이 연구의 목적은 과잉치 치수 유래 줄기세포의 계대 배양 속도에 대한 상아모세포 연관 유전자의 발현을 비교하는 것이다. 줄기세포는 다른 여러 형태의 세포로 분화할 수 있는 미 분화된 세포이다. 이는 환경이나 특정 자극에 의해 세포 분열이 일어나며 근육이나 골 같은 특정 장기의 조직으로 분화할 수 있다. 20명의 어린이에서 발거한 과잉치에서 과잉치 치수 유래 줄기세포가 얻어졌다. 10계대까지 배양하는 동안 가장 빠른 속도로 계대 배양된 세포와 가장 느린 속도로 계대 배양된 세포 각 3계대와 10계대 세포를 얻어 실험을 진행하였다. 각 세포는 분화제를 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누었다. 이 실험에서 발현도를 살펴본 유전자는 Osteonectin (ONT), Osteocalcin (OCN), Alkaline Phosphatase (ALP), Dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP-1), Dentin sialophosphoprotein (DSPP)이다. 분화가 된 세포가 전반적으로 더 높은 유전자 발현도를 보였으며, 미분화 세포는 10계대에서, 분화된 세포는 3계대에서 더 높은 유전자 발현도를 보였다. 빠른 계대 배양 속도를 보인 세포가 OCN과 DSPP를 제외하고 상대적으로 더 낮은 유전자 발현도를 보였다.
이 연구의 목적은 과잉치 치수 유래 줄기세포의 계대 배양 속도에 대한 상아모세포 연관 유전자의 발현을 비교하는 것이다. 줄기세포는 다른 여러 형태의 세포로 분화할 수 있는 미 분화된 세포이다. 이는 환경이나 특정 자극에 의해 세포 분열이 일어나며 근육이나 골 같은 특정 장기의 조직으로 분화할 수 있다. 20명의 어린이에서 발거한 과잉치에서 과잉치 치수 유래 줄기세포가 얻어졌다. 10계대까지 배양하는 동안 가장 빠른 속도로 계대 배양된 세포와 가장 느린 속도로 계대 배양된 세포 각 3계대와 10계대 세포를 얻어 실험을 진행하였다. 각 세포는 분화제를 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누었다. 이 실험에서 발현도를 살펴본 유전자는 Osteonectin (ONT), Osteocalcin (OCN), Alkaline Phosphatase (ALP), Dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP-1), Dentin sialophosphoprotein (DSPP)이다. 분화가 된 세포가 전반적으로 더 높은 유전자 발현도를 보였으며, 미분화 세포는 10계대에서, 분화된 세포는 3계대에서 더 높은 유전자 발현도를 보였다. 빠른 계대 배양 속도를 보인 세포가 OCN과 DSPP를 제외하고 상대적으로 더 낮은 유전자 발현도를 보였다.
The purpose of this study was to investigate the odontoblast gene expression related to the subculture speed of supernumerary dental pulp stem cells (sDPSCs). The stem cell is undifferentiated cells which has the ability to differentiate into various cells. Specific stimulation or environment induce...
The purpose of this study was to investigate the odontoblast gene expression related to the subculture speed of supernumerary dental pulp stem cells (sDPSCs). The stem cell is undifferentiated cells which has the ability to differentiate into various cells. Specific stimulation or environment induces cell differentiation, and these differentiation leads to bone or muscle formation. 20 sDPSCs were obtained from 20 children under aseptic condition. During the culture through the 10th passage, the third passage cells which showed short subculture period and 10th passage cells which showed long subculture period were earned. Each cell was divided into differentiated group and non-differentiated group. Quantitative real-time polychain reaction (q-RT-PCR) was performed for each group. The genes related to odontoblast differentiation, Alkaline Phosphatase (ALP), Osteocalcin (OCN), Osteonectin (ONT), Dentin sialophosphoprotein (DSPP) and Dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP-1), were measured. Differentiated cells showed more gene expression levels. Undifferentiated cells showed higher gene expression level in 10th passages but differentiated cells showed higher gene expression level in 3rd passages. Cells that showed faster subculture period showed relatively lower gene expression level except for OCN and DSPP.
The purpose of this study was to investigate the odontoblast gene expression related to the subculture speed of supernumerary dental pulp stem cells (sDPSCs). The stem cell is undifferentiated cells which has the ability to differentiate into various cells. Specific stimulation or environment induces cell differentiation, and these differentiation leads to bone or muscle formation. 20 sDPSCs were obtained from 20 children under aseptic condition. During the culture through the 10th passage, the third passage cells which showed short subculture period and 10th passage cells which showed long subculture period were earned. Each cell was divided into differentiated group and non-differentiated group. Quantitative real-time polychain reaction (q-RT-PCR) was performed for each group. The genes related to odontoblast differentiation, Alkaline Phosphatase (ALP), Osteocalcin (OCN), Osteonectin (ONT), Dentin sialophosphoprotein (DSPP) and Dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP-1), were measured. Differentiated cells showed more gene expression levels. Undifferentiated cells showed higher gene expression level in 10th passages but differentiated cells showed higher gene expression level in 3rd passages. Cells that showed faster subculture period showed relatively lower gene expression level except for OCN and DSPP.
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문제 정의
이 연구의 목적은 과잉치 치수 유래 줄기세포의 계대 배양 속도에 차이가 있는 두 세포 간 상아모세포 연관 유전자의 발현을 비교하는 것이다. 치수 유래 줄기세포의 특이한 표지자로는 조 상아 모세포의 분화 표지자인 DSPP DMP-1이 있다.
제안 방법
qRT-PCR을 통해 OCN, ONT, ALP, DMP-1, DSPP, 그리고 housekeeping Gene으로 GAPDH의 Ct (threshold cycle)값을 얻었다. 이를 이용하여 ACt (target gene - housekeeping gene) 값을 얻고 이를 이용하여 AACt 값을 계산하여 각 유전자의 상대적 발현량을 얻었다[14].
각 세포 별, 계대 별, 분화 여부 별 세포에서 Easy-spin total RNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Korea) 를 사용하여 Total RNA의 추출을 시행하였으며, Nanodrop ND-2000®(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)분광광도계를 이용하여 RNA의 정량을 시행하였다. 이후 qPCR RT Master Mix kit (TOYOBO Co.
위해 각 세포의 3계대와 10계대의 세포를 관찰하였다. 각 세포들은 10% FBS와 5 mM ^-glycerophosphate (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, M.O., USA), 100 nM Dexamethasone (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, M.O., USA) 그리고 100 pM Ascorbic acid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, M.O., USA)를 10 mL a-MEM (Gibco, LifeTechnologies, Grand Island, N.Y., USA)에 혼합하여 제작한 골분화 배지에서 배양하여 분화를 유도하였다. 배양 액은 매 3일마다 교환해주었으며 8일간 분화를 유도하였다.
과잉치 치수유래 줄기세포의 골모세포로의 분화유도능의 평가를 위해 각 세포의 3계대와 10계대의 세포를 관찰하였다. 각 세포들은 10% FBS와 5 mM ^-glycerophosphate (Sigma-Aldrich Co.
, USA)에 혼합하여 제작한 골분화 배지에서 배양하여 분화를 유도하였다. 배양 액은 매 3일마다 교환해주었으며 8일간 분화를 유도하였다.
세포 추출을 위해 멸균된 공간에서 멸균된 고속 절삭기구로 과잉치에서 발수를 위해 이ean bench 내에서 멸균된 round bur 를 이용하여 과잉치의 백악법랑경계(Cementoenamel junction, CEJ)하방을 멸균된 Phosphate-buffered saline (PBS) 주수 하에 치수가 노출되지 않을 정도로 절삭 후 치관부와 치근 부를 분리하였다. 노출된 치수는 멸균된 파일을 이용하여 발수하였으며 1 mm3 이하로 작게 잘랐다.
유전자의 증폭 및 형광 검출은 StepOnePlus™ Real-time PCR (AB Applied Biosystems by life Technology, Waltham, M.A., USA)을 사용하였으며, 증폭 과정은 초기 변성(denaturation)을 95C에서 20초, 소둔(annealing)은 각 primer의 적정 온도에서 1 분 총 40 cycle 진행하고, 이후 65C에서 95C까지 해리(dissociation) 과정을 통해 융해 곡선(melting curve) 분석도 함께 시행하였다. 사용한 primer의 sequence와 소둔 온도는 Table 1에 표기하였다.
유전자의 증폭에 필요한 polymerase와 dNTP (Nucleoside triphosphate)가 포함되어 있는 SYBR® green master mix (BioRad Labratories, Hercules, CA, USA)를 사용하였으며, Primer로는 alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin (OCN), osteonectin (ONT), dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP-1), dentin sialophosphoprotein (DSPP), 그리고 각 샘플의 유전자의 상대적 발현량의 비교를 위해 대부분의 세포에서 고르게 발현하며 외부조건에 잘 변하지 않고 일정 정도의 발현값을 보이는 housekeeping gene인 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 contr이로 사용하였다.
이를 이용하여 ACt (target gene - housekeeping gene) 값을 얻고 이를 이용하여 AACt 값을 계산하여 각 유전자의 상대적 발현량을 얻었다[14].
RNA의 정량을 시행하였다. 이후 qPCR RT Master Mix kit (TOYOBO Co., Osaka, Japan)을 이용하여 RNA의 역전사를 통해 cDNA (complementary DNA)를 합성하였다.
대상 데이터
사용된 과잉치는 단국대학교 치과대학 소아치과에서 전신질환 및 의과 병력이 없는 만 5 - 9세 사이의 환아를 대상으로 발치한 20개의 과잉치였다. 실험을 위한 과잉치의 발치는 단국대학교 치과대학 기관윤리위원회의 승인(H-1506/006/001)을 받아 서명 동의 하에 이루어졌다.
, USA)로 배양 접시에서 세포를 분리시킨 후 1/4씩 나누어 계대 배양하였다. 이 과정에서 20개의 과잉치 중계 대 배양의 속도가 현저히 차이나는 세포 두 개를 선별하여 실시간 중합효소 연쇄반응의 실험 대상으로 하였다.
총 20개의 발치한 과잉치에서 유래한 치수줄기세포를 10계대까지 배양하였으며 계대 배양 속도는 평균 2.3 - 3.8일이었다. 계대 배양 속도가 가장 느린 세포와 가장 빠른 세포는 각 7세 남아와 7세 여아의 발치한 과잉치에서 유래된 치수 유래 줄기세포였다.
이론/모형
하지만 과잉치 유래 치수 줄기세포의 배양 중 세포 간 계대 배양 속도에 차이가 존재하며 이에 대한 연구는 드물다. 이 연구는 과잉치 치수 유래 줄기세포의 계대 배양 속도에 따른 유전자의 발현양을 비교적 초기 계대인 3 계대와 후기 계대인 10계대 세포를 실시간 중합효소 연쇄반응 (Quantative real-time polychain reaction, q-RT-PCR)법을 이용하여 알아보았다.
성능/효과
1C는 느리게 계대 배양된 세포에 대한 빠르게 계대 배양된 세포의 유전자 발현도의 상대값을 나타낸 그래프이다. 3계대 미분화 세포의 OCN, DSPP DMP1의 발현도, 10계대 미분화 세포의 OCN, DSPP의 발현도를 제외하고 각 군의 유전자 상대적 발현도가 전반적으로 빠르게 계대 배양된 세포에서 낮게 나타났다.
1A는 미분화된 세포에 대한 분화된 세포의 유전자 발현도의 상대값을 나타낸 그래프이다. 계대 배양 속도가 빠른 10계대의 세포의 ONT와 OCN을 제외한 모든 군에서 유전자 발현도가 분화된 세포에서 더 높은 값을 보였다. Fig.
1B 는 3계대 세포에 대한 10계대 세포의 유전자 발현도의 상대값을 나타낸 그래프이다. 계대에 따른 유전자 발현도의 연관성은 뚜렷하게 나타나지 않지만 10계대에서 ONT의 발현도가 전반적으로 높으며 ALP, DSPP, DMP1은 전반적으로 발현도가 낮은 것으로 나타났다. Fig.
2일로 계대 배양 속도가 느려진 것을 확인할 수 있었다. 또한 10계대가 3계대에 비해 전반적으로 더 낮은 유전자 발현도를 보인 것을 확인할 수 있었으며, 빠르게 계대 배양된 세포에서 전반적으로 낮은 상대적 유전자 발현을 보였다. 이는 빠르게 계대 배양된 세포가 상대적으로 분화가 적게 일어난 것으로 유추할 수 있다.
각 군의 ACt 값은 Table 2에서와 같이 나왔다. 모든 군의 ACt 값은 대부분 ONT에서 가장 작은 값, DSPP에서 가장 높은 값을 보였다.
위 두 연구의 결과를 통해 세포의 분열 활성도라고 볼 수 있는계대 배양 속도와 유전자 발현도 간 연관성을 예상할 수 있었다. 이 실험에서도 세포를 배양하는 동안 초기 5계대까지 평균 계대배양 속도는 각 2.
있었다. 이 실험에서도 세포를 배양하는 동안 초기 5계대까지 평균 계대배양 속도는 각 2.0일과 3.0일 이었던 반면 5계대에서 10계대까지의 평균 계대 배양 속도는 각 2.8일과 4.2일로 계대 배양 속도가 느려진 것을 확인할 수 있었다. 또한 10계대가 3계대에 비해 전반적으로 더 낮은 유전자 발현도를 보인 것을 확인할 수 있었으며, 빠르게 계대 배양된 세포에서 전반적으로 낮은 상대적 유전자 발현을 보였다.
이 연구의 결과들을 볼 때 과잉치 유래 치수줄기세포는 계대배양 됨에 따라 그 속도가 느려지며 분화가 일어남을 알 수 있으며, 세포 분열 속도가 빠른 세포가 분화가 더 적게 일어난 것을 확인할 수 있었다.
이는 이 실험결과를 토대로 유추해보았을 때 과잉치 유래 치수 줄기 세포가 제3대구치 유래 치수줄기세포에 비해 더 높은 세포 분열 활성을 가진다는 결론을 내릴 수 있다. 따라서 과잉치유래 치수 줄기세포는 추후 더 많은 검증을 거친다면 좋은 중간엽 세포의 공여부가 될 수 있을 것으로 보인다.
후속연구
이는 이 실험결과를 토대로 유추해보았을 때 과잉치 유래 치수 줄기 세포가 제3대구치 유래 치수줄기세포에 비해 더 높은 세포 분열 활성을 가진다는 결론을 내릴 수 있다. 따라서 과잉치유래 치수 줄기세포는 추후 더 많은 검증을 거친다면 좋은 중간엽 세포의 공여부가 될 수 있을 것으로 보인다.
이 연구는 계대 배양 속도가 빠른 세포와 느린 세포 각 하나의 세포만 가지고 실험을 진행했다는 데 그 한계가 있다. 이후 더 많은 세포를 이용한 실험을 통한 확인이 필요할 것으로 판단된다.
이 연구는 적은 표본을 가지고 연구가 이루어져 있으므로 추가적으로 더 많은 세포를 이용한 실험을 통한 검증이 필요할 것으로 사료된다.
가지고 실험을 진행했다는 데 그 한계가 있다. 이후 더 많은 세포를 이용한 실험을 통한 확인이 필요할 것으로 판단된다.
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