갯메꽃은 해안 사구에 분포하며 식물로 높은 환경 적응력을 가지고 있으며 갯메꽃은 항산화, 해열, 살균, 이뇨작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 암전이 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려진 matrix metalloproteinases (MMPs)의 일종인 MMP-2와 MMP-9의 활성에 대한 갯메꽃의 억제효과를 methylene chloride (MC) 및 methanol (MeOH) 추출물과 조추출물, 유기용매 분획물을 시료로 하여 인체 섬유육종 HT-1080 세포를 이용하여 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent), gelatin zymography, Wound healing assay, RT-PCR, western blot 실험을 통해 조사하였다. 갯메꽃의 MC 및 MeOH 추출물, 조추출물과 4가지 유기용매 분획물이 HT-1080 세포에서 MMP-2와 MMP-9 생성 억제 활성을 나타냄을 확인하였다. 그 중에서도 n-hexane, 85% aq.MeOH 분획물이 전반적으로 MMP-2와 MMP-9에 대한 높은 억제활성을 보였다. 이들 결과로부터 85% aq.MeOH과 n-hexane 분획물에 MMP 억제 활성이 높은 물질이 존재할 것으로 추측되어지며, 갯메꽃 추출물 및 분획물이 암침윤 및 전이를 억제하는 효과적인 항암소재로서의 가능성이 있음을 제시한다. 이에 본 연구팀은 85% aq.MeOH과 n-hexane 분획물에 있는 활성물질을 분리하기 위한 연구를 추가적으로 수행할 계획이다.
갯메꽃은 해안 사구에 분포하며 식물로 높은 환경 적응력을 가지고 있으며 갯메꽃은 항산화, 해열, 살균, 이뇨작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 암전이 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려진 matrix metalloproteinases (MMPs)의 일종인 MMP-2와 MMP-9의 활성에 대한 갯메꽃의 억제효과를 methylene chloride (MC) 및 methanol (MeOH) 추출물과 조추출물, 유기용매 분획물을 시료로 하여 인체 섬유육종 HT-1080 세포를 이용하여 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent), gelatin zymography, Wound healing assay, RT-PCR, western blot 실험을 통해 조사하였다. 갯메꽃의 MC 및 MeOH 추출물, 조추출물과 4가지 유기용매 분획물이 HT-1080 세포에서 MMP-2와 MMP-9 생성 억제 활성을 나타냄을 확인하였다. 그 중에서도 n-hexane, 85% aq.MeOH 분획물이 전반적으로 MMP-2와 MMP-9에 대한 높은 억제활성을 보였다. 이들 결과로부터 85% aq.MeOH과 n-hexane 분획물에 MMP 억제 활성이 높은 물질이 존재할 것으로 추측되어지며, 갯메꽃 추출물 및 분획물이 암침윤 및 전이를 억제하는 효과적인 항암소재로서의 가능성이 있음을 제시한다. 이에 본 연구팀은 85% aq.MeOH과 n-hexane 분획물에 있는 활성물질을 분리하기 위한 연구를 추가적으로 수행할 계획이다.
Calystegia soldanella is distributed in coastal sand dunes and has high environmental adaptability; it is also known to be effective for anti-oxidant, anti-pyretic, anti-septic, and diuretic action. This study investigated the effect of crude extracts and organic solvent fractions of C. soldanella o...
Calystegia soldanella is distributed in coastal sand dunes and has high environmental adaptability; it is also known to be effective for anti-oxidant, anti-pyretic, anti-septic, and diuretic action. This study investigated the effect of crude extracts and organic solvent fractions of C. soldanella on MMP-2 and MMP-9 expression, MMP activity, and cell mobility in phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-induced fibrosarcoma HT-1080 cells. C. soldanella was twice extracted, once with methylene chloride (MC) and once with methanol (MeOH). After the MC and MeOH extracts were combined, their suppressive effects on MMP-2 and MMP-9 expression, MMP enzymatic activity, and gene and protein expression were measured by gelatin zymography, enzyme-linked immunosorbent assay, reverse-transcription polymerase chain reaction, and western blot method. Cell mobility for the HT-1080 cells was observed by wound healing assay. The combined crude extracts showed a significant suppressive effects on MMP-2 and MMP-9 expression. To explore active inhibitory elements, the combined extracts were fractionated according to polarity into with n-hexane, 85% aqueous methanol, n-butanol, and water. Across these four solvent fractions, MMP-2 and MMP-9 activity and cell mobility in the HT-1080 cells were all strongly inhibited by the n-hexane fraction. These results suggest that C. soldanella extract and organic solvent fractions could be used as potent MMP inhibitors for effective anti-cancer treatments to suppress cancer invasion and metastasis.
Calystegia soldanella is distributed in coastal sand dunes and has high environmental adaptability; it is also known to be effective for anti-oxidant, anti-pyretic, anti-septic, and diuretic action. This study investigated the effect of crude extracts and organic solvent fractions of C. soldanella on MMP-2 and MMP-9 expression, MMP activity, and cell mobility in phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-induced fibrosarcoma HT-1080 cells. C. soldanella was twice extracted, once with methylene chloride (MC) and once with methanol (MeOH). After the MC and MeOH extracts were combined, their suppressive effects on MMP-2 and MMP-9 expression, MMP enzymatic activity, and gene and protein expression were measured by gelatin zymography, enzyme-linked immunosorbent assay, reverse-transcription polymerase chain reaction, and western blot method. Cell mobility for the HT-1080 cells was observed by wound healing assay. The combined crude extracts showed a significant suppressive effects on MMP-2 and MMP-9 expression. To explore active inhibitory elements, the combined extracts were fractionated according to polarity into with n-hexane, 85% aqueous methanol, n-butanol, and water. Across these four solvent fractions, MMP-2 and MMP-9 activity and cell mobility in the HT-1080 cells were all strongly inhibited by the n-hexane fraction. These results suggest that C. soldanella extract and organic solvent fractions could be used as potent MMP inhibitors for effective anti-cancer treatments to suppress cancer invasion and metastasis.
위와 같이 겟매꽃의 다양한 생리활성이 보고되었지만 암전 이와 관련된 연구는 아직 보고되지 않았다. 따라서 본 연구진은 갯메꽃을 추출 및 분획한 후, HT-1080 (human fibrosarcomacell)에서 갯메꽃 추출물 및 유기용매 분획물의 MMP-2, MMP-9 발현 억제 효과 및 세포 이동성 억제 효과를 조사하여, 암 침윤 및 전이 억제 활성을 가진 항암소재로서의 활용 가능성을 제시하고자 한다.
제안 방법
본 연구에서는 암의 전이 및 침윤에 가장 밀접하게 관여하는 MMP-2와 MMP-9의 활성과 발현에 대한 겟매꽃의 효능을 HT-1080 (human fibrosarcoma cell)을 이용하여 조사하였다. 또한 겟메꽃이 세포의 이동성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 HT-1080 세포의 이동을 관찰하였다.
조추출물의 MMP 생성억제효과가 암세포 전이 관련 인자에 미치는 영향을 mRNA 발현 및 단백질 발현의 분석을 통해 알아보았다(Fig. 2C, Fig. 2D). 배양된 HT-1080 세포에서 RTPCR을 이용하여 MMP-2와 MMP-9 mRNA 발현을 분석한 결과 PMA를 단독으로 처리한 세포의 경우 아무 처리를 하지 않은 세포에 비해 MMP-2와 MMP-9 mRNA 모두 발현이 뚜렷이 증가하는 경향을 보였지만 PMA와 100 μg/ml 농도의 조추출물을 동시 처리한 세포에서는 MMP-2와 MMP-9의 발현이 효과적으로 억제하였다(Fig.
대상 데이터
HT-1080 (human fibrosarcoma cell) 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Korean cell line Bank)에서 분양 받아 사용하였으며, 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin과 10% FBS (Fetal Bovine Serum, GenDepot, USA)이 함유된 RPMI 1640 (GenDEPOT, USA) 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ incubator(Formascientific, Japan)에서 배양하였다. 배양된 세포는 일주일에 2~3회 PBS buffer (Gibco-BRL, USA)로 세척 후, 배지를 교환하였다.
본 실험에 사용한 갯메꽃(C. soldanella)은 전라북도 군산시 옥도면 비안도리에서 직접 채취하여 세척하고 그늘에서 자연 건조 후 분쇄한 것을 시료로 사용하였다. 건조 분쇄한 시료를 methylene chloride (MC, Duksan, Korea) 용매에 24시간 추출한 후 여과하였으며, 이 과정을 2회 실시하였다.
데이터처리
0) 통계프로그램을 이용하여 유의성을 검토하였다. 일원배치 분산분석(OnewayAnalysis Of Variance: ANOVA)을 통해 집단간의 유의성을 검정하였으며, 각 실험에서 평균치간의 유의성은 p<0.05 수준으로 Duncan's multiple range test를 실시하여 검증하였다.
이론/모형
ELISA 법을 이용하여 HT-1080세포에서 갯메꽃 추출물과 유기용매 분획물이 MMP-2와 MMP-9 생성에 미치는 영향을 확인하였다. HT-1080 세포를 24 well plate 에 2×105 cells/well이 되도록 seeding한 후, FBS를 투입하지 않은 배지를 사용하여 24시간 동안 안정화하고 추출물과 분획물 시료를 100 μg/ml 농도로 처리하여 1시간 동안 배양하였다.
추출물 단계에서의 MMPs 생성 억제 활성을 검토한 후 MC 추출물과 MeOH 추출물을 합하여 제조한 조추출물을 시료로 하여 HT-1080 세포에서 PMA에 의한 MMP-2와 MMP-9의 분비에 미치는 효과를 두 효소의 기질 분해능을 이용하여 활성을 확인하는 방법인 gelatin zymography를 이용하여 측정하였다. 갯메꽃의 조추출물은 10, 50, 100 μg/ml 농도에서는 약 85% 이상의 생존율을 나타내었으며 이 결과를 바탕으로 실험을 진행하였다(Fig.
성능/효과
먼저 갯메꽃 추출물(MC 추출물과MeOH 추출물)이 HT-1080 세포에서 MMP-2와 MMP-9의 활성에 미치는 영향을 ELISA kit를 이용한 항원-항체 반응을 통해 알아보았다. MC 추출물과 MeOH 추출물을 처리한 결과 PMA를 단독 처리한 양성대조군과 비교하였을 때 MC 추출물은 농도 의존적으로 MMP-2와 MMP-9 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B, Fig. 1C). 고농도인 100 μg/ml에서의 MMP 생성 억제활성은 세포독성에 의한 것으로 사료된다.
각각의 분획물들에 대한 MMP-2와 MMP-9 억제활성을 추출물 수준과 동일한 과정들을 통하여 조사하였다. 그 결과 n-hexane과 85% aq.MeOH 분획물에서 MMP-2 및 MMP-9생성에 대해 높은 억제효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 추가적으로 Wound healing assay를 이용하여 HT-1080세포의 이동을 관찰한 결과 85% aq.
4A). 특히 85% aq.MeOH 과 n-BuOH 분획물에서 세포이동성이 효과적으로 저해되었는데 이 중 85% aq.MeOH 분획물은 세포독성에 영향을 받은 것으로 판단되어, n-BuOH 분획물이 암 세포 전이에 대한 저해 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 gelatin zymography 법을 이용한 MMP 발현 억제 활성 측정에서도 유사한 결과를 나타내었다(Fig.
후속연구
MeOH 분획물의 경우 약간의 세포독성을 보였기 때문에 독성에 영향을 받은 것으로 판단되어 n-hexane 분획물이 MMP-2 및 MMP-9 발현에 뚜렷한 억제활성이 있음을 확인하였다. 이상의 결과로 85% aq.MeOH 및 n-hexane 분획물에서 MMP 생성 억제활성이 높은 물질이 존재할 것으로 추측되어 항암소재로서 활용 가능성이 있음을 제시한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
matrix metalloproteinase는 어떤 역할을 하는가?
세포외 기질은 암의 전이 및, 조직형성, 생체방어에 주요 역할을 하며, 이러한 세포외 기질을 분해하는 대표적인 유전자가 matrix metalloproteinase (MMPs)이다[3-5]. MMP는 다른 matrix 단백질과 콜라겐을 분해하여 암 진행에 주요한 역할을 한다[2, 19]. 인체 내부의 26가지 MMP 중 gelatinase인 MMP-2와 MMP-9의 발현이 세포외기질의 주요 구조 성분인 type IV collagen을 분해하며[7, 10, 17], 기저막분해 및 신생혈관의 형성에 관여하여 암세포 침윤 및 전이를 유도한다고 알려져 있다[11, 13, 21].
갯메꽃은 어떤 효과가 있는가?
갯메꽃은 해안 사구에 분포하며 식물로 높은 환경 적응력을 가지고 있으며 갯메꽃은 항산화, 해열, 살균, 이뇨작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 암전이 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려진 matrix metalloproteinases (MMPs)의 일종인 MMP-2와 MMP-9의 활성에 대한 갯메꽃의 억제효과를 methylene chloride (MC) 및 methanol (MeOH) 추출물과 조추출물, 유기용매 분획물을 시료로 하여 인체 섬유육종 HT-1080 세포를 이용하여 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent), gelatin zymography, Wound healing assay, RT-PCR, western blot 실험을 통해 조사하였다.
암세포의 성장 및 전이는 어떤 과정을 통해 발생하는가?
암세포의 성장 및 전이는 세포외 기질(extracellular matrix,ECM)의 분해와 신생혈관의 형성(angiogenesis) 후 종양세포의 순환계를 통한 이동, 타 조직에 부착하여 침윤하는 과정을 통해 발생한다[6, 8, 15]. 세포외 기질은 암의 전이 및, 조직형성, 생체방어에 주요 역할을 하며, 이러한 세포외 기질을 분해하는 대표적인 유전자가 matrix metalloproteinase (MMPs)이다[3-5].
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.