식품소재화를 위한 Calendula officinalis L. 꽃잎의 항피부노화 기능성 규명 및 비효소적 연화 기술 연구 Non-enzymatic softening of Calendula officinalis L. petals and its anti-skin aging effect for food materialization원문보기
UVB에 의한 MMP-1의 과발현이 카렌듈라 꽃잎을 처리하여 주면 농도의존적으로 감소하였다. 이를 통해 연화시킨 카렌듈라 꽃잎이 UVB에 의한 피부의 광노화를 억제시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 가열과 산처리의 복합처리를 통한 카렌듈라 꽃잎의 연화에서 처리시간, 온도, pH에 따른 연화 수준을 punctual test를 통해 비교 분석하였다. Hardness 값의 비료 분석을 통해 연화특성 및 효과가 처리 조건들에 의해 다름을 확인할 수 있었으며, $70^{\circ}C$ 이상의 높은 온도에 의한 연화효과가 산처리에 의한 효과보다 더 큰 것을 확인할 수 있었다. 하지만 열처리에 의한 연화의 경우 에너지 소비가 큰 것을 고려할 때, pH 2.1에서는 $50^{\circ}C$, 30분의 열처리만으로도 $70^{\circ}C$ 이상의 열처리 효과가 나타나므로, 이 연화처리 조건이 경제적으로 가장 효율적이라 판단되었다.
UVB에 의한 MMP-1의 과발현이 카렌듈라 꽃잎을 처리하여 주면 농도의존적으로 감소하였다. 이를 통해 연화시킨 카렌듈라 꽃잎이 UVB에 의한 피부의 광노화를 억제시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 가열과 산처리의 복합처리를 통한 카렌듈라 꽃잎의 연화에서 처리시간, 온도, pH에 따른 연화 수준을 punctual test를 통해 비교 분석하였다. Hardness 값의 비료 분석을 통해 연화특성 및 효과가 처리 조건들에 의해 다름을 확인할 수 있었으며, $70^{\circ}C$ 이상의 높은 온도에 의한 연화효과가 산처리에 의한 효과보다 더 큰 것을 확인할 수 있었다. 하지만 열처리에 의한 연화의 경우 에너지 소비가 큰 것을 고려할 때, pH 2.1에서는 $50^{\circ}C$, 30분의 열처리만으로도 $70^{\circ}C$ 이상의 열처리 효과가 나타나므로, 이 연화처리 조건이 경제적으로 가장 효율적이라 판단되었다.
Calendula (Calendula officinalis L.) petals are edible flowers which have been used as a decorative ingredient in dishes or as a medicinal food. In this study, the anti-skin aging potential of calendula petals was investigated. Additionally, the texture was softened by non-enzymatic methods to broad...
Calendula (Calendula officinalis L.) petals are edible flowers which have been used as a decorative ingredient in dishes or as a medicinal food. In this study, the anti-skin aging potential of calendula petals was investigated. Additionally, the texture was softened by non-enzymatic methods to broaden their application as a food or cosmetic agent. Treatment of calendula prevented ultraviolet-induced matrix metalloproteinase-1 expression in skin cells. We investigated whether heating-based processing could soften calendula petals. The results from the punctual test demonstrated significant changes in the hardness of calendula petals depending on the pH, heating temperature, and time. Although there were minor differences among various processing conditions, the largest alteration in hardness was observed when the petals were softened by incubation at $80^{\circ}C$ and pH 2.3 for 120 min. Collectively, these results show that the application of proper processing conditions can soften calendula petals without using enzymes.
Calendula (Calendula officinalis L.) petals are edible flowers which have been used as a decorative ingredient in dishes or as a medicinal food. In this study, the anti-skin aging potential of calendula petals was investigated. Additionally, the texture was softened by non-enzymatic methods to broaden their application as a food or cosmetic agent. Treatment of calendula prevented ultraviolet-induced matrix metalloproteinase-1 expression in skin cells. We investigated whether heating-based processing could soften calendula petals. The results from the punctual test demonstrated significant changes in the hardness of calendula petals depending on the pH, heating temperature, and time. Although there were minor differences among various processing conditions, the largest alteration in hardness was observed when the petals were softened by incubation at $80^{\circ}C$ and pH 2.3 for 120 min. Collectively, these results show that the application of proper processing conditions can soften calendula petals without using enzymes.
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문제 정의
연화시켰기 때문에 일반 카렌듈라 꽃잎을 사용했을 때보다 흡수와 분해가 우수할 것이기 때문에 상처 치료나 항염증을 위한 연고나 항노화을 위한 화장품 등에 사용하면 기존의 카렌듈라 꽃잎보다 더 좋은 효과를 보일 수 있을 것이다. 본 연구에서는 카렌듈라 꽃잎의 피부 노화 억제 기능성을 평가하고 카렌듈라 꽃잎을 연화시키는 기술을 규명하였다.
본 연구에서는 카렌듈라 추출물의 피부광노화 효과를 측정하기 위해서 다양한 종류의 세포 중에서 인간 피부 섬유아세포 Hs68을 선정하였고, 우선적으로 세포 독성을 측정하였다. 카렌듈라 추출물이 Hs68 세포에 있어서 어느 농도에서부터 세포 독성을 보이는지 측정하기 위해서 Hs68 세포를 96 well plate에 넣고 배양하였다.
본 연구에서는 현재 식용으로 사용되고 있는 카렌듈라 꽃잎을 연화시켜 꽃의 식품 적용범위를 넓히기 위한 실험을 진행하였다. 꽃을 연화시키게 되면 질감이 부드러워져 꽃 자체 섭취에 있어 거부감을 줄일 수 있고, 섭취하였을 때도 영양분의 흡수를 도와기능성 발휘에 도움을 줄 수 있다(Eom 등, 2016).
제안 방법
24시간 배양 후 카렌듈라 추출물을 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 2400 µg/mL의 농도로 처리하고 1시간 동안 배양한다.
24시간 배양 후 카렌듈라 추출물을 100, 200, 400, 600, 800, 1600, 2400, 3,200, 4,000, 4,800, 5,600 µg/mL의 농도로 처리하고 48시간 배양한 후, 해당 well에 lysis solution을 처리하여 준다.
이후 5,600 µg/mL을 최고 농도로 하여 순차 희석한 후 해당 well에 직접 처리하고 배양하였다. Hs68 세포에서 카렌듈라 추출물의 세포 독성은 CellToxTM Green Cytotoxicity Assay를 통해 측정하였다. 2,400 µg/mL의 농도까지는 독성이 없고, 3200 µg/mL의 농도에서부터 독성이 있었다.
Probe (No. P/2, φ 2mm)를 이용하였고, 검사 방법은 test speed 1.0 mm/sec로 설정하여 시험을 진행하였다.
가열공정과 산처리공정을 동시에 진행하는 복합공정에 의해 카렌듈라 꽃잎의 연화가 어느정도 진행되었는지 비교분석하기 위해 texture analyzer를 이용하여 punctual test를 진행하였다. 직경2 mm 원통형 probe를 이용하여 연화가공 처리된 카렌듈라 꽃잎 중앙을 관통하면서 발생하는 texture profile을 비교 분석하였다(Fig.
이를 통해 연화시킨 카렌듈라 꽃잎이 UVB에 의한 피부의 광노화를 억제시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 가열과 산처리의 복합처리를 통한 카렌듈라 꽃잎의 연화에서 처리시간, 온도, pH에 따른 연화 수준을 punctual test를 통해 비교 분석하였다. Hardness 값의 비료 분석을 통해 연화특성 및 효과가 처리 조건들에 의해 다름을 확인할 수 있었으며, 70oC 이상의 높은 온도에 의한 연화효과가 산처리에 의한 효과보다 더 큰 것을 확인할 수 있었다.
제조한 수용액에 카렌듈라 꽃잎을 넣어주고, 수용액에 교반시킨다. 교반시킨 수용액을 여러 온도(50, 70, 80, 90oC)와 처리시간(0, 30, 60, 90, 120 min)에 따른 다양한 열처리 조건에서 연화를 진행한다. 이렇게 연화가 완료된 꽃잎은 여과망을 이용해 정제수로 세척하여 실험에 사용하였다.
0 mm/sec로 설정하여 시험을 진행하였다. 꽃잎이 겹치는 부분없이 최대한 펼친 다음 꽃잎의 가운데 부분 측정하였다. 크기와 모양이 유사한 시료들을 가공처리 방법 당 10개씩 선발하여 그 질감 특성을 시험 평가하였으며, 이와 같은 시료선발 및 평가를 3회 반복 실시하였다.
24시간 배양 후 카렌듈라 추출물을 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 2400 µg/mL의 농도로 처리하고 1시간 동안 배양한다. 배양 후에 자외선 조사장치(Bio-Link BLX-312, Vilber Lourmat GmbH, France)를 이용하여 0.03 J/cm2의 자외선을 조사하여 준다. 이후 48시간 동안 배양하고 상층액을 채취하여 10,000×g에서 2분간 원심분리 시킨 후 상층액만 다시 모아 −80oC에서 보관하여 시료로 사용하였다.
세포 독성 측정은 CellToxTM Green Cytotoxicity Assay (Promega corpo-ration, G8743, Madison, WI, USA)를 사용하였으며, MMP-1 단백질 발현 측정은 Human Total MMP-1 DuoSet ELISA kit (R&D systems, DY901, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다.
3). 연화 정도를 비교하기 위한 실험 조건을 얻고자 연화된 꽃잎 시료들의 hardness 차이를 가장 크게 나타내는 시험 조건을 예비실험들을 통해 탐색하여 puncture test의 실험 조건으로 결정하였다.
우선 가공 처리되거나 처리되지 않은 카렌듈라 꽃잎들을 사각쟁반 위에 한 개씩 피고 plastic film으로 쟁반을 둘러 매우 짧게 건조시켜 평가 분석할 시료들을 준비하였다. 준비된 시료는 texture analyzer (TA.
우선 연화도에 따라 hardness 값의 차이가 나타났으며, peak의 아래부분이 넓어지며 완만히 상승하는 모습을 나타냈다. 이에 공정 온도, 처리시간, pH로 선정된 연화 공정 변수들의 연화도에 대한 영향력을 hardness 값의 비교함으로써 분석하였다(Fig. 4). 열처리와 산처리 모두 연화도에 대한 영향이 큰 것으로 나타났으나, 공정시간은 주요변수로 작용하지 않았다.
이후 2,400 µg/mL을 최고 농도로 하여 1/2씩 순차 희석한 후 배양 중인 세포에 직접 처리하고 UVB를 조사하였다.
이후 30분 동안 추가로 배양하고 Celltox 용액(Celltox green dye+buffer)를 각 well 당 100 µL씩 처리하고 잘 섞어준 뒤에 빛이 없는 공간에서 상온 20분 배양시킨다. 이후 Varioskan LUX multimode micro-plate reader (Varioskan LUX, Thermo SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA)을 이용하여 형광을 측정한다.
이후 48시간 동안 배양하고 상층액을 채취하여 10,000×g에서 2분간 원심분리 시킨 후 상층액만 다시 모아 −80oC에서 보관하여 시료로 사용하였다. 이후 명시된 protocol을 따라 Human Total MMP-1 DuoSet ELISA을 진행한다.
우선 가공 처리되거나 처리되지 않은 카렌듈라 꽃잎들을 사각쟁반 위에 한 개씩 피고 plastic film으로 쟁반을 둘러 매우 짧게 건조시켜 평가 분석할 시료들을 준비하였다. 준비된 시료는 texture analyzer (TA.XT Express, Stable micro systems, Surrey, UK)를 이용한 puncture test로 hardness를 측정함으로써 연화 수준을 비교분석 하였다. Probe (No.
가열공정과 산처리공정을 동시에 진행하는 복합공정에 의해 카렌듈라 꽃잎의 연화가 어느정도 진행되었는지 비교분석하기 위해 texture analyzer를 이용하여 punctual test를 진행하였다. 직경2 mm 원통형 probe를 이용하여 연화가공 처리된 카렌듈라 꽃잎 중앙을 관통하면서 발생하는 texture profile을 비교 분석하였다(Fig. 3). 연화 정도를 비교하기 위한 실험 조건을 얻고자 연화된 꽃잎 시료들의 hardness 차이를 가장 크게 나타내는 시험 조건을 예비실험들을 통해 탐색하여 puncture test의 실험 조건으로 결정하였다.
꽃잎이 겹치는 부분없이 최대한 펼친 다음 꽃잎의 가운데 부분 측정하였다. 크기와 모양이 유사한 시료들을 가공처리 방법 당 10개씩 선발하여 그 질감 특성을 시험 평가하였으며, 이와 같은 시료선발 및 평가를 3회 반복 실시하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast, Hs68)는 ATCC (American Type Culture Collection, PCS-201- 010, Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. 카렌듈라꽃은 프랑스산으로, Lessonia (Saint-Thonan, France)에서 구매하였다.
본 실험에 사용한 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast, Hs68)는 ATCC (American Type Culture Collection, PCS-201- 010, Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. 카렌듈라꽃은 프랑스산으로, Lessonia (Saint-Thonan, France)에서 구매하였다. 세포 독성 측정은 CellToxTM Green Cytotoxicity Assay (Promega corpo-ration, G8743, Madison, WI, USA)를 사용하였으며, MMP-1 단백질 발현 측정은 Human Total MMP-1 DuoSet ELISA kit (R&D systems, DY901, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복하여 실시하였으며, 결과분석은 GraphPad Prism 5.01 software (GraphPad Softwater, CA, USA)를 이용하여 통계 처리하였다. 통계적 유의성은 일원배치분산분석(one way ANOVA)로 유의성 검정을 시행하였으며(p<0.
통계적 유의성은 일원배치분산분석(one way ANOVA)로 유의성 검정을 시행하였으며(p<0.05), 사후검증으로 Duncan’s multiple range test를 수행하였다.
성능/효과
이후 2,400 µg/mL을 최고 농도로 하여 1/2씩 순차 희석한 후 배양 중인 세포에 직접 처리하고 UVB를 조사하였다. 48시간 배양하고 상층액을 따서 human total MMP-1 ELISA 실험을 진행하여 준 결과, 대조군 그룹에서 7,246 pg/mL의 농도였던 MMP-1 단백질이 UVB를 처리하여 주면 42,147 pg/mL로 증가한 것을 확인할 수 있었다. UVB가조사된 상태에서 카렌듈라 추출물을 처리할 경우, 카렌듈라 추출물의 농도 비례적으로 MMP-1 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
가열과 산처리의 복합처리를 통한 카렌듈라 꽃잎의 연화에서 처리시간, 온도, pH에 따른 연화 수준을 punctual test를 통해 비교 분석하였다. Hardness 값의 비료 분석을 통해 연화특성 및 효과가 처리 조건들에 의해 다름을 확인할 수 있었으며, 70oC 이상의 높은 온도에 의한 연화효과가 산처리에 의한 효과보다 더 큰 것을 확인할 수 있었다. 하지만 열처리에 의한 연화의 경우 에너지 소비가 큰 것을 고려할 때, pH 2.
48시간 배양하고 상층액을 따서 human total MMP-1 ELISA 실험을 진행하여 준 결과, 대조군 그룹에서 7,246 pg/mL의 농도였던 MMP-1 단백질이 UVB를 처리하여 주면 42,147 pg/mL로 증가한 것을 확인할 수 있었다. UVB가조사된 상태에서 카렌듈라 추출물을 처리할 경우, 카렌듈라 추출물의 농도 비례적으로 MMP-1 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 카렌듈라 추출물을 50, 100, 200, 400, 800, 1,600, 2,400 µg/mL의 농도로 처리하여 주면 MMP-1 단백질의 농도가 38,540, 35,593, 32,687, 21,020, 18,404, 13,953, 11,586 pg/mL로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
관찰된 연화처리 결과는 연화처리 공정 조건에 따라 달라지는 것이 관찰되었다. 우선 연화도에 따라 hardness 값의 차이가 나타났으며, peak의 아래부분이 넓어지며 완만히 상승하는 모습을 나타냈다.
9 N 이하의 낮은 hardness 값을 확인할 수 있었다(Fig 3B). 단단한 물질일수록 texture profile에서 peak이 매우 가파르게 상승하고 급격히 떨어지는 모양을 나타나는 것을 고려할 때, 연화 전리 전후에서 관찰할 수 있는 peak 모양의 변화는 연화로 인한 결과로 판단되었다.
대조군 그룹이 3.033의 형광값을 보였고, 카렌듈라 추출물을 100, 200, 400, 600, 800, 1,600, 2,400, 3,200, 4,000, 4,800, 5,600 µg/mL의 농도로 처리하였을 때에는 3.076, 3.075, 3.054, 3.104, 3.206, 6.535, 3.586, 6.689, 6.932, 7.127, 7.324의 형광값을 보이는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
1 N 정도로 hardness가 감소되는 것으로 조사되었다. 따라서 70oC 이상의 온도에서 연화처리를 할 경우에는 산처리여부와 상관없이 충분한 연화도를 얻을 수 있는 반면, 50oC 이하의 낮은 온도에서 처리할 경우에는 pH 2.5 이하의 산성조건에서도 60분 이상 처리를 필요로 함을 알 수 있었다. 즉 높은 온도의 연화공정은 빠른공정처리가 가능한 반면, 열처리 없이 또는 낮은 열처리 조건에서의 산처리의 경우 pH에 매우 민감하여, 60분 이상의 공정시간이 요구됨을 알 수 있었다.
3A). 반면 50, 70, 90oC의 온도, pH 2.5, 2.3, 2.1에서 30, 60, 90, 120분 동안 연화처리한 모든 시료에서는 비교적 완만한 형태의 peak를 보였고, 약 0.9 N 이하의 낮은 hardness 값을 확인할 수 있었다(Fig 3B). 단단한 물질일수록 texture profile에서 peak이 매우 가파르게 상승하고 급격히 떨어지는 모양을 나타나는 것을 고려할 때, 연화 전리 전후에서 관찰할 수 있는 peak 모양의 변화는 연화로 인한 결과로 판단되었다.
1 N 정도로 hardness가 감소되었다. 연화 처리온도 70oC 이상의 일 경우에는 산처리 여부나 pH에 의한 영향 없이 모두 0.1 N 정도로 hardness가 감소되는 것으로 조사되었다. 따라서 70oC 이상의 온도에서 연화처리를 할 경우에는 산처리여부와 상관없이 충분한 연화도를 얻을 수 있는 반면, 50oC 이하의 낮은 온도에서 처리할 경우에는 pH 2.
연화처리 공정으로 연화된 꽃잎의 texture profile을 처리하지 않은 시료와 비교분석한 결과, 연화처리한 모든 시료들이 연화처리하지 않은 시료(2.37±0.27 N)에 비해 hardness가 70% 이상 감소되었다.
온도와 pH의 영향 정도를 30분의 공정 처리 시간의 기준으로 비교 분석하였을 때, 50oC의 상대적으로 낮은 온도에서 산처리 하지 않은 시료의 경우(0.73±0.13 N)에도 70% 정도의 hardness의 감소가 나타났으며, pH 2.5에서 0.32±0.04 N, pH 2.3에서 0.20± 0.02 N, 그리고 pH 2.1에서 0.15±0.39 N로 조사되어 낮은 pH에서 더 큰 hardness의 감소가 관찰되었다.
UVB에 의한 MMP-1의 과발현이 카렌듈라 꽃잎을 처리하여 주면 농도의존적으로 감소하였다. 이를 통해 연화시킨 카렌듈라 꽃잎이 UVB에 의한 피부의 광노화를 억제시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 가열과 산처리의 복합처리를 통한 카렌듈라 꽃잎의 연화에서 처리시간, 온도, pH에 따른 연화 수준을 punctual test를 통해 비교 분석하였다.
2). 이를 통해 카렌듈라 추출물은 피부 세포에서 UVB에 의해 유도되는 MMP-1 단백질의 과발현을 억제할 수 있고, 그렇기 때문에 UVB에 의한 피부광노화를 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
5 이하의 산성조건에서도 60분 이상 처리를 필요로 함을 알 수 있었다. 즉 높은 온도의 연화공정은 빠른공정처리가 가능한 반면, 열처리 없이 또는 낮은 열처리 조건에서의 산처리의 경우 pH에 매우 민감하여, 60분 이상의 공정시간이 요구됨을 알 수 있었다.
카렌듈라 추출물을 50, 100, 200, 400, 800, 1,600, 2,400 µg/mL의 농도로 처리하여 주면 MMP-1 단백질의 농도가 38,540, 35,593, 32,687, 21,020, 18,404, 13,953, 11,586 pg/mL로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
39 N로 조사되어 낮은 pH에서 더 큰 hardness의 감소가 관찰되었다. 하지만 50oC의 온도에서도 처리시간이 60분을 넘어가면 산처리 여부에 따른 hardness 차이만 나타날 뿐 pH의 차이에 따른 영향은 나타나지 않았으며, 약 0.1 N 정도로 hardness가 감소되었다. 연화 처리온도 70oC 이상의 일 경우에는 산처리 여부나 pH에 의한 영향 없이 모두 0.
Hardness 값의 비료 분석을 통해 연화특성 및 효과가 처리 조건들에 의해 다름을 확인할 수 있었으며, 70oC 이상의 높은 온도에 의한 연화효과가 산처리에 의한 효과보다 더 큰 것을 확인할 수 있었다. 하지만 열처리에 의한 연화의 경우 에너지 소비가 큰 것을 고려할 때, pH 2.1에서는 50oC, 30분의 열처리만으로도 70oC 이상의 열처리 효과가 나타나므로, 이 연화처리 조건이 경제적으로 가장 효율적이라 판단되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
MMPs란 무엇인가?
Matrix metalloproteinases (MMPs)는 세포의 세포외기질(extracel-lular matrix, ECM)의 구성성분을 분해할 수 있는 효소이다(Sta-menkovic, 2003). 이 중 MMP-1은 피부 진피의 주요 구성성분인 1형 콜라겐(type-1 collagen)과 3형 콜라겐(type-3 collagen)을 분해하는 효소이며, 이 효소에 의해 피부의 1형 콜라겐이 분해되게 되면 피부의 ECM이 무너지게 되고, 이로 인해 주름이 형성되게된다(Chung, 2003).
MMP-1가 피부에 미치는 영향은?
Matrix metalloproteinases (MMPs)는 세포의 세포외기질(extracel-lular matrix, ECM)의 구성성분을 분해할 수 있는 효소이다(Sta-menkovic, 2003). 이 중 MMP-1은 피부 진피의 주요 구성성분인 1형 콜라겐(type-1 collagen)과 3형 콜라겐(type-3 collagen)을 분해하는 효소이며, 이 효소에 의해 피부의 1형 콜라겐이 분해되게 되면 피부의 ECM이 무너지게 되고, 이로 인해 주름이 형성되게된다(Chung, 2003). 이 MMP-1은 UVB에 의해 과발현될 수 있고, 그에 따라 피부광노화가 일어날 수 있게 된다.
카렌듈라 꽃잎은 어떤 상처의 치료제로 사용되었는가?
카렌듈라는 메리골드(마리골드), 금송화,금잔화, 마라빌라와 같은 다양한 이름으로 알려져 있고, 꽃 부분은 민간요법에서 많이 사용되어 왔다(Reuter 등, 2009). 꽃의 즙을 내거나 추출물 용액을 만들어 화상, 멍, 타박상, 자상, 발진, 피부 상처 등에 치료제로 사용되었다(Brown과 Dattner, 1998). 카렌듈라에는 스테로이드(steroids), 테르페노이드(terpenoids), 유리트리터페닉 알코올(free triterpenic alcohols), 에스테르화 트리터페닉 알코올(esterified triterpenic alcohols), 페놀릭산(phenolic acids), 플라보노이드(flavonoids) 등의 화학 물질이 존재한다.
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