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문제 정의
- 본 연구에서는 편백의 다신초 유도를 통한 기내 식물체 재분화기술을 개발하고자 본 연구를 수행하였다. 이를 위해 먼저 다신초 유도를 위한 적정 싸이토키닌의 종류 및 농도 별 처리에서 1/2LM배지에 0.
- 2019). 본 연구에서는 편백의 다신초지 유도를 위한 적정 사이토키닌류의 종류 및 농도 확인, 또한 식물체의 기내 생육을 저해하는 갈변화 현상을 해결하기 위한 몇 가지 항갈변화제 처리효과 연구를 함께 수행하였다.
제안 방법
- 5% 1,4- Dithiothreitol (DTT), 4) 0.5% 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) 그리고 5) 1.0% dithioerythrito (DTE)를 첨가하였다. 절편체는 정아가 포함된 신초를 1 cm의 크기로 조제하여 유리배양병에 5개씩 배양하였고, 배양 5주 후 갈변화율 및 줄기길이를 조사하였다.
- 배양을 위한 절편체는 정아가 포함된 1 cm의 길이로 조제하여 배지에 치상하였다. 다신초 유도배지는 1/2LM배지에 6-benzylamino purine (BAP), Zeatin, Kinetin, N6-(2-Isopentenyl) adenine(2-iP), Thidiazuron (TDZ) 등 5종류의싸이토키닌류 호르몬의 0.1, 0.2 및 0.5 mg/L 의 농도로 각각 첨가하였고, 탄소원으로 3% sucrose와 경화제로는 0.3% gelrite를 각가 첨가하였다. 유리배양병 당 5개씩의 절편체를 배양하였고 5반복 실험을 수행하였으며, 배양 6주 후 식물생장조절물질 종류 및 첨가농도에 따른 다신초 유도율, 유도수 및 신초길이를 조사하였다.
- 다신초 유도율을 향상시키기 위해 싸이토키닌 종류별로 고농도로 첨가된 배지에서 3주 배양 후 저농도 첨가 배지로 옮겨 총 7주간 다신초를 유도하였다. 자세히는 배지는 1/2LM기본배지를 사용하였고, BAP, Zeatin, Kinetin, 2-iP 및 TDZ를 각각 1.
- 기내에서 생육 중인 편백 식물체의 정단부에서 갈변되는 현상이 관찰되는데, 정단부에서 시작되어 점차 식물체 전체로 확대되어 식물체가 고사되는 경향을 보였다. 따라서 이러한 현상을 방지 하기 위해 항산화물질을 배지에 첨가하여 그 억제여부를 확인 하였다. 기본배지는 LM배지를 사용하였으며, 0.
- 모든 배양조건은 1일 16시간 광조명(40 µmol m-2·s-1 백색 형광등), 25±2°C로 유지되는 배양실에서 실시하였다.
- 발근을 위한 배지는 1/2LM기본배지에 1.0% sucrose와 0.4% gelrite가 첨가된 배지에 0.2, 0.5 및 2.0 mg/L IBA 단독처리 혹은 0.5 mg/L IBA + 1.0 mg/L phloroglucinol (PG), 2.0 mg/L IBA + 1.0 mg/L PG가 첨가된 배지를 각각 사용하였다. 배양 10주 후 발근율, 절편체당 뿌리수 및 뿌리길이를 조사하였고, 발근이 이루어진 식물체는 peat-plug (Flexi-plug, QUICKPLUG, USA)로 이식하여 5주간 순화과정을 후 20 cm 이상 생육한 묘목을시험포지에 식재하였다.
- 종자는 흐르는 물에 1시간 동안 침지 처리 후, 70% EtOH에서 1분, 2% NaClO로 20분간 소독 후 멸균수로 3회 세척하여 물기를 제거 후 발아배지에 치상하였다. 발아배지는 1/2 LM (Litvay et al. 1985)배지에 2% sucrose 및 0.3% gelrite를 첨가하였고, 페트리디쉬 당 각 5개의 종자를 파종하여 발아를 유도하였다. 모든 배양조건은 1일 16시간 광조명(40 µmol m-2·s-1 백색 형광등), 25±2°C로 유지되는 배양실에서 실시하였다.
- 0 mg/L PG가 첨가된 배지를 각각 사용하였다. 배양 10주 후 발근율, 절편체당 뿌리수 및 뿌리길이를 조사하였고, 발근이 이루어진 식물체는 peat-plug (Flexi-plug, QUICKPLUG, USA)로 이식하여 5주간 순화과정을 후 20 cm 이상 생육한 묘목을시험포지에 식재하였다.
- 3% gelrite를 첨가 하였고, 유리배양용기에 80 ml의 배지를 첨가 후 5개씩 절편체를 배양하였다. 배양 10주 후 싸이토키닌 종류 및 농도에 따른 다신초 유도율, 유도수를 조사하였다.
- 완전한 줄기신장을 위한 배지는 LM (Litvay et al. 1985), 1/2LM, P6(Teasdale et al. 1986), 1/2P6 등 4종류를 사용하였고, 2% sucrose와 0.3% gelrite를 첨가하였으며 배양 5주후 줄기길이 생장 효과를 조사하였다.
- 3% gelrite를 각가 첨가하였다. 유리배양병 당 5개씩의 절편체를 배양하였고 5반복 실험을 수행하였으며, 배양 6주 후 식물생장조절물질 종류 및 첨가농도에 따른 다신초 유도율, 유도수 및 신초길이를 조사하였다.
- 다신초 유도율을 향상시키기 위해 싸이토키닌 종류별로 고농도로 첨가된 배지에서 3주 배양 후 저농도 첨가 배지로 옮겨 총 7주간 다신초를 유도하였다. 자세히는 배지는 1/2LM기본배지를 사용하였고, BAP, Zeatin, Kinetin, 2-iP 및 TDZ를 각각 1.0, 2.0, 및 5.0 mg/L의 농도로 첨가하여 고농도 조건에서 3주간, 그리고 같은 호르몬 농도를 1/10로 줄인 농도로 각각 0.1, 0.2 및 0.5 mg/L가 첨가된 배지에서 8주간 배양하였다. 탄소원으로 3% sucrose와 경화제 0.
- 0% dithioerythrito (DTE)를 첨가하였다. 절편체는 정아가 포함된 신초를 1 cm의 크기로 조제하여 유리배양병에 5개씩 배양하였고, 배양 5주 후 갈변화율 및 줄기길이를 조사하였다.
- 5 mg/L가 첨가된 배지에서 8주간 배양하였다. 탄소원으로 3% sucrose와 경화제 0.3% gelrite를 첨가 하였고, 유리배양용기에 80 ml의 배지를 첨가 후 5개씩 절편체를 배양하였다. 배양 10주 후 싸이토키닌 종류 및 농도에 따른 다신초 유도율, 유도수를 조사하였다.
대상 데이터
- 종자는 발아배지에 접종 10일 이후부터 발아되기 시작하였고 발아된 소식물체는 다신초 유도를 위한 재료로 사용하였다. 배양을 위한 절편체는 정아가 포함된 1 cm의 길이로 조제하여 배지에 치상하였다.
- 편백 기내배양을 위한 재료는 수원시 권선구 주민거주시설내에 생육하고 있는 35년생 편백에서 5월초 종자를 채취하여 사용하였다. 종자는 흐르는 물에 1시간 동안 침지 처리 후, 70% EtOH에서 1분, 2% NaClO로 20분간 소독 후 멸균수로 3회 세척하여 물기를 제거 후 발아배지에 치상하였다.
성능/효과
- 2 cm 정도의 신초 줄기로부터 발근을 유도하기 위해 옥신 단독 혹은 Phloroglucinol (PG)과 혼용 처리한결과, 0.2 mg/L와 0.5 mg/L IBA처리구에서 65%의 최대 발근율을 보였다(Table 5). 반면 0.
- 그 결과 다신초 유도율은 zeatin처리구 모든 농도에서 100%의 유도율을 보였으며, 또한 5.0 → 0.5 mg/L BA, 2.0 → 0.2 mg/L Kinetin 및 5.0 → 0.5 mg/L 2iP처리에서도 100%의 유도율을 나타냈다(Table 2, Fig. 2).
- 5 mg/L 2iP에서도 73%의 높은 유도율을 각각 보였다(Table 1). 그 외 0.2와 0.5 mg/L BA에서도 다신초 유도율이 60%로 각가 나타나 비교적 효과가 있었다(Table 1). 그러나 TDZ처리의 경우 모든 농도에서47% 이하의 저조한 유도율을 보였고, Kinetin의 모든 농도에서 또한 7% 이하의 유도율을 보여 편백의 다신초지 유도에는 적합하지 않은 것으로 나타났다(Table 1).
- 5 mg/L BA에서도 다신초 유도율이 60%로 각가 나타나 비교적 효과가 있었다(Table 1). 그러나 TDZ처리의 경우 모든 농도에서47% 이하의 저조한 유도율을 보였고, Kinetin의 모든 농도에서 또한 7% 이하의 유도율을 보여 편백의 다신초지 유도에는 적합하지 않은 것으로 나타났다(Table 1). 절편체당 유도된 다신초의 갯수비교에서는 0.
- 2013). 그러나 본 연구에서는 2.0 mg/L IBA와 1.0 mg/L PG를 동시에 첨가 시 높은 발근율과 발근수를 보였으나 뿌리 주위로 캘러스가 형성되어 이는 차후 완전한 발근 식물체로 획득하는데는 다소 불리한 것으로 보여 IBA를 단독 처리하는 것이 보다 효과적일 것으로 생각된다. 이렇게 유도된 식물체는 순화과정을 거쳐 폿트묘로 이식하여 더욱 생장시킨 후, 포지에 이식하였고, 포지에서의 순화식물체 생존율은 100%를 보였고 현재 묘고 30 cm 이상으로 길이 생장하며 건전하게 생육 중에 있다.
- 그리고 싸이토키닌의 고농도→저농도의 순차적 처리의 경우 5.0 mg/L→0.5 mg/L zeatin 처리구에서 100%의 신초유도율과 절편체 당 17.1개의 가장 많은 다신초가 유도되어 다신초 유도를 위한 최적 조건으로 확인되었다.
- 부정아로부터 유도된 신초는 줄기신장 배지에서 배양되는 동안 정단부가 갈변화 되면서 고사하는 현상이 나타났는데, 이것은 정단부에서 시작되어 점차 줄기전체로 확대되어 결국 식물체를 고사시켰다. 따라서 이러한 갈변화 방지를 위한 5종류의 항산화제를 처리한 결과 MES처리구에서 갈변화율 37.5%로 가장 낮아 비처리구(81.3%)와 비교하여 2배 이상의 갈변화 억제효과가 가장 높았으며(Table 4) 그 다음으로는 PVPP와 DTT처리에서는 62.5%, 60.7%로 비처리구에 비해 갈변화가 다소 억제됨을 확인할 수 있었다(Table 4). 줄기의 길이증식 비교에서 MES처리 시 1.
- 2016). 본 연구에서 나타난 신초의 정아부 갈변화 혹은 괴사의 원인은 주로 절편체 조제시 상처 스트레스 등에 의해 발생한 ROS(활성산소)등의 요인으로 세포막 등이 손상을 입어 발생된 결과라고 추정된다.
- 본 연구에서는 한 개의 신초에 다양한 싸이토키닌류를 처리하여 그로부터 다신초를 유도하고 발근과정을 거친 후 완전한 식물체재분화가 가능하였고 이 식물체는 순화과정을 거쳐 생육포지로 이식하여 더욱 생장을 이루는 결과를 도출하였다. 따라서 이렇게 개발된 편백의 식물체재분화 조직배양기술은 종자발아율이 저조하여 묘목보급에 어려움을 겪고 있는 조림용 묘목공급을 위한 일부 보완기술로 활용이 가능하며, 더 나아가 남부지방에서만 편백의 국한된 식재지를 점차 그 범위를 넓혀 북쪽지방에서도 가능한 내한성 수종 개발 등의 다양한 임목육종연구에 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 신초정단부의 갈변화 현상을 억제하기 위해 항산화제 처리 결과 0.5% MES처리구에서 37.5%의 갈변화증상만이 보여 무처구에 비해 2.5배 이상 갈변화 억제 효과가 있었으며, 그에 따른 줄기 길이 신장 또한 1.3 cm로 가장 좋게 나타났다.
- 유도된 다신초지의 길이 신장을 위해 LM배지와 P6배지의 염류농도를 달리한 배지에 각각 배양한 결과 최대 줄기 길이신장은 LM배지에서 2.62 cm였으며, 1/2 P6배지에서 1.78 cm로 최저의 줄기신장을 보였다(Table 3). Ishii (1986)는 CD (Campbell and Durzan)배지에 0.
- 본 연구에서는 편백의 다신초 유도를 통한 기내 식물체 재분화기술을 개발하고자 본 연구를 수행하였다. 이를 위해 먼저 다신초 유도를 위한 적정 싸이토키닌의 종류 및 농도 별 처리에서 1/2LM배지에 0.2 mg/L zeatin의 처리구에서 가장 높은 73%였으며, 절편체 당 평균 3.9개 다신초가 유도되었다. 그리고 싸이토키닌의 고농도→저농도의 순차적 처리의 경우 5.
- 그러나 TDZ처리의 경우 모든 농도에서47% 이하의 저조한 유도율을 보였고, Kinetin의 모든 농도에서 또한 7% 이하의 유도율을 보여 편백의 다신초지 유도에는 적합하지 않은 것으로 나타났다(Table 1). 절편체당 유도된 다신초의 갯수비교에서는 0.5 mg/L BA에서 평균 4.3개로가장 많이 유도되었으며, 0.2 mg/L zeatin, BA 및 2iP 처리구에서 각각 3.9, 3.7 및 3.5개가 유도되어 다소 효과가 있었다. Kinetin 및 TDZ처리구의 경우 2~3개 이하의 신초가 유도되어 BA 혹은 zeatin처리구와 비교하여 다신초 유도를 위한 그효과가 낮았다(Table 1).
- 절편체당 유도된 신초지갯수 비교에서 5.0 → 0.5 mg/L zeatin 순차처리에서 평균 17.1개로 가장 높았으며, 그외 5.0 →0.5 mg/L 2iP처리의 경우 평균 11.6개의 신초가 유도되어 다소 효과를 보였다.
- 정아절편체로 부터 다신초 유도를 위해 5종류 싸이토키닌류를 농도 별로 배양한 결과 0.5 mg/L zeatin이 첨가된 배지에서 80%의 다신초가 유도되어 가장 높은 유도율 결과를 얻었으며(Table 1, Fig. 1), 0.2 mg/L zeatin과 0.5 mg/L 2iP에서도 73%의 높은 유도율을 각각 보였다(Table 1). 그 외 0.
- Kinetin 및 TDZ처리구의 경우 2~3개 이하의 신초가 유도되어 BA 혹은 zeatin처리구와 비교하여 다신초 유도를 위한 그효과가 낮았다(Table 1). 줄기길이는 무첨가구의 2.1 cm 및0.2 mg/L 2iP처리에서 2.0 cm로 효과가 있었으나, Kinetin 전체 농도에서는 줄기길이 평균 1.3 cm로 다신초지 유도율, 절편당 평균 다신초지 개수 그리고 줄기길이 모두 저조한 결과를 보였다. Ishii (1986, 2003)는 편백의 부정아 유도 시 CD배지에 2.
- 줄기의 길이증식 비교에서 MES처리 시 1.3 cm로 가장 높았고, DTE처리구에서는 1.2 cm로 MES와 유사하였으나 DTT 및 PVPP는 무처리구보다 낮은 신초증식율을 보였다(Table 4).
- 0 mg/L PG처리구에서는 전혀 발근이 되지 않았다. 최대 뿌리 발생갯수는 2.0 mg/L IBA+ 1.0 mg/L PG처리구에서 6.6개로 가장 효과적이었으나 0.5 mg/L IBA처리구에서는 평균 4.1개, 0.2 mg/L IBA에서는 평균 3.9개로 다소 낮았다. 뿌리길이 비교에서는 IBA 무처리구에서 2.
후속연구
- 본 연구에서는 한 개의 신초에 다양한 싸이토키닌류를 처리하여 그로부터 다신초를 유도하고 발근과정을 거친 후 완전한 식물체재분화가 가능하였고 이 식물체는 순화과정을 거쳐 생육포지로 이식하여 더욱 생장을 이루는 결과를 도출하였다. 따라서 이렇게 개발된 편백의 식물체재분화 조직배양기술은 종자발아율이 저조하여 묘목보급에 어려움을 겪고 있는 조림용 묘목공급을 위한 일부 보완기술로 활용이 가능하며, 더 나아가 남부지방에서만 편백의 국한된 식재지를 점차 그 범위를 넓혀 북쪽지방에서도 가능한 내한성 수종 개발 등의 다양한 임목육종연구에 활용이 가능할 것으로 기대된다.
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