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문제 정의
- 따라서 본 연구는 노균병 저항성 유전자 후보군을 발굴 및 동정하여 화학적 방제가 아닌 재배시환경에 친화적인 노균병 저항성 품종을 탐색하고자 bioinformatics 분석 기술을 이용하여 감수성 계통인 B73, CML270과 저항성 계통인 CML288, Ki3 및 Ki11에서 예상 전사체를 발굴하였다. 예상 유전자들의 저항성과 감수성 계통에서 발현을 검정하여 노균병 저항성 관련 후보 유전자들을 선발하여 옥수수 재배시 품종선택 및 살균제 살포 감소 등 토양오염을 방지할 수 있는 친환경 품종 개발을 위한 유전자 선발을 본 연구로의 목표로 한다.
- 본 연구는 옥수수 재배 시 환경에 영향을 미치는 노균병 저항성과 관련된 유전자 후보군을 탐색해서 노균병으로 인한 토양오염과 옥수수 생산량 감소를 해결하기 위하여 노균병 저항성 품종을 효율적으로 발굴하기 위한 연구이다. 옥수수의 6번 염색체의 152,892,333과 154,335,437 사이에 있는 노균병 저항성 유전자를 탐색하였으며 이 부분에 존재할 것으로 예상되는 전사체에서 38개의 프라이머 세트를 디자인하여 이 중 16개의 예측 전사체를 가려 내었다.
- 본 연구는 옥수수의 노균병 저항성 후보 유전자 군을 발굴하기 선행QTL 분석을 바탕으로 6번 염색체의 노균병 예상 전사체를 분석하고 발현을 검정한 실험이다. 이를 통하여 발굴된 5개의 후보 유전자군(OFP전사인자, bZIP101 전사인자, Ppr과 미확인 유전자 2개)는 후속 연구를 통하여 옥수수 노균병이 일으키는 피해에 대응할 방법에 기여 할 것으로 기대된다.
- Primary screening PCR을 통해 선발된 16개의 프라이머는 대표 품종이며 감수성 계통인 B73과 저항성 품종인 Ki11에서 각 건강한(healthy) 샘플과 노균병 감염된(infected) 샘플로 구분하여 RT-PCR을 수행하였다. 본 연구에서 사용된 B73과 Ki11은 노균병 감수성과 저항성의 대표 품종이며 또한 두 품종의 F7 세대 mapping population을 육성하고 있기 때문에 추후 노균병 MAS (Maker Assisted Selection)으로 활용하기 위하여 두 품종에서 우선적으로 발현 검정을 수행하였다.
- 따라서 본 연구는 노균병 저항성 유전자 후보군을 발굴 및 동정하여 화학적 방제가 아닌 재배시환경에 친화적인 노균병 저항성 품종을 탐색하고자 bioinformatics 분석 기술을 이용하여 감수성 계통인 B73, CML270과 저항성 계통인 CML288, Ki3 및 Ki11에서 예상 전사체를 발굴하였다. 예상 유전자들의 저항성과 감수성 계통에서 발현을 검정하여 노균병 저항성 관련 후보 유전자들을 선발하여 옥수수 재배시 품종선택 및 살균제 살포 감소 등 토양오염을 방지할 수 있는 친환경 품종 개발을 위한 유전자 선발을 본 연구로의 목표로 한다.
제안 방법
- 1 μg의 total RNA는 Power cDNA synthesis kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다.
- PCR 수행조건은 95°C에서 10분 간 변성과정(denature step)을 유지하고, 40 cycle (95°C 30 초, 56~59°C 10초, 72°C 20초)을 진행한 후 melting curve 를 65°C에서 95°C까지 진행하여 상대적 발현을 확인하였다.
- 프라이머 mismatch로 인하여 부정확한 PCR 증폭이 되는 프라이머들은 RT-PCR에서 일정한 발현을 보기 어렵다고 판단하여 프라이머를 다시 디자인하였으며 유사한 결과가 반복되는 경우 해당 프라이머는 RT-PCR에서 제외하였다. Primary screening PCR을 통해 선발된 16개의 프라이머는 대표 품종이며 감수성 계통인 B73과 저항성 품종인 Ki11에서 각 건강한(healthy) 샘플과 노균병 감염된(infected) 샘플로 구분하여 RT-PCR을 수행하였다. 본 연구에서 사용된 B73과 Ki11은 노균병 감수성과 저항성의 대표 품종이며 또한 두 품종의 F7 세대 mapping population을 육성하고 있기 때문에 추후 노균병 MAS (Maker Assisted Selection)으로 활용하기 위하여 두 품종에서 우선적으로 발현 검정을 수행하였다.
- 3. RT-PCR analysis of candidate genes for downy mildew resistance predicted using the designed primer set with B73 Health, B73 Infected, Ki11 Health and Ki11-infected tissues. Data represent mean±SD (n=3) of three replicates.
- 프라이머 디자인은 수집된 예상전사체 염기서열을 바탕으로 유전자의 엑손 부분을 이용하여 PCR product가 200 bp 미만이 되도록 제작하였다(Table 1). RT-PCR을 수행하기 위하여 유전자의 엑손 부분을 참고하여 NCBI-Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)를 이용하여 프라이머를 제작하였다.
- , Seoul, Korea)를 이용하여 추출하였다. 건강한 옥수수 잎과 노균병에 감염된 옥수수 잎 조직을 액체 질소로 급속 냉각 후에 막자사발을 이용하여 마쇄하였다. 곱게 분쇄된 샘플 100 mg을 정량하여 추출버퍼에 균일하게 잘 녹여준다.
- 공주대학교 연구 포장과 온실에서 생육시킨 옥수수의 잎과 캄보디아 프롬펜의 연구포장에서 노균병에 감염된 옥수수를 비교하였다. 노균병은 활물기생 병원균이므로 국 내 반입이 불가능하여 프롬펜 현지 연구포장의 감염 식물체와 간접 비교 하였다.
- 공주대학교 연구 포장과 온실에서 생육시킨 옥수수의 잎과 캄보디아 프롬펜의 연구포장에서 노균병에 감염된 옥수수를 비교하였다. 노균병은 활물기생 병원균이므로 국 내 반입이 불가능하여 프롬펜 현지 연구포장의 감염 식물체와 간접 비교 하였다. 공주대학교 연구 포장의 건강한 옥수수 잎은 짙은 녹색을 띠고 있으며 줄기가 탄탄한 형상을 나타내고 있다.
- 또한, qRT-PCR 결과 Cq값 및 Cq평균값을 산출했으며, 2-ΔΔCt method (Livak and Schmittgen 2001)를 이용하여 각 유전자의 상대적 발현값을 확인하였다. 모든 PCR 분석은 세 번의 반복 수행을 통해 얻은 데이터를 활용하여 actin1 을 대조군으로 놓고 각 저항성 유전자 후보군의 발현 패턴을 분석하였다.
- 이를 통하여 B73과 CML270은 감수성으로 확인되었으며, Ki11, Ki3, CML228은 저항성으로 선발되었다. 본 연구에서는 B73, CML270, Ki11, Ki3, CML228에 대하여 노균병을 접종한 후 저항성 품종에서만 발현이 높아지는 전사체를 노균병 저항성 관련 후보 유전자군으로 평가하였다.
- 곱게 분쇄된 샘플 100 mg을 정량하여 추출버퍼에 균일하게 잘 녹여준다. 이후 과정은 제조사의 표준 매뉴얼을 따라 수행되었으며, 추출한 RNA는 Biospec-nano (SHIMADZU Corporation, Kyoto, Japan)을 이용하여 측정하였으며 전기영동을 통하여 추출된 RNA의 확인하였다. 1 μg의 total RNA는 Power cDNA synthesis kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다.
- 전사체 발현 분석을 통하여 노균병 저항성에 관련이 있을 것으로 사료되는 5개의 전사체의 염기서열을 분석하여 NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 annotation을 검정하였다. 선발된 전사체는 uncharacterized LOC 100277843, hypothetical protein, bZIP transcription factor, OFP (Ovate Family Protein) transcription factor, pentatricopeptide repeat (Ppr)-containing protein으로 최종 확인되었다(Table 2).
- 옥수수의 6번 염색체의 152,892,333과 154,335,437 위치 사이의 예상전사체 정보로 제작된 프라이머는 GC 비율이 평균적으로 50%이며 예상 PCR 결과물은 101bp~199bp으로 증폭될 수 있도록 38쌍으로 제작되었다. 제작된 프라이머는 노균병 감수성 계통이며 국제 옥수수의 표준 품종인 B73의 genomic DNA를 이용하여 프라이머의 정상적인 증폭 여부를 검정하였다(Fig. 2). 각각의 프라이머들은 PCR screening 과정을 통하여 100 bp~2 kbp의 PCR 결과물을 생성하였다.
- 최종 선발된 6개의 전사체들은 5개의 품종(감수성: B73, CML270, 저항성: Ki11, CML228, Ki3)의 각각 건강한 cDNA와 병에 감염된 cDNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다(Fig. 4).
- 프라이머 디자인은 수집된 예상전사체 염기서열을 바탕으로 유전자의 엑손 부분을 이용하여 PCR product가 200 bp 미만이 되도록 제작하였다(Table 1). RT-PCR을 수행하기 위하여 유전자의 엑손 부분을 참고하여 NCBI-Primer Blast (https://www.
- 합성된 cDNA는 Rotor gene-Q(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 gene-specific primer set로 quantitative RT-PCR을 수행하였다(Table 1). PCR 수행조건은 95°C에서 10분 간 변성과정(denature step)을 유지하고, 40 cycle (95°C 30 초, 56~59°C 10초, 72°C 20초)을 진행한 후 melting curve 를 65°C에서 95°C까지 진행하여 상대적 발현을 확인하였다.
- 2017), 정밀 QTL 분석을 통하여 옥수수 6번 염색체의 152,892,333과 154,335,437 사이 부분이 노균병 저항성과 높은 상관관계가 있는 것으로 확인되었다(in preparation). 해당지역의 염기서열은 MaizeGDB(maizeGDB.org)를 이용하여 확보하였으며 수집된 염기서열에 존재할 것으로 예측되는 전사체(predicted transcript)는 Ensembl Plants (plants.ensembl.org)를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- CML228, Ki3, Ki11 계통에 대한 노균병에 감염되지 않은 건강한 샘플은 공주대학교 온실에서 발아시켜 4주 동안 주간온도 30°C, 야간온도 27°C, 습도 50%를 유지하며 15시간 광조건, 9시간 암조건이 일정하게 반복되도록 구축한 온실 안에서 포트 지름 21 cm, 높이 18.5cm에서 생육하였다.
- 노균병 저항성 후보군 유전자를 탐색하기 위하여 reference gene으로는 다양한 환경에서도 안정적으로 발현되는 housekeeping gene인 옥수수의 actin1 유전자(accession No. J01238 at genebank)를 선택하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 sense primer: 5ʹ-GATTCCTGGGATTGCCGAT-3ʹ, antisense primer: 5ʹ-TCTGCTGCTGAAAAGTGCTGAG-3ʹ이다(Manoli et al.
- 미국 농무성을 통하여 NAM (Nested Association Mapping) 집단의 모본으로 B73, CML228, CML270, Ki3, Ki11를 분양받았다. 노균병에 감염된 옥수수 샘플은 캄보디아 프롬펜의 연구포장에서 재배되는 옥수수에 접종하여 수집하였다(Kim et al. 2017). CML228, Ki3, Ki11 계통에 대한 노균병에 감염되지 않은 건강한 샘플은 공주대학교 온실에서 발아시켜 4주 동안 주간온도 30°C, 야간온도 27°C, 습도 50%를 유지하며 15시간 광조건, 9시간 암조건이 일정하게 반복되도록 구축한 온실 안에서 포트 지름 21 cm, 높이 18.
- 미국 농무성을 통하여 NAM (Nested Association Mapping) 집단의 모본으로 B73, CML228, CML270, Ki3, Ki11를 분양받았다. 노균병에 감염된 옥수수 샘플은 캄보디아 프롬펜의 연구포장에서 재배되는 옥수수에 접종하여 수집하였다(Kim et al.
- 본 연구는 옥수수 재배 시 환경에 영향을 미치는 노균병 저항성과 관련된 유전자 후보군을 탐색해서 노균병으로 인한 토양오염과 옥수수 생산량 감소를 해결하기 위하여 노균병 저항성 품종을 효율적으로 발굴하기 위한 연구이다. 옥수수의 6번 염색체의 152,892,333과 154,335,437 사이에 있는 노균병 저항성 유전자를 탐색하였으며 이 부분에 존재할 것으로 예상되는 전사체에서 38개의 프라이머 세트를 디자인하여 이 중 16개의 예측 전사체를 가려 내었다. 또한 RT-PCR을 수행하여 감염된 Ki11의 발현이 높은 7개의 전사체로 5개의 품종에 대하여 건강한 샘플과 감염된 샘플을 검정하였고 최종 5개의 후보 유전자군[알려지지 않은 미확인 유전자 2개, OFP transcription factor, bZIP transcription factor, pentatricopeptide repeat (Ppr)]이 발견되었다.
- 옥수수의 6번 염색체의 152,892,333과 154,335,437 위치 사이의 예상전사체 정보로 제작된 프라이머는 GC 비율이 평균적으로 50%이며 예상 PCR 결과물은 101bp~199bp으로 증폭될 수 있도록 38쌍으로 제작되었다.
이론/모형
- 또한, qRT-PCR 결과 Cq값 및 Cq평균값을 산출했으며, 2-ΔΔCt method (Livak and Schmittgen 2001)를 이용하여 각 유전자의 상대적 발현값을 확인하였다.
성능/효과
- GRMZM2G091201 전사체는 B73에서 발현은 낮으나 건강한 샘플의 발현이 감염된 샘플의 발현보다 다소 높았다. CML270은 다른 품종에 비하여 가장 발현이 높게 나타났으며 특히 건강한 샘플보다 감염된 샘플이 유의차 있게 발현이 높게 나타났다. Ki11에서는 감염된 샘플에서 건강한 샘플보다 발현이 높게 나타났다.
- 4). GRMZM2G067122 전사체는 B73 품종에서는 건강한 샘플, 감염된 샘플 모두에서 발현이 극히 낮았다. 반면 같은 감수성 계통인 CML270에서는 건강한 샘플, 감염된 샘플의 발현이 B73에서의 발현에 비하여 매우 높았다.
- 반면 저항성 품종인 Ki11, CML228, Ki3의 경우 감염된 샘플에서는 발현이 건강한 샘플보다 높게 나타났으며, 저항성 품종에서도 Ki11, CML288, Ki3 순으로 발현이 높았다. GRMZM2G091201 전사체는 B73에서 발현은 낮으나 건강한 샘플의 발현이 감염된 샘플의 발현보다 다소 높았다. CML270은 다른 품종에 비하여 가장 발현이 높게 나타났으며 특히 건강한 샘플보다 감염된 샘플이 유의차 있게 발현이 높게 나타났다.
- 이 전사체는 노균병 저항성과 관련있는 유전자일 것으로 사료된다. GRMZM2G129247 전사체는 감염된 CML228에서 가장 높은 발현을 나타냈으며 두 번째로 발현이 높은 감염된 Ki11에서의 발현이 감수성 계통의 건강한 샘플들, 감염된 샘플들보다 발현이 높게 나타났다. 저항성 품종의 감염된 샘플에서 GRMZM2G129 247 전사체 발현이 건강한 샘플에 비하여 증가하였기 때문에 노균병 저항성이 연관되어 있다고 예상하였다.
- 기존 연구를 통하여 노균병 저항성 부분이 옥수수 6번 염색체에 위치(Chr6: 146,503,155-147,912,501)하는 것으로 밝혀졌으며(Kim et al. 2017), 정밀 QTL 분석을 통하여 옥수수 6번 염색체의 152,892,333과 154,335,437 사이 부분이 노균병 저항성과 높은 상관관계가 있는 것으로 확인되었다(in preparation). 해당지역의 염기서열은 MaizeGDB(maizeGDB.
- 옥수수의 6번 염색체의 152,892,333과 154,335,437 사이에 있는 노균병 저항성 유전자를 탐색하였으며 이 부분에 존재할 것으로 예상되는 전사체에서 38개의 프라이머 세트를 디자인하여 이 중 16개의 예측 전사체를 가려 내었다. 또한 RT-PCR을 수행하여 감염된 Ki11의 발현이 높은 7개의 전사체로 5개의 품종에 대하여 건강한 샘플과 감염된 샘플을 검정하였고 최종 5개의 후보 유전자군[알려지지 않은 미확인 유전자 2개, OFP transcription factor, bZIP transcription factor, pentatricopeptide repeat (Ppr)]이 발견되었다. 본 연구의 결과로 추가적인 실험 설계를 통해 5개의 후보 유전자군에 대한 재검정을 통하여 확실한 노균병 저항성 유전자를 발굴하고 이를 노균병 저항성 품종 개발 및 방재에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 그러나 건강한 샘플과 감염된 샘플의 발현의 차이가 유의차가 없기 때문에 GRMZM2G067122 전사체는 CML270에서 발현이 자연스럽게 높아지는 전사체로 예상된다. 반면 저항성 품종인 Ki11, CML228, Ki3의 경우 감염된 샘플에서는 발현이 건강한 샘플보다 높게 나타났으며, 저항성 품종에서도 Ki11, CML288, Ki3 순으로 발현이 높았다. GRMZM2G091201 전사체는 B73에서 발현은 낮으나 건강한 샘플의 발현이 감염된 샘플의 발현보다 다소 높았다.
- cgi)에서 annotation을 검정하였다. 선발된 전사체는 uncharacterized LOC 100277843, hypothetical protein, bZIP transcription factor, OFP (Ovate Family Protein) transcription factor, pentatricopeptide repeat (Ppr)-containing protein으로 최종 확인되었다(Table 2). OFP transcription factor는 식물의 형태적 외관을 조절하는 유전자로 알려져 있다(Lin et al.
- 종합적인 RT-PCR 분석을 통하여 저항성 품종인 Ki11이 노균병에 감염되었을 때 발현이 유전자 중심으로 최종 6개의 유전자(GRMZM2G171139, GRMZM2G122709, GRM ZM2G091201, GRMZM2G129288, GRMZM2G129247, GRMZM2G067122)를 선발하였다.
- 프라이머 0829와 1058의 경우 서로 유사한 발현 양상을 보이고 있는데 감염된 B73에서의 발현이 건강한 B73에서의 발현보다 매우 높으며 Ki11에서는 건강한 샘플, 감염된 샘플 둘다 건강한 B73에서의 발현보다 낮다. 프라이머 1139와 2709는 4개의 샘플에서 모두 발현이 되었으나 감수성 계통의 B73에서의 발현보다 저항성 계통의 Ki11의 발현이 더 높으며 각각 건강한 샘플, 감염된 샘플에서 비교하여도 높은 발현 양상을 확인할 수 있었다. 프라이머 2410과 6140은 감염된 B73에서의 발현이 다른 3개의 샘플보다 확연히 높은 발현을 보였다.
- 또한, 저항성 계통인 Ki11에서의 건강한 샘플과 감염된 샘플 모두에서 발현이 낮기 때문에 프라이머 2410과 6140는 노균병 저항성과 관련된 유전자가 아니라는 가능성을 간접적으로 증명한다. 프라이머 1201는 Ki11에서의 발현이 B73보다 매우 높으며 특히, 감염된 샘플의 경우에는 건강한 샘플보다 약 1.5배 가량 발현이 높은 것으로 나타났다. 프라이머 4216은 4개의 샘플에서 발현이 나타났으나 건강한 Ki11에서의 발현이 매우 높았으며, 감염된 Ki11에서의 발현이 감염된 B73에서의 발현보다 낮고 건강한 B73에서의 발현과 비슷하여 프라이머 4216은 노균병 저항성과는 연관성을 획득하기 어렵다고 사료되며, 프라이머 6190은 B73과 Ki11 두 품종에서 건강한 샘플의 발현이 감염된 샘플의 발현보다 낮게 나타나는데 품종 간 발현 양상이 유사하다.
- 프라이머 7118, 7122, 9247은 서로 발현 양상이 서로 유사하며, 다른 3개의 샘플에 비해 감염된 Ki11에서의 고발현 양상이 나타났으며 이는 노균병 저항성 유전자와 연관성을 가진다고 추론되며, 저항성 품종에서 특이적으로 발현하는 유전자가 관여되었을 것으로 사료된다. 프라이머 9288은 감염된 Ki11에서의 발현이 건강한 B73에서의 발현보다 약 2.5배 정도 높으며, 모든 샘플에서 발현되었고 저항성 계통의 건강한 Ki11에서의 발현보다 감염된 Ki11의 발현이 높은 것으로 나타났다. 이를 통해 노균병 저항성과 연관된 유전자로 추정할 수 있다.
후속연구
- 2013). 본 연구를 통해 발굴한 bZIP101 전사인자는 아직 그 기능이 많이 알려져 있지 않으므로 직접적인 노균병 저항성 유전자라고 판단할 수는 없으나 추가 실험을 통하여 가능성을 검정 할 필요가 사료된다. Kim et al.
- 또한 RT-PCR을 수행하여 감염된 Ki11의 발현이 높은 7개의 전사체로 5개의 품종에 대하여 건강한 샘플과 감염된 샘플을 검정하였고 최종 5개의 후보 유전자군[알려지지 않은 미확인 유전자 2개, OFP transcription factor, bZIP transcription factor, pentatricopeptide repeat (Ppr)]이 발견되었다. 본 연구의 결과로 추가적인 실험 설계를 통해 5개의 후보 유전자군에 대한 재검정을 통하여 확실한 노균병 저항성 유전자를 발굴하고 이를 노균병 저항성 품종 개발 및 방재에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구는 옥수수의 노균병 저항성 후보 유전자 군을 발굴하기 선행QTL 분석을 바탕으로 6번 염색체의 노균병 예상 전사체를 분석하고 발현을 검정한 실험이다. 이를 통하여 발굴된 5개의 후보 유전자군(OFP전사인자, bZIP101 전사인자, Ppr과 미확인 유전자 2개)는 후속 연구를 통하여 옥수수 노균병이 일으키는 피해에 대응할 방법에 기여 할 것으로 기대된다.
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