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문제 정의
- 본 연구는 선행연구를 통해 칸디다성 질염의 원인인 Candida albicans에 항진균 효과가 있는 것으로 밝혀진 Lactobacillus salivarius MG242 균주를 열 전처리공정을 통해 열 스트레스에서의 생존율 증진 및 항진균 효과의 변화를 확인하였다.
제안 방법
- 37℃에서 18시간 동안 배양한 MG242 균주를 원심분리(7,191 g, 4℃, 10분)하여 0.1 Mphosphate-buffered saline(PBS, pH 7.2)으로 2번 세척한 후, 0.1 M PBS로 OD600이 1이 되도록 재현탁하였다. 재현탁한 균주는 water bath를 사용하여 40℃, 50℃, 60℃에서 40분까지 열 스트레스 실험을 수행한 후, 가장 높은 생균수를 보이는 전처리 온도를 열 스트레스 실험에 적용하였다.
- 5% glutaraldehyde(Junsei, Japan) 용액에 4℃에서 24시간 동안 고정화시킨후 에탄올로 탈수하여 시료를 준비하였다. Field Emission SEM(Hitach S-4300, Japan)을 이용하여 균주의 형태 변화를 관찰하였다.
- 열 스트레스 조건과 열 전처리 조건을 결정하기 위하여 다양한 온도에서 열 전처리를 한 후 열 스트레스를 가하는 실험을 수행하였다. MG242 균주를 40℃, 50℃, 60℃에서 각각 40분간 열 스트레스 내성을 측정하였다(Fig. 1). 40℃와 50℃에서는 40분 동안 생균수의 변화가 없었으나, 60℃에서는 처리 후부터 생균수가 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있다.
- MG242 균주의 열 전처리 시 EPS 생성을 확인하였다. EPS는 세균과 조류에서 광범위하게 생성하며,효모와 진균에서 덜 생성되는 것으로 알려져 있다(Sutherland, 1998).
- MG242 균주의 최적의 열 전처리 조건을 확인하기 위해 MRS 배지에서 37℃, 24시간 배양한 후 0.1 M PBS로 2번 세척한 후 OD600이 1이 되도록 재현탁하였다. 현탁액은 열 전처리를 진행한 것,chloramphenicol(100 μg/mL)을 포함(Hartke et al.
- Polysaccharide 농도는 phenol–sulfuric acid 방법을 통해 정량화 하였다.
- albicans 는 YM 배지에서 생균수를 확인하고, MG242 균주는 cycloheximide (100 μg/mL)를 도포한 MRS 배지에서 생균수를 확인하였다.
- , 2008). 따라서 MG242 균주를 47℃와 52℃에서 각각 15분간 처리하여 열 전처리를 진행하였고, 열 전처리된 MG242 균주를 60℃에서 40분간 노출시켜 열 전처리 효과를 확인하였다(Fig. 2). 실험결과, 47℃에서 열 전처리한 조건보다 52℃에서열 전처리를 진행한 조건에서 생존율이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
- 모든 시료는 UV–vis spectrophotometer(Ultrospec 2000; Amersham Pharmacia Biotech Inc., NJ, USA)를 이용하여 490 nm에서 측정하였다.
- 본 연구는 선행연구인 한국 여성의 질에서 분리한 Lactobacillus salivarius MG242 균주를 통해열 전처리를 통해 열 스트레스 조건에서의 생존율 증진 및 칸디다성 질염의 원인인 Candida albicans 에 항진균효과의 변화를 확인하였다. 최적의 열 전처리 조건에서 열 전처리를 진행한 결과,고온의 열 스트레스에서 높은 생존율을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
- 세포 외 다당체(Exopolysaccharide, EPS) 추출방법은 Liu와 Fang(2002)의 방법을 수정하여 진행하였다. 열 전처리한 균주와 열 전처리하지 않은 균주를 각각 멸균증류수에 희석한 후, 원심분리(8,000 g, 4℃, 20분)하였다.
- 재현탁한 균주는 water bath를 사용하여 40℃, 50℃, 60℃에서 40분까지 열 스트레스 실험을 수행한 후, 가장 높은 생균수를 보이는 전처리 온도를 열 스트레스 실험에 적용하였다. 스트레스에 노출된 시간마다 MRS 배지에 배양액을 접종하고, 37℃에 24시간 배양한 후 생균수를 확인하였다.
- 열 스트레스 조건과 열 전처리 조건을 결정하기 위하여 다양한 온도에서 열 전처리를 한 후 열 스트레스를 가하는 실험을 수행하였다. MG242 균주를 40℃, 50℃, 60℃에서 각각 40분간 열 스트레스 내성을 측정하였다(Fig.
- 열 스트레스에 노출되었을 때 열 전처리가 세포의 형태에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 SEM 촬영을 수행하였다. 열 전처리한 균주와 열 전처리하지 않은 균주를 열 스트레스 조건인 60℃에 40분간 노출시킨 후 2.
- 열 전처리 과정과 열 전처리 후 열 스트레스에 노출이 되었을 때, MG242 균주의 표면변화를 관찰하기 위해 주사전자현미경을 통해 확인하였다(Fig. 4). MG242 배양온도인 37℃에서의 균형태는 세포표면의 변화가 없는 것을 확인할 수 있었으나(Fig.
- 열 전처리된 MG242 균주의 항진균효과를 확인하기 위해 C. albicans 와 혼합배양을 통해 항진균효과를 확인하였다. 열 전처리된 MG242 균주와 C.
- 열 전처리한 MG242 균주의 C. albican 에 대해 정량적인 항진균 효과를 확인하기 위해, 열 전처리한 MG242 균주와 C. albicans 를 혼합 배지(MRS 액체 배지와 YM 액체 배지를 1,1(v/v)로 혼합)에균의 농도가 최종적으로 105 CFU/mL가 되도록 각각 접종하였다. 37℃에서 24시간 정치배양 후,C.
- 세포 외 다당체(Exopolysaccharide, EPS) 추출방법은 Liu와 Fang(2002)의 방법을 수정하여 진행하였다. 열 전처리한 균주와 열 전처리하지 않은 균주를 각각 멸균증류수에 희석한 후, 원심분리(8,000 g, 4℃, 20분)하였다. 세포가 제거된 상등액은 최종농도 10%가 되도록 trichloroaceticacid를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 정치시킨 후, 3배수 95% 에탄올을 첨가하여 4℃에서 15시간 동안 침전시켰다.
- 1 M PBS로 OD600이 1이 되도록 재현탁하였다. 재현탁한 균주는 water bath를 사용하여 40℃, 50℃, 60℃에서 40분까지 열 스트레스 실험을 수행한 후, 가장 높은 생균수를 보이는 전처리 온도를 열 스트레스 실험에 적용하였다. 스트레스에 노출된 시간마다 MRS 배지에 배양액을 접종하고, 37℃에 24시간 배양한 후 생균수를 확인하였다.
- 전처리 동안에 유도되는 단백질 합성이 열 스트레스에 노출되었을 때 내성을 유도하는지 확인하기 위해 단백질 합성 저해재인 chlorampenicol을 처리하여 실험을 진행하였다. Fig.
- 현탁액은 열 전처리를 진행한 것,chloramphenicol(100 μg/mL)을 포함(Hartke et al., 1996)하여 열 전처리한 것으로 나누어 47℃, 52℃에서 각각 15분 동안 배양한 후, 60℃에서 40분간 노출시켜 MRS 배지에 배양액을접종하고, 37℃에 24시간 배양한 후 생균수를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 균주는 선행연구를 통해 건강한 한국여성의 질에서 분리한 유산균주 중 항균활성 및 항진균활성이 우수한 L. salivarius MG242(MG242) 균주를 선택하여 실험을 진행하였다(Junget al., 2017; Kang et al., 2018). 배지는 Lactobacilli MRS broth(Difco, MI, USA)를 사용하여 37℃에서 혐기 조건으로 배양하여 실험에 사용하였다.
- 열 스트레스에 노출되었을 때 열 전처리가 세포의 형태에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 SEM 촬영을 수행하였다. 열 전처리한 균주와 열 전처리하지 않은 균주를 열 스트레스 조건인 60℃에 40분간 노출시킨 후 2.5% glutaraldehyde(Junsei, Japan) 용액에 4℃에서 24시간 동안 고정화시킨후 에탄올로 탈수하여 시료를 준비하였다. Field Emission SEM(Hitach S-4300, Japan)을 이용하여 균주의 형태 변화를 관찰하였다.
- 배지는 Lactobacilli MRS broth(Difco, MI, USA)를 사용하여 37℃에서 혐기 조건으로 배양하여 실험에 사용하였다. 칸디다 질염유발 원인균인 Candida albicans SC5314는 한국미생물보존센터에서 분양받았으며, YM(1% glucose, 0.3% malt extract,0.5% peptone, and 0.3% yeast extract)배지를 사용하여 37℃에서 배양하였다.
성능/효과
- 1). 40℃와 50℃에서는 40분 동안 생균수의 변화가 없었으나, 60℃에서는 처리 후부터 생균수가 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있다. 프로바이오틱스 균주로 사용하기 위해서는 최종 제품에서도 생균의 형태로 존재해야 한다.
- , 2001). 본 연구에서는 열 전처리 전후 MG242 균주의 EPS 생성량은 유의적인 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다. 이는 MG242 균주의 경우, EPS 생성이 열 전처리 후 열 스트레스에 대한 생존율에 영향을 미치는 않는 것이라 사료된다.
- 2). 실험결과, 47℃에서 열 전처리한 조건보다 52℃에서열 전처리를 진행한 조건에서 생존율이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 높은 온도에서 균주의 가장 큰 문제는 단백질 변성과 응집이 일어나며(Somero, 1995), 열 스트레스에 대한 반응으로 리보솜,RNA, 막 유동성의 변화와 같은 불안정성이 일어난다(Hansen et al.
- 4B). 열 전처리 직후(Fig.4C)에는 세포표면이 신장된 형태를 보이나 유지가 되었으며, 열 전처리 후 열 스트레스에 노출되었을 때(Fig. 4D), 세포표면의 응집효과는 일부 일어나지만 열 스트레스 조건에 비해 형태가 유지되는 것을 확인할 수 있었다. Scheie와 Ehrenspeck(1973)의 연구에 의하면 55℃ 열에 노출 시 세포표면의 단백질이 변형되고, peptidoglycan층이 약해진다고 알려져 있다.
- albicans 와 혼합배양을 통해 항진균효과를 확인하였다. 열 전처리된 MG242 균주와 C. albicans 를 혼합배양 시 현저하게 C. albicans의 생균수가 감소하였으며, 이를 통해 MG242 균주는 열 전처리 전과 후의 C. albican 에 대한 항진균효과는 차이가 없는 것을 확인할 수 있다(Fig. 5). 이는 유산균이 혼합배양 시 항진균 물질을 생성함에 따라 저해효과가 발생하는 것으로 알려져 있다(Reid, 2001; Mastromarino et al.
- , 2014). 열전처리에 의한 고온 내성 증진은 Lactobacillus paracasei, L. acidophilus, L. casei, Bifidobacteriumbifidum과 같이 다양한 유산균에서 그 효과가 확인되었다. 이러한 전처리 효과는 스트레스 조건에서 발현된 방어기작이 다른 스트레스에 대한 내성에 영향을 미치는 cross protection 효과의 가능성을 보여주고 있다(Paz et al.
- 본 연구는 선행연구인 한국 여성의 질에서 분리한 Lactobacillus salivarius MG242 균주를 통해열 전처리를 통해 열 스트레스 조건에서의 생존율 증진 및 칸디다성 질염의 원인인 Candida albicans 에 항진균효과의 변화를 확인하였다. 최적의 열 전처리 조건에서 열 전처리를 진행한 결과,고온의 열 스트레스에서 높은 생존율을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 열 전처리 후에도 C.
후속연구
- 최적의 열 전처리 조건에서 열 전처리를 진행한 결과,고온의 열 스트레스에서 높은 생존율을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 열 전처리 후에도 C.albicans 에 대한 항진균효과는 변화가 없는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 향후 L. salivariusMG242 균주를 프로바이오틱스로써 대량생산의 가능성을 확인하고, 질 건강을 위한 프로바이오틱스의 주요한 소재로 활용될 수 있을 것이라 사료된다.
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