은 대조군(Con, n=5), 시술측 환도(GB30), 족삼리(ST36)에 건강약침을 농도별로 2 mg/kg을 시행한 건강약침A군(ZP-A, n=5), 10 mg/kg을 시행한 건강약침B군(ZP-B, n=5), 20 mg/kg을 시행한 건강약침C군(ZP-C, n=5), Tramadol 0.45 mg/kg을 주입한 Tramadol 시술군(Tra, n=5), 으로 나누었다.
- 6) Von frey filament와 radiant heat 및 Acetone 자극으로 유발된 이질통 측정: 기계적 이질통(Mechanical allodynia)는 Von frey filament를, 열 통각 과민반응(Thermal hyperalgesia)은 radiant heat를, 냉 이질통(Cold allodynia)은 Acetone을 이용하여, 신경병증성 통증 모델 제작 전 자극에 대한 회피반응(withdrawal response)을 측정한 후 수술하였으며, 수술 후 3일째부터 4일마다 1회씩 19일째까지 총 5회 회피반응을 관찰하였다.
- TBST로 3회 세척한 후 HRP-conjugated secondary antibody용액에 상온에서 3시간동안 incubation 한 후 Chemi Doc을 이용하여 X-ray 감광시켜 단백질 밴드의 발현도를 확인하였다.
- TRPV1을 처리한 세포에 건강추출물(0.1, 0.5 mg/ml)과 TRPV1 agonist인 capsaicin 10 μM을 각각 처리하고, TRPA1을 처리한 세포에 건강추출물(0.1, 0.5 mg/ml)과 TRPA1 agonist인 AITC 10μM을 각각 처리한 후 24시간 동안 배양시켰다.
- Von Frey filaments가 약간 구부러질 정도로 각 뒷발바닥에 총 5회 자극(2초에 1회의 빈도)에서 3회 이상 회피반응이 나오는 경우 양성 반응으로 간주하였다.
- ① 기계적 이질통 검사는 Von frey filament(Touch test 4.93, north coast medical Inc, 영국)를 이용하여 발바닥에 물리적인 자극을 가한 뒤 발바닥에서 유발된 회피반응 역치를 측정하였다.
- ③ 냉 이질통 검사는 시술 측 발 내측 부위에 5분 간격으로 Acetone을 2 ml씩 3회 자극하였으며, 바닥에서 발을 들거나 핥는 회피반응을 양성 반응으로 간주하였다.
- 각 밴드는 Image J program(NIH, USA)을 이용하여 density를 측정하여 β-actin 발현에 대한 상대적 비율로 계산하여 3회 반복실험에 대한 결과를 그래프(Histogram)로 나타내었다.
- 각 밴드는 Image J-program을 이용하여 density를 측정하고 β-actin발현에 대한 비율로 계산하여 결과를 Graph Pad Prism을 이용하여 Histogram과 mean±SD로 나타내었다.
- 건강약침은 건조된 건강추출물을 소분하여 생리식염수로 희석하였으며, pH meter(ORION, U.S.A)로 각각 pH 7 산도를 조절하여 약침액으로 조제한 후 냉장 보관하였다가 시술에 사용하였다.
- 건강약침의 신경병증성 통증을 유발한 흰쥐의 TRPV1과 TRPA1 단백 수준에 미치는 영향을 확인하기 위해 수술측(우측) L5 DRG의 TRPV1과 TRPA1에 대한 Western blot 분석을 실시하였다.
- 본 실험에서는 양성 대조약물군으로 tramadol(0.45 mg/kg)을 시술한 Tramadol군을 추가로 관찰하였다.
- 실험기간동안 일정량의 고형사료(200 g)와 정수된 물(500ml)을 섭취시켰으며, 명암은 12시간(Day light 08:00∼20:00) 주기로, 23±2℃의 실내온도와 50±10%의 습도를 유지하여 실험종료까지 일정한 사육조건을 유지시켰다.
- 약 15분 정도의 시간이 경과 후, 쥐의 순응 여부를 확인하고 철망 격자 사이로 정량화된 Von Frey filament로 발바닥을 자극하였다.
- 약물 처리를 위하여 HEK293T 세포를 4.0×105/well의 농도로 6-well cell culture plate에 분주하여 24시간 배양한 후, Bacterial colony에서 증폭해낸 TRPV1, TRPA1 complementary DNA를 lipofectamine 2000 transfection reagent(Invitrogen, 미국)와 배합하여 4 ug/ml의 농도로 24시간 동안 배양하였다.
- 약침 시술은 insulin syringe(31 G×8 mm, BD, U.S.A)를 사용하여 신경병증성 통증 유발 3일 후부터 19일째까지 매일 1회씩 총 17회를 환도(GB30)와 족삼리(ST36)에 각각 0.05 ml의 약침을 5 mm 깊이로 자입하여 시행되었다.
- 이를 다시 TBST buffer로 3회 세척한 후 ChemiDocTMMP imaging system을 이용하여 밴드 유무를 관찰하였다.
- 절개된 부위는 kanamycin을 점적하고 피부를 봉합하였다.
- 척수 후각뿐만 아니라 뇌 중심 회백질, 치상핵, 뇌실강주위시상핵 등 많은 뇌부위에서도 내장 유해 자극 또는 포르말린 근육주사로 인한 통증에서 c-fos가 유의성 있게 증가됨이 알려져 있어33), 이번 연구에서 뇌 중심 회백질 부위에서의 c-fos 발현을 비교 관찰하였다.
- 측정 시에 약 15분 정도의 쥐의 순응 시간 뒤에, 5분 간격으로 총 3회 측정하여 회피반응 지연시간의 평균을 구하였으며, 손상을 방지하기 위하여 최대 노출 시간을 30초 이내로 하였다.
- 회피반응 시 바닥에서 발을 들거나 핥고 있는 시간을 측정하였으며, 3회의 회피반응 시간의 평균치를 얻어 표시하였다.
대상 데이터
- 1) 약재: 본 실험에 사용된 건강은 광명당제약(울산, 한국)으로부터 표준약재를 구입하여 추출물 제조에 사용하였다.
- 3) 실험동물: 본 실험에 사용한 실험동물은 6주령 Sprague-Dawley(SD)계 수컷 Rat(170∼190 g)을 (주)코아텍(경기도, 한국)으로부터 공급받아 1주일 동안 순화시킨 후 동물모델 제작에 사용하였다.
데이터처리
- **p＜0.01, ***p＜0.001 compared with control group(one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison test).
- *p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001 compared with control group(two-way ANOVA with Bonferroni post hoc multiple comparison test).
- 8) 통계학적 검정: 모든 실험결과는 최소 3회 반복실험에 대한 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 통계학적 유의성은 GraphPad Prism 5.0 분석프로그램(GraphPad Software, CA, USA)을 이용하여 two-way ANOVA(Bonferroni post hoc multiple comparison test) and one-way ANOVA(Tukey’s test)를 이용하여 검정하여 p값이 0.05 이하인 경우를 유의성 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- (2) Dorsal Root Ganglia(DRG): 실험 종료 후 모든 실험동물을 희생시키고 시술 측(우측) 척수후근신경절(dorsal root ganglia, DRG)을 적출하여 말초조직의 온도감수성일시적전위통로(transient receptor protein, TRP)인 TRPV1과 TRPA1의 발현 변화를 확인하기 위해 Western blotting analysis를 하였다.
- ② 열 통각 과민반응 검사는 Hargraves’ test IITC analgesiometer(IITC Life Sciences, Woodland Hills, CA, USA)를 사용하여 시술 측 발바닥 부위에 radiant heat을 노출시킨 후 회피반응 지연시간을 측정하여 이를 회피반응으로 하였다.
- 단백질의 양을 측정하고, 총 20 μg 단백질을 SDS-PAGE 방법으로 분리한 후 nitrocellulose membrane에 transfer하였다.
- 본 실험에서는 신경손상의 정도와 증상발현을 비교적 일정하게 할 수 있는 장점이 있는 SNI 모델을 이용하여 실험하였다27).
성능/효과
- (2) TRPA1을 발현시킨 HEK 293T cell에 ZRE(0.1 mg/ml), ZRE(0.5 mg/ml), AITC(10 μM)을 각각 처리한 후 24시간 배양 뒤에 Western blot을 통해 발현 정도를 관찰한 결과 TRPA1 대조군에 비해 ZRE(0.1 mg/ml)과 ZRE(0.5 mg/ml)을 처리한 세포에서 발현 억제를 나타내었으나 통계적으로 유의미한 수준은 아니었다.
- 1) 건강추출물은 TRPV1이 발현된 HEK 293T cell에서 0.1.mg/ml과 0.5 mg/ml 두 농도에서 모두 유의미한 TRPV1 발현 억제를 나타내었다.
- 1. 건강추출물은 TRPV1이 발현된 HEK 293T cell에서 TRPV1 발현 억제 작용을 나타내었다.
- 19일째 20일째 28.8±19.4로 대조군에 비해 유의미하게 증가하였다(Table 1).
- 2) 환도(GB30)와 족삼리(ST36)에 시술한 건강약침은 용량의존적으로 신경병증성 통증 흰쥐 모델에서 유발된 이질통과 열 통각과민 및 뇌 중심회백질에서 증가된 c-fos 발현을 감소시키는 효과가 있었다.
- 2. 건강추출물은 TRPA1이 발현된 HEK293T cell에서 TRPA1 발현 억제 작용은 나타나지 않았다.
- 3) 신경병증성 통증 흰쥐 모델에서 L5 DRG의 TRPV1 단백 수준은 대조군이 정상군에 비해 유의하게 증가되어 신경병증성 통증에서 TRPV1 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 또한 건강약침이 용량의존적으로 TRPV1 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 3. Von frey filament 자극을 통한 기계적 이질통 검사에서 건강약침 B군과 건강약침 C군에서 대조군에 비해 회피반응 역치의 유의미한 증가를 나타내었다.
- 4) 건강약침의 신경병증성 통증 모델 흰쥐의 이질통 및 열 통각과민성 개선 효과는 용량의존적인 이질통 감소 및 TRPV1 차단효과를 고려할 때 환도(GB30)와 족삼리(ST36)의 자극에 의한 것이라기 보단 TRPV1 차단과 관련이 있다.
- 4. Radiant heat 자극에 의한 열 통각 과민성 검사에서 건강약침 B군과 건강약침 C군에서 대조군에 비해 회피반응 지연시간의 유의미한 증가를 나타내었다.
- 5) 取穴 및 약침 시술: 환도(GB30)의 취혈은 hind limb에서 femur의 greater trochanter와 superior anterior iliac spine 사이중간으로 취하였으며, 족삼리(ST36)의 취혈은 슬관절 아래 tibialis anterior muscle과 extensor digitorum longus muscle 사이에 모두 인체에 상응하는 부위로 취하였다.
- 5. Acetone 자극을 통한 냉 이질통 검사에서 건강약침 A군, 건강약침 B군, 건강약침 C군 모두 대조군에 비해 회피반응 시간의 유의미한 감소를 나타내었다.
- 6. c-fos 단백 발현 변화에서는 건강약침 B군과 건강약침 C군에서 대조군에 비하여 유의미한 감소가 나타났다.
- 7. TRPV1 단백 발현은 건강약침 A군, 건강약침 B군, 건강약침 C군 모두 대조군에 비해 모두에서 유의미한 감소를 나타났다.
- 8. TRPA1 단백 발현은 건강약침 A군, 건강약침 B군, 건강약침 C군 모두 대조군에 비해 유의미한 변화를 보이지 않았다.
- L5 DRG에서 TRPV1 단백 수준은 대조군이 정상군에 비해 유의하게 증가되어, 신경병증성 통증에서 TRPV1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- TRPA1 단백 수준 또한 대조군이 정상군에 비해 증가되어 있었으나, 통계적인 유의성이 있는 수준은 아니었으며, ZP-A군, ZP-B군, ZP-C군 및 Tra군 모두 대조군에 비해 감소되어 있었으나, 이 또한 통계적인 유의성이 있는 수준은 아니었다(Fig. 5).
- 건강약침군간의 비교에서 ZP-C군의 c-fos 단백 발현 감소가 가장 많이 나타나 건강약침의 신경병증성 통증 감소 효과가 용량의존적인 경향성을 보였다(Fig. 4).
- 건강약침군과 대조군과의 비교에서는 ZP-B군은 7일째 21,60±6.02, 11일째 21.60±6.02로 회피반응 역치의 유의미한 상승을 보였고, ZP-C군은 11일째 39.6±18.62, 15일째 29.20±18.9, 19일째 30.6±17.11로 유의미하게 증가하였다.
- 건강약침의 신경병증성 통증을 유발한 흰쥐의 뇌 중심 회백질 부위에서의 c-fos 단백 수준에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, 대조군은 정상군에 비하여 유의미한 증가가 나타났으며, ZP-B, ZP-C, Tramadol군에서 대조군에 비하여 유의미한 감소가 관찰되었다.
- 건강약침이 신경병증성 통증을 유발한 흰쥐의 Acetone 자극으로 유발된 Cold allodynia에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, 대조군은 11일째 16.93±7.30, 15일째 18.47±7.19, 19일째 23.73±8.21를 나타내어 정상군에 비해 회피반응시간이 유의하게 증가하였다.
- 건강약침이 신경병증성 통증을 유발한 흰쥐의 radiant heat 자극에 의한 회피반응 지연시간에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 3일째 5.08±0.95, 11일째 6.02±0.84, 15일째 5.60±0.63, 19일째 6.19±0.77을 나타내어 정상군에 비해 회피반응 지연시간이 유의미하게 감소하였다.
- 건강의 해열진통효과를 바탕으로, 온도를 조절하는 핵심 채널이며 통합적 통증 신호 조절자인 TRPV1과 TRPA1의 조절 작용을 통한 건강의 진통효과를 확인하기 위한 이번 연구에서 건강추출물의 TRPV1 차단효과 및 건강약침의 신경병증성 통증 모델 흰쥐의 이질통 및 열 통각 과민성 개선 효과를 알 수 있었다.
- 따라서, 기계적 이질통을 감소시키는 효과는 저농도인 ZP-A군에서는 나타나지 않았으며, 대체로 고농도에서 더 큰 효과를 나타내는 경향을 보였다.
- 또한, ZP-A군, ZP-B군, ZP-C군 및 Tramadol군 모두 대조군에 비해 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있었으며, ZR-A군에 비해 ZP-B군과 ZP-C군에서 TRPV1 발현 억제 효과가 더 큰 것을 볼 때, 건강약침이 용량의존적으로 TRPV1 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 이상의 실험결과를 종합해 봤을 때 건강약침이 신경병리성 통증이 유발된 흰쥐 모델에 대한 통증 억제 효과가 있다고 생각되며, 이러한 작용은 TRPV1 차단과 관련이 있는 것으로 사료된다.
- 이에 비하여 ZP-A군은 11일째 8.52±1.18으로 단 한 번의 유의미한 지연시간 증가를 보였고, ZP-B군은 15일째 8.11±0.76, 19일째 9.13±1.56을, ZP-C군은 11일째 8.82±0.49, 15일째 9.12±0.58, 19일째 9.92±0.78으로 회피반응 지연시간이 대조군에 비해 유의미한 수준으로 증가하여 열 통각 과민반응의 개선효과를 확인할 수 있었으며, 이 효과 역시 용량의존적(dose-dependent) 경향이 있음을 알 수 있었다.
- 추출물(Zingiberis Rhizoma Extract, ZRE)의 억제작용 (1) TRPV1을 발현시킨 HEK 293T cell에 ZRE(0.1 mg/ml), ZRE(0.5 mg/ml), Capsaicin(10 μM)을 각각 처리한 후 24시간 배양뒤에 Western blot을 통해 발현 정도를 관찰한 결과 TRPV1 대조군에 비해 ZRE(0.1 mg/ml)과 ZRE(0.5 mg/ml)을 처리한 세포에서 유의미한 발현 억제를 나타내었으나, 농도별 차이는 나타나지 않았다.
- 환도(GB30)와 족삼리(ST36)에 시술된 건강약침이 tibial & common peroneal nerve의 말단부를 제거하여 신경병증성 통증을 유발한 흰쥐의 Von frey filament 자극으로 유발된 기계적 이질통에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, 대조군을 비롯한 건강약침군, Tramadol군 모두 정상군에 비해 회피반응 역치가 유의미하게 낮아진 것으로 나타났다.
후속연구
- 이상의 결과로부터 건강추출물은 TRPV1에 대한 차단 효과를 통한 진통제로서의 개발 가능성이 있다고 생각되며, 향후 건강약침의 농도와 투여횟수 및 기간에 따른 효과 차이, 부작용 등에 대한 연구가 필요하며, 임상적인 적용을 위해 실험적 모델에 대한 임상적 연관성에 대한 상세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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