[논문]엽록소 농도 결정을 위하여 측정한 흡광도 값의 신뢰도 검정 지표로서 엽록소 a/b 비례치

오광석; 이춘환

doi:10.5352/jls.2019.29.5.509

엽록소 농도 결정을 위하여 측정한 흡광도 값의 신뢰도 검정 지표로서 엽록소 a/b 비례치
Chlorophyll a/b Ratio as a Criterion for the Reliability of Absorbance Values Measured for the Determination of Chlorophyll Concentration 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.5 = no.229, 2019년, pp.509 - 513

초록
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비어 람버트 법칙에 의하면 충분히 묽은 용액에서 주어진 파장에서 측정한 흡광도는 용질의 농도에 비례한다. 반대로 충분히 묽은 용액이란 측정한 흡광도 값이 용질의 농도에 비례관계를 가지는 범위에 있는 용액을 말하지만 실제 확신하기가 어렵다. 본 연구에서는 벼 잎에서 추출한 엽록소 80% 아세톤 용액을 사용하여, 측정한 흡광도 값의 신뢰도를 판단할 수 있는 기준으로서 엽록소 a/b 비례치의 사용 가능성을 4가지 다른 흡광분광분석기(Cary4E, UV-1650PC, Versamax, NanoDrop 100)을 사용하여 조사하였다: 우선 $0.2{\mu}g/ml$의 매우 저농도에서 $200{\mu}g/ml$까지의 다양하게 희석한 엽록소 용액을 사용하여, 645 nm와 663 nm에서 측정한 흡광도 값을 측정한 후, 흡광도 값과 엽록소 농도의 비례관계를 조사하였다. 그 결과, 이 비례관계로 판단한 측정치의 신뢰 범위에서 흡광도로부터 계산한 용액에서의 엽록소 농도와 이미 알고 있는 엽록소 농도 비교적 일치하였다. 그러나, 비례관계의 한계치 안에 있어 신뢰도가 인정된 일부 고농도와 저농도에서의 일부 값이 엽록소 a/b 비례치가 용액의 희석에 변화지 않을 것이라는 판단 기준에 있어 신뢰도가 떨어짐을 알 수 있었다. 그러므로, 본 연구결과는 엽록소 농도결정을 위하여 측정한 흡광도 값의 신뢰 여부는 대상 용액을 희석하여 측정한 흡광도의 비례관계로 본 비어-램버트 법칙의 기준 보다는 엽록소 a/b 비례치가 변하지 않는다는 기준으로 측정치의 신뢰도를 판단하는 것이 더 좋다는 것을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The Beer-Lambert law states that absorbance is proportional to the concentration of a solute in a solution at a given wavelength. This linearity works for an ideal or a 'sufficiently diluted' solution, so this linearity is often used as a criterion for the fidelity of the absorbance value measured. In this study, we used a chlorophyll (Chl) solution, isolated from rice leaves with 80% acetone to test the use of the Chl a/b ratio as an additional criterion for checking the fidelity of measured values using four different absorption spectrophotometers: Cary4E, UV-1650PC, Versamax (a microplate reader), and NanoDrop 1,000(which can handle a $4{\mu}l$ aliquot). We used Chl solutions of varying concentrations from $0.2{\mu}g/ml$ to $200{\mu}g/ml$ to measure absorbance values at 645 nm and 663 nm and checked the linearity first. The results indicated that the range of Chl concentrations that we can rely on based on the linearity was similar to the range in which the calculated Chl concentrations based on the measured absorbance values agreed with the known concentrations. However, some border cases or cases with very low Chl concentrations inside the fidelity range of Chl concentrations did not agree with the criterion that the Chl a/b ratio should not change after dilution of the Chl in the solution. These results suggest that the Chl a/b ratio is a better criterion for the reliability of the absorbance values measured for the determination of chlorophyll concentration than the criterion based on the linearity suggested by the Beer-Lambert law.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Dependence of absorbance values on chlorophyll concentration using 80% acetone extracts in a relatively high chlorophyll concentration range from rice leaves. Absorbances were measured at 646.6 nm (A, B) or 646 nm (C, D) and at 663.6 nm (E, F) or 663 nm (G. H), using spectrophotometers: Cary4E (A, E), UV-1650PC (B, F), Versamax (C, G) and NanoDrop 1,000 (D, H). Experiments were repeated at least three times.
그림 Fig. 2. Dependence of absorbance values on chlorophyll concentration using 80% acetone extracts in a relatively low chlorophyll concentration range from rice leaves. Absorbances were measured at 646.6 nm (A, B) or 646 nm (C, D) and at 663.6 nm (E, F) or 663 nm (G. H), using spectrophotometers: Cary4E (A, E), UV-1650PC (B, F), Versamax (C, G) and NanoDrop 1000 (D, H). Experiments were repeated at least three times except for C, D, G and H.
그림 Fig. 3. Comparison of chlorophyll concentrations calculated based in the absorbance values measured with the known chlorophyll concentrations of solutions made by dilution of concentrated extracts. Chlorophyll concentrations calculated using solutions at a relatively low chlorophyll concentration range (A, B, C, D), and those calculated using solutions at a relatively high chlorophyll concentration range (E, F, G, H), using spectrophotometers: Cary4E (A, E), UV-1650PC (B, F), Versamax (C, G) and NanoDrop 1000 (D, H). Experiments were repeated at least three times except for C and D.
그림 Fig. 4. Fidelity test based on the uniformity of chlorophyll a/b ratio in chlorophyll solutions diluted at various concentrations. Chlorophyll a/b ratios calculated using solutions at a relatively low chlorophyll concentration range (A, B, C, D), and those calculated using solutions at a relatively high chlorophyll concentration range (E, F, G, H), using spectrophotometers: Cary4E (A, E), UV-1650 PC (B, F), Versamax (C, G) and NanoDrop 1,000 (D, H). The dotted lines are given at 3.33 +/- 0.069, which is the average +/- standard deviation calculated using the 4 values from the 2^nd to 5^th chlorophyll a/b ratios from the left in E. Experiments were repeated at least three times except for C and D.

AI 본문요약
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문제 정의

식물 잎을 사용하는 연구에서 엽록소(chlorophyll) 농도는 잎 내의 엽록체(chloroplast)의 양 뿐만 아니라 잎에서 추출한 틸라코이드(thylakoid) 현탁액에 존재하는 여러 색소단백질 양의 기준으로 사용된다. 따라서 매우 빈번히 측정되는 흡광도 값이 용액내의 엽록소 농도와 정비례 관계를 나타내면서 신뢰할 수 있는 범위에 있는 지를 확신하기 어렵기 때문에, 본 연구에서는 그 기준이 될 수 있는 척도를 정립하기 위해 4가지 다른 분광분석기를 사용하여 척도의 유용성을 조사해 보고, 또 기기에 따른 차이를 구명하기 위해 수행하였다.

제안 방법

Comparison of chlorophyll concentrations calculated based in the absorbance values measured with the known chlorophyll concentrations of solutions made by dilution of concentrated extracts. Chlorophyll concentrations calculated using solutions at a relatively low chlorophyll concentration range (A, B, C, D), and those calculated using solutions at a relatively high chlorophyll concentration range (E, F, G, H), using spectrophotometers: Cary4E (A, E), UV-1650PC (B, F), Versamax (C, G) and NanoDrop 1000 (D, H). Experiments were repeated at least three times except for C and D.
Fig. 3에서는 측정치로부터 계산한 엽록소 농도와 원래 희석할 때 실험자가 알고 있는 엽록소 농도와 일치하는지 여부로 흡광도 측정치의 신뢰도를 비교해 보았다. Cary4E와 UV-1650PC의 경우, 흡광도 값에서 측정 시료의 농도와 정비례 관계를 벗어난 고농도 경우를 제외하고는 기대치 농도와 측정치의 농도가 거의 일치하였다(Fig.
NanoDrop 1,000의 경우, 80% 아세톤 용액은 장비가 요구하는 시료 용액의 물기둥을 만들지 못하기 때문에 대신 70% 아세톤 용액을 사용하였으며, 큐벳을 사용하지 않고, 4 μl의 소량 액체를 직접 측정하였다.
Nanodrop 1,000의 경우, 빛의 경로의 길이가 10 μm로 매우 짧기 때문에 위와 같은 저농도 실험에 적합하지 않기 때문에 10 μg/ml과 2 μg/ml 사이의 용액에 대하여 조사하였다.
본 연구에서 엽록소 농도에 정비례하는 흡광도 구간을 조사하기 위하여, 벼 잎의 색소를 80% 아세톤 용액으로 추출한 후 같은 용액으로 희석하여 다양한 농도의 엽록소 용액을 측정 시료로 이용하였다. 고등식물의 엽록소 농도의 결정을 위하여, 4가지 다른 흡광분광분석기를 사용하여 646 nm (또는 646.6 nm)와 663 nm (또는 663.6 nm)의 두 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이 차이는 4개의 분광분석기 중 2장비(Versamax, NanoDrop)를 사용할 때, 소수점 이하의 파장 값을 입력하지 못하였기 때문이며, 이하 파장을 언급할 때는 편의상 소수점 아래의 값을 생략하였다.
069)이었다. 따라서, Fig. 4의 각 그래프에 점선으로 이 값의 위치를 표시하여, 다른 모든 측정치의 유사도를 비교하여 볼 수 있도록 하였다.
먼저 흡광도 실험은 고농도의 엽록소 용액과 상대적으로 저농도의 엽록소 용액을 사용하여 측정하였다. 먼저 Fig.
본 연구에서 엽록소 농도에 정비례하는 흡광도 구간을 조사하기 위하여, 벼 잎의 색소를 80% 아세톤 용액으로 추출한 후 같은 용액으로 희석하여 다양한 농도의 엽록소 용액을 측정 시료로 이용하였다. 고등식물의 엽록소 농도의 결정을 위하여, 4가지 다른 흡광분광분석기를 사용하여 646 nm (또는 646.
NanoDrop 1,000의 경우, 80% 아세톤 용액은 장비가 요구하는 시료 용액의 물기둥을 만들지 못하기 때문에 대신 70% 아세톤 용액을 사용하였으며, 큐벳을 사용하지 않고, 4 μl의 소량 액체를 직접 측정하였다. 아래 두 기기의 경우, 소수점이 하의 파장 값을 입력할 수 없기 때문에 646 nm와 663 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
엽록소 측정을 위하여 총 5 g의 잎절편을 액체질소에서 분쇄하였다. 이 분말은 100% 아세톤 용액에서 색소를 추출한 후, 범용 원심분리기를 사용하여 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 취하고 최종 80%(v/v) 아세톤 용액을 만들어 두고, 다양한 엽록소 농도로 희석하여 실험재료로 사용하였다.
이상의 연구에서 4가지 다른 분광분석기를 사용하여 농도를 모르는 엽록소 용액의 농도를 Porra 등[4]의 식으로부터 계산하여 측정하려 할 때, 그 신뢰도의 기준이 될 수 있는 척도를 비교하여 보았다. 우선 측정 대상 용액을 희석하여 흡광도 값을 비교한 결과, 희석비율과 흡광도 값이 정비례관계를 보이지 않을 때, 그 신뢰도를 의심할 수 있으며, 실제 알고 있는 농도의 용액과 비교하였을 때도 유사한 결론을 얻을 수 있었다.
저농도의 엽록소 용액에서의 흡광도 실험결과(Fig. 2), Nano-drop 1,000을 제외한 3가지 장비에서 10 μg/ml과 1 μg/ml 사이의 용액의 경우 비교적 정비례 관계가 잘 관찰되었기 때문에 저농도 실험은 1 μg/ml의 이하 농도에서 수행하였다.

대상 데이터

먼저 Fig. 1은 고농도 용액을 사용한 실험결과를 나타내는 것으로, 고농도 실험은 전체 엽록소(엽록소 a + b)의 농도가 최대 100 μg/ml의 용액을 사용하였으며, NanoDrop3000은 최대 200 μg/ml의 용액을 사용하였다.
벼(Oryza sativa, 품종 ‘동진벼’)를 온실에서 낮/밤(16 hr/8 hr) 광주기와 30℃/26℃의 온도 주기로 재배하였다.
흡광도의 측정을 위하여 아래의 4가지 다른 분광분석기를 사용하였다. 비교적 고가장비로서 안정된 측정치를 제공하는 것으로 알려진 Cary 4E (Varian, 미국), 범용 장비로 널리 사용되는 UV-1650PC (Shimadzu, 일본), ELISA microplate reader 로서 그 원리가 분광분석기와 같은 Versamax (Molecular Devices, 미국), 그리고 NanoDrop 1,000 (Thermo Fisher Scientific, 미국) 등 4가지의 분광 분석기를 사용하였다. Versamax는 96 well plate에 200 μl의 엽록소 용액을 넣어 측정하였다.
벼(Oryza sativa, 품종 ‘동진벼’)를 온실에서 낮/밤(16 hr/8 hr) 광주기와 30℃/26℃의 온도 주기로 재배하였다. 식물 잎 재료는 4주간 재배한 식물체의 상위 부분의 성숙한 잎을 사용하였고, 잎 끝에서 1 cm를 제거한 후 각 잎당 최대 3 cm의 절편을 만들어 사용하였다.

이론/모형

이 분말은 100% 아세톤 용액에서 색소를 추출한 후, 범용 원심분리기를 사용하여 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 취하고 최종 80%(v/v) 아세톤 용액을 만들어 두고, 다양한 엽록소 농도로 희석하여 실험재료로 사용하였다. 엽록소 농도는 아래의 Porra 등[4]의 식을 사용하였고, 각 흡광도 측정치에서 750 nm의 측정한 흡광도 값을 뺀 후 사용하였다.

성능/효과

4가지 다른 분광분석기를 비교한 결과, Cary4E는 흡광도 값이 4까지 되는 높은 농도(60 μg/ml) 범위에서도 흡광도와 정비례관계를 보이고, A663에서도 0.005의 낮은 값을 보이는 0.2 μg/ml까지 흡광도 값과 정비례관계를 보였으나, 엽록소 a/b의 기준으로 볼 때 고농도의 경계부분과 0.6 μg/ml 이하의 저농도에서 측정한 값은 신뢰할 수 없음을 보여 주었다.
Fig. 3D과 3H에서 NanoDrop 1,000의 경우 모든 측정치에서 정비례관계를 보였으나, 이미 Fig. 2H에서 A663 흡광도 값에서 정비례관계를 나타내지 않았고, 그 결과 Fig. 3D에서 8 μg/ml 이하의 농도에서 측정 흡광도에서 계산한 농도 값이 크게 나오는 오차를 보였다.
UV-1650PC 경우도 흡광도 값이 2.5까지 되는 높은 농도(60 μg/ml)에서부터 0.4 μg/ml까지 흡광도 값이 정비례관계를 보였으나, 고농도의 경계부분과 1 μg/ml 이하의 저농도에서 측정한 값은 신뢰도가 매우 떨어짐을 확인할 수 있었다.
Nanodrop 1,000의 경우, 빛의 경로의 길이가 10 μm로 매우 짧기 때문에 위와 같은 저농도 실험에 적합하지 않기 때문에 10 μg/ml과 2 μg/ml 사이의 용액에 대하여 조사하였다. 그 결과, Cary4E는 A₆₄₆과 A₆₆₃에서 각각 흡광도 값이 0.005 및 0.01의 낮은 값까지 정비례 관계를 보여주었으며, 이는 고가분석장비의 안정성 때문이라고 생각한다. UV-1650PC의 경우 A₆₄₆은 이상이 없었으나, A₆₆₃에서 0.
우선 측정 대상 용액을 희석하여 흡광도 값을 비교한 결과, 희석비율과 흡광도 값이 정비례관계를 보이지 않을 때, 그 신뢰도를 의심할 수 있으며, 실제 알고 있는 농도의 용액과 비교하였을 때도 유사한 결론을 얻을 수 있었다. 그러나, 일부 경계구간에서 신뢰도는 엽록소 a/b의 값이 희석에 의해 변하지 않는다는 가정으로 판단하였을 때 측정한 값의 신뢰도가 떨어짐을 알 수 있었다 즉, 실제 흡광도 측정을 통하여 엽록소 농도를 알려고 할 때, 그 측정치의 신뢰도는 희석에 의해 엽록소 a/b 값이 크게 변하지 않는 척도로 판단하는 것이 좋다는 결론을 낼 수 있었다. 4가지 다른 분광분석기를 비교한 결과, Cary4E는 흡광도 값이 4까지 되는 높은 농도(60 μg/ml) 범위에서도 흡광도와 정비례관계를 보이고, A₆₆₃에서도 0.
이상의 연구에서 4가지 다른 분광분석기를 사용하여 농도를 모르는 엽록소 용액의 농도를 Porra 등[4]의 식으로부터 계산하여 측정하려 할 때, 그 신뢰도의 기준이 될 수 있는 척도를 비교하여 보았다. 우선 측정 대상 용액을 희석하여 흡광도 값을 비교한 결과, 희석비율과 흡광도 값이 정비례관계를 보이지 않을 때, 그 신뢰도를 의심할 수 있으며, 실제 알고 있는 농도의 용액과 비교하였을 때도 유사한 결론을 얻을 수 있었다. 그러나, 일부 경계구간에서 신뢰도는 엽록소 a/b의 값이 희석에 의해 변하지 않는다는 가정으로 판단하였을 때 측정한 값의 신뢰도가 떨어짐을 알 수 있었다 즉, 실제 흡광도 측정을 통하여 엽록소 농도를 알려고 할 때, 그 측정치의 신뢰도는 희석에 의해 엽록소 a/b 값이 크게 변하지 않는 척도로 판단하는 것이 좋다는 결론을 낼 수 있었다.
NanoDrop 1,000의 경우, 고농도의 엽록소 용액에서는 높은 신뢰도를 보였으나, 10 μg/ml을 포함한 저농도에서 측정한 값은 신뢰도가 낮다고 판단되었다. 이상의 4가지 다른 분광 분석장비에 대한 결과는 각 기계의 특성을 판단한 결과로 보기 보다는, 여러 특성이 다른 분광분석기를 사용하는 모든 경우에서 엽록소 a/b 값이 흡광도 측정치의 신뢰도 판단에 유용한 지표임을 보여 주었다.
3D에서 8 μg/ml 이하의 농도에서 측정 흡광도에서 계산한 농도 값이 크게 나오는 오차를 보였다. 이상의 경우와 같이, 흡광도로부터 계산한 엽록소 농도를 이미 알고 있는 엽록소 농도 값과 비교해서 그 신뢰도를 판단해 보았으며, 그 신뢰도는 흡광도 자체의 정비례 관계를 근거로 판단한 신뢰도의 범위와 대체로 일치하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	본 연구에서 흡광도의 측정을 위해 사용한 분광분석기는 무엇인가?	흡광도의 측정을 위하여 아래의 4가지 다른 분광분석기를 사용하였다. 비교적 고가장비로서 안정된 측정치를 제공하는 것으로 알려진 Cary 4E (Varian, 미국), 범용 장비로 널리 사용되는 UV-1650PC (Shimadzu, 일본), ELISA microplate reader 로서 그 원리가 분광분석기와 같은 Versamax (Molecular Devices, 미국), 그리고 NanoDrop 1,000 (Thermo Fisher Scientific, 미국) 등 4가지의 분광 분석기를 사용하였다. Versamax는 96 well plate에 200 μl의 엽록소 용액을 넣어 측정하였다.
	Beer-Lambert 법칙에 의하면 주어진 파장에서 측정된 흡광도 값은 무엇과 비례하는가?	Beer-Lambert 법칙에 의하면, 주어진 파장에서 측정된 흡광도(absorbance) 값은 용액내의 용질의 농도에 비례한다. 이 정비례 관계를 갖기 위하여, 용액의 농도는 충분히 묽어야 한다고 요구되지만 ‘충분히 묽다’는 말은 학술적이지 않은 용어로서 보다 구체적인 기준이 필요하다.
	light pathlength가 1cm인 큐벳을 사용하는 범용 분광분석기의 경우 흡광도 값이 얼마일 때, 사용자의 주의가 필요한가?	분광분석기(spectrophotometer)를 사용할 때, 빛의 경로의 길이(light pathlength)가 1 cm인 큐벳을 사용하는 범용 분광분석기의 경우, 흡광도 값이 0.7~0.8 보다 높거나, 0.1 이하의 매우 낮은 값인 경우 측정자의 주의가 필요하다. 고농도에서 일반적으로 정비례 관계는 용액의 농도가 높을 때, 즉 충분히 묽지 않기 때문에 보다 낮은 농도에서 측정한 값에서 환산한 기대치에 비하여 낮은 값을 갖게 된다.

참고문헌 (5)

Arnon, D. 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts, phytophenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiol. 24, 1-15.

상세보기
Lichenthaler, H. K. and Wellburn, A. R. 1983. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents. Biochem. Soc. Trans. 11, 591-592.

상세보기
Mackinney, G. 1941. Absorption of light by chlorophyll solutions. J. Biol. Chem. 145, 315-322.
Porra, R. J., Thompson, W. A. and Kriedemann, P. E. 1989. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 975, 384-394.

상세보기
Porra, R. J. 2002. The chequered history of the development and use of simultaneous equations for the accurate determination of chlorophylls a and b. Photosyn. Res. 73, 149-156.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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