[논문]팔각회향 dichloromethane 분획물에 의한 지방세포 분화 억제 효과

정현영; 정인교; 김남주; 윤희정; 박정하; 김병우; 권현주

doi:10.5352/jls.2019.29.4.447

초록
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비만은 에너지의 불균형으로 인하여 체내 지방조직에 지방이 축적되는 대사성질환으로 심혈관계 질환, 고혈압, 2형 당뇨, 고지혈증 및 각종 암의 발생 빈도를 증가시키는 요인이다. 지방의 축적은 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 과정을 의미하는 adipogenesis라는 과정을 거쳐서 일어난다. 지방세포로의 분화는 다양한 호르몬과 전사인자들의 상호작용에 의해서 일어난다. 본 연구에서는 팔각회향이 항비만 소재로 활용 가능한지 확인하기 위해, 팔각회향 물 추출물을 분획하여 지방축적 억제 활성이 좋은 dichloromethane층을 선정하였다. 3T3-L1 지방전구세포가 성숙한 지방세포로 분화할 때 팔각회향 dichloromethane 층이 어떠한 기전으로 분화를 조절하는지 확인한 결과, 지방세포 분화에서 중요한 전사인자인 C/EBP family, $PPAR{\gamma}$의 발현이 억제되었고, 지방세포 최종 분화 마커로 알려져 있는 FAS 및 LPL의 발현 또한 감소되었다. 또한 G1기에서의 세포주기 정지를 통해 지방세포 분화 단계에서 필수적인 mitotic clonal expansion 단계를 억제한다는 결과를 얻었다. 이러한 연구 결과는 팔각회향이 항비만 효과를 가지는 천연물 소재로의 활용가능성을 보여주는 기초 자료가 될 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Fat accumulation in adipocytes occurs through the process of adipogenesis in which preadipocytes differentiate into adipocytes. Obesity is a metabolic disorder caused by excessive accumulation of fat in the body, which increases the incidence of cardiovascular diseases, hypertension, type 2 diabetes...

Fat accumulation in adipocytes occurs through the process of adipogenesis in which preadipocytes differentiate into adipocytes. Obesity is a metabolic disorder caused by excessive accumulation of fat in the body, which increases the incidence of cardiovascular diseases, hypertension, type 2 diabetes, hyperlipidemia, and various cancers. Recently, inhibition of adipocyte differentiation was shown to be a potential antiobesity strategy. In this study, the inhibitory effect of dichloromethane fractions from Illicium verum Hooker fil. water extract on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes to adipocytes was investigated. Dichloromethane fractions from I. verum Hooker fil. significantly inhibited adipocyte differentiation when applied during the adipocyte differentiation process, as assessed by measuring fat accumulation using Oil-red O staining. In addition, dichloromethane fractions from I. verum Hooker fil. reduced important adipogenic transcription factors, such as CCAAT/enhancer binding protein ${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$), $C/EBP{\beta}$, and peroxisome proliferator activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$). The expression of FAS and LPL, which are terminal differentiation markers of mature adipocytes, was also reduced in the 3T3-L1 adipocytes treated with dichloromethane fractions from I. verum Hooker fil. In addition, the treatment significantly inhibited mitotic clonal expansion, which is essential for adipocyte differentiation, by arresting the G1 phase of the cell cycle. Taken together, these results suggest that dichloromethane fractions from I. verum Hooker fil. may be a natural material with antiobesity effects.

주제어

표/그림 (6)

$Fig. 1. Extraction and fractionation of Illicium verum Hooker fil. by various organic solvents.$ 그림 Fig. 1. Extraction and fractionation of Illicium verum Hooker fil. by various organic solvents.
$Fig. 2. Effects of several fractions derived from lllicium verum Hooker fil. on lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes.$ 그림 Fig. 2. Effects of several fractions derived from lllicium verum Hooker fil. on lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes.
$Fig. 3. Effects of CH2Cl2 fraction derived from lllicium verum Hooker fil. on cell viability in 3T3-L1 pre-adipocytes.$ 그림 Fig. 3. Effects of CH₂Cl₂ fraction derived from lllicium verum Hooker fil. on cell viability in 3T3-L1 pre-adipocytes.
$Fig. 4. Expression of adipogenesis-related proteins in 3T3-L1 cells treated with lllicium verum Hooker fil. CH2Cl2 fraction.$ 그림 Fig. 4. Expression of adipogenesis-related proteins in 3T3-L1 cells treated with lllicium verum Hooker fil. CH₂Cl₂ fraction.
$Fig. 5. Anti-proliferative effects of lllicium verum Hooker fil. CH2Cl2 fraction in the mitotic clonal expansion process of adipocyte differentiation.$ 그림 Fig. 5. Anti-proliferative effects of lllicium verum Hooker fil. CH₂Cl₂ fraction in the mitotic clonal expansion process of adipocyte differentiation.
$Fig. 6. Cell cycle analysis of 3T3-L1 cells treated with of lllicium verum Hooker fil. CH2Cl2 fraction during the mitotic clonal expansion process of adipocyte differentiation.$ 그림 Fig. 6. Cell cycle analysis of 3T3-L1 cells treated with of lllicium verum Hooker fil. CH₂Cl₂ fraction during the mitotic clonal expansion process of adipocyte differentiation.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화될 때, 팔각회향 분획물이 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 팔각회향을 열수로 추출한 다음 분획하여 가장 효과가 좋은 dichloromethane층으로 실험을 수행하였으며, 분화 관련 전사인자의 발현 양상에 미치는 영향과 지방세포 분화 초기 단계인 mitotic clonal expansion 단계를 억제하는지 확인하여, 팔각회향의 항비만 천연소재로서의 가능성에 대해 고찰하였다.

제안 방법

Mitotic clonal expansion 단계에서 시료가 세포 주기에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 세포 주기 변화를 측정하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 60 mm cell culture dish에 1×10⁵ cells의 농도로 각 dish에 첨가하여 배양한 다음 confluence 상태가 되면 2일간 더 배양하였다.
3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로 분화될 때 가장 큰특징은 세포 내 축적된 중성지방(triglyceride, lipid droplet)이관찰되는 점이다[16]. 따라서 분화 과정에서 나타나는 세포 내중성지방의 축적에 팔각회향 분획물이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 지방전구세포에서 지방세포로 분화 유도시, 각각의 분획물을 0, 50, 100, 150, 200 μg/ml의 농도로 동시에 처리한 다음, Oil Red O 염색을 수행하여 중성지방의 축적된 정도를 관찰하였다. 그 결과, Fig.
팔각회향 dichloromethane층에 의한 지방세포 내 지방축적 억제 효능이 3T3-L1 지방전구세포의 독성 유발에 의한 결과인지 확인하기 위해, 지방전구세포에 팔각회향 dichloromethane 층을 0, 50, 100, 150, 200 μg/ml의 농도로 처리한 다음 WST-1 assay를 수행하였다. WST-1 assay는 세포 내 소기관인 미토 콘드리아의 탈수소효소와 WST-1 reagent가 반응하여 생성되는 formazan의 농도를 흡광도로 측정하여, 생세포의 농도를 확인하는 원리이다[15].

대상 데이터

Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에서 사용한 세포주는 3T3-L1 (mouse embryonic fibroblast cell line)을 미국 세포주은행(American Type Culture Collection: ATCC, USA)에서 분양 받아 사용하였다. Western blotting에 사용된 C/ EBPα, C/EBPβ의 1차 항체는 Cell signaling (Cell Signaling, Beverly, MA, USA)에서 구매 하였으며, PPARγ, SREBP1c, LPL, p21, Cyclin D, Cdk2, Cdk4, Actin등의 1차 항체 및 anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG은 Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
본 실험에서 사용한 팔각회향(Illicium verum Hooker fil.)은 대한 생약 (Busan, Korea)에서 구입하였고, 잘게 세절하여 분말화한 후, 팔각회향 1 kg과 물 2 l를 넣고 100℃에서 4시간 동안 3회 추출하였다. 추출액을 Whatman No.

데이터처리

, Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 사용하여 분석하였다. 각 군간의 유의성 검정은 t-test를 수행하여 검증하였다.
실험결과는 평균(mean) ± 표준편차로(SD)로 나타내었으며, Statistical Package for the Social Sciences (SPSS 18.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 사용하여 분석하였다. 각 군간의 유의성 검정은 t-test를 수행하여 검증하였다.

이론/모형

에너지 대사 불균형으로 인해 완전히 소진되지 않은 fatty acid 는 triglyceride로 다시 전환되어 세포 내에 축적된다[12]. 이러한 전사인자들의 발현에 팔각회향 dichloromethane층이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 western blot analysis를 수행하였다. SREBP1c와 C/EBPβ는 지방세포 분화 촉진 인자인 MDI를 처리할 때, 즉 지방세포 분화 초기단계에서 발현되는 전사인자이다.
팔각회향 dichloromethane층이 mitotic clonal expansion 단계에서 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 trypan blue exclusion assay를 시행하였다[13]. 3T3-L1 지방전구세포를 60 mm culture dish에 1×10⁵ cells의 농도로 각 dish에 첨가하여 배양한 다음 confluence 상태가 되면 2일간 더 배양하였다.

성능/효과

이와 동일하게, 팔각회향 dichloromethane층의 농도 의존적으로 G1기에서의 cell cycle arrest가 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 종합해보면 MDI만 처리한 3T3-L1 지방전구세포는 정상적으로 cell cycle이 진행되어 mitotic clonal expansion이 시작되지만, 팔각회향 dichloromethane 층을 처리하면 G1기에서 세포주기 정지가 유도되어 mitotic clonal expansion이 억제되고, 동시에 지방세포 분화 관련 전사 인자의 발현이 저해되어 지방세포의 분화가 억제된다고 사료된다.
지방세포 초기에 발현되는 C/EBPβ가 팔각회향 dichloromethane층에 의해 발현이 저해됨에 따라 C/EBPβ가 발현을 촉진 시키는 C/EBPα와 PPARγ 의 발현이 저해 되었고, C/EBPα와 PPARγ에 의해 조절되는 FAS, LPL역시 발현이 저해되어 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 것을 억제한다고 생각할 수 있다. 즉, 팔각회향 dichloromethane층은 지방세포 분화에 관련되는 전사인자들의 발현을 저해하여 분화를 억제함으로써 세포 내 중성지방의 축적을 저해하는 것으로 생각된다.
4B). 지방세포 초기에 발현되는 C/EBPβ가 팔각회향 dichloromethane층에 의해 발현이 저해됨에 따라 C/EBPβ가 발현을 촉진 시키는 C/EBPα와 PPARγ 의 발현이 저해 되었고, C/EBPα와 PPARγ에 의해 조절되는 FAS, LPL역시 발현이 저해되어 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 것을 억제한다고 생각할 수 있다. 즉, 팔각회향 dichloromethane층은 지방세포 분화에 관련되는 전사인자들의 발현을 저해하여 분화를 억제함으로써 세포 내 중성지방의 축적을 저해하는 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	비만은 어떤 병의 발생 빈도를 증가시키는 것으로 알려져있는가?	비만은 흡수된 에너지와 소비된 에너지의 불균형으로 인하여 체내에 지방조직이 축적되는 현상을 말한다. 또한 대사성 질환으로 심혈관계 질환, 고혈압, 2형 당뇨, 고지혈증 및 각종 암의 발생 빈도를 증가시키는 것으로도 알려져 있다[18, 25, 26]. 비만은 일반적으로 지방전구세포가 성숙한 지방세포로 분화하는 과정인 adipogenesis를 통해 중성지방이 세포 내 축적되어 유발되는 것으로 알려져 있다.
	adipogenesis 과정이란?	비만은 에너지의 불균형으로 인하여 체내 지방조직에 지방이 축적되는 대사성질환으로 심혈관계 질환, 고혈압, 2형 당뇨, 고지혈증 및 각종 암의 발생 빈도를 증가시키는 요인이다. 지방의 축적은 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 과정을 의미하는 adipogenesis라는 과정을 거쳐서 일어난다. 지방세포로의 분화는 다양한 호르몬과 전사인자들의 상호작용에 의해서 일어난다.
	비만이란?	비만은 에너지의 불균형으로 인하여 체내 지방조직에 지방이 축적되는 대사성질환으로 심혈관계 질환, 고혈압, 2형 당뇨, 고지혈증 및 각종 암의 발생 빈도를 증가시키는 요인이다. 지방의 축적은 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 과정을 의미하는 adipogenesis라는 과정을 거쳐서 일어난다.

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