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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내 토종종계 초생추들을 이용하여 발생시기 및 육성계절에 따른 계군 별 열 스트레스 반응 정도 및 생산성을 비교하고자 한 것으로 12월에 부화하여 겨울철 저온에서 육성된 닭들과 7월에 부화하여 여름철 고온에서 육성된 닭들 간 텔로미어 함량과 Heat Shock Proteins (HSPs) 유전자 발현율을 분석하여 열 스트레스 반응 정도를 비교하고, 생존율, 성장능력 및 산란능력을 조사하여 생산능력을 비교 고찰하였다.
제안 방법
- Quantitative-PCR 을 위한 반응물은 cDNA 2 μL(50 ng/μL), SYBR Green(Roche, GmbH, Mannheim, Germany) 10 μL, primer(5 pmol/μL) 각각 0.5 μL 및 ddH 2 O 7 μL를 넣어 최종 volume이 20 μL이 되도록 혼합하고 real-time PCR machine(Model LC480, Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 95℃에서 5분 최초 변성시킨 후 95℃ 10초 변성, 60℃ 30초 접합, 72℃ 10초간 신장 반응을 40회 반복하면서 실시간 형광 모니터링하였다.
- Table 2는 여름 및 겨울철에 발생하여 육성된 계군 간의 생존율을 제시한 것으로 0∼15주까지 육성기와 16∼40주까지 산란기로 나누어 분석하였다.
- 국내 토종종계를 대상으로 여름철과 겨울철에 각각 발생 하여 육성된 개체들 간의 생산능력을 비교 분석하고자 7월에 발생된 934수와 11월에 발생된 1,156수에 대해 각각 생존율, 체중, 초산일령, 난중 및 일계산란율을 발생 후부터 40 주령까지 조사하였다. 각 개체별 체중은 부화 직후부터 20 주까지는 2주 간격으로 측정하고, 이후 산란기에는 4주 간격으로 측정하였다. 여름 및 겨울철에 발생하여 육성된 계군 간 평균 체중의 변화는 Fig.
- 1% Nonidet P-40)에서 2분간 세척하고, anti-digoxigenin-fluorescein (Boehringer Mannheim)으로 형광접합 후 PN buffer로 3회 세척하고 건조시켰다. 과정을 마친 표본은 propidium iodide solution(Sigma Chem)으로 염색하고 적녹 파장대의 필터가 부착된 형광현미경(Model AX-70, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰 후 개체 별 100개 이상의 핵을 디지털 카메라(Model DP-70, Olympus, Tokyo, Japan)로 촬영하였다. 촬영된 표본은 이미지 분석프로그램(MetaMorphⓇ, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 텔로미어 함량을 측정하고 분석하였다.
- 국내 토종종계를 대상으로 발생 및 육성 계절에 따른 텔로미어 길이를 비교하고자 여름철 및 겨울철 발생한 병아리들의 백혈구 세포 내 텔로미어 함량과 이의 감축 정도를 분석하였다. Table 4는 여름 및 겨울철에 발생하여 육성된 개체들 간의 10주령, 20주령 및 40주령 때 텔로미어의 함량 분석 결과이다.
- 국내 토종종계를 대상으로 여름철과 겨울철에 각각 발생 하여 육성된 개체들 간의 생산능력을 비교 분석하고자 7월에 발생된 934수와 11월에 발생된 1,156수에 대해 각각 생존율, 체중, 초산일령, 난중 및 일계산란율을 발생 후부터 40 주령까지 조사하였다. 각 개체별 체중은 부화 직후부터 20 주까지는 2주 간격으로 측정하고, 이후 산란기에는 4주 간격으로 측정하였다.
- 닭 텔로미어 함량 분석은 혈액 내 백혈구 세포를 대상으로 Sohn et al. (2012)과 Cho et al. (2016)이 제시한 방법을 일부 변형하여 형광접합보인법(Fluorescence in situ Hybridization)으로 분석하였다. 텔로미어 함량 분석에 이용할 telomeric DNA probe는 CCCTAA가 7번 반복된 단일 oligomers를 primer로 하여 PCR로 증폭 후 Dig-PCR probe synthesis kit(Roche, Mannheim, Germany)로 labeling하였다.
- 따라서 본 연구에 서는 국내 토종 종계를 대상으로 여름철에 발생하여 육성된 계군과 겨울철에 발생하여 육성된 계군 간에 열 스트레스 반응 정도를 비교 분석하기 위하여 HSP-70, HSP-90α 및 HSP-90β 유전자의 mRNA 발현량을 각 10주령, 20주령 및 40주령 때 Real-time PCR을 이용하여 ΔCt값으로 분석하고, 이의 결과를 Table 5와 6, 7에 제시하였다.
- 백혈구 세포의 표본 제작은 Ficoll을 이용하여 혈액 내 백혈구만을 분리하고, 이들 세포를 0.06M KCl(Sigma Chem, St Louis, MO, USA) 저장액에 15분간 저장 처리 후 Carnoy’s 액(methanol 3 : acetic acid 1)으로 3회 고정처리 하였다.
- 이후 산란기 사양관리는 무창계사 형태의 종계사로 이송 후 2단 4열 케이지에 칸 당 12수씩 수당 580cm2의 밀도로 사육하였으며, 백신 접종 등 기타 사양관리는 H사의 종계 사양관리지침에 따라 수행하였다. 생산능력의 비교를 위하여 주령 별 개체 체중과 생존율, 산란능력을 조사하였고, 열 스트레스 반응 정도 측정을 위하여 10주, 20주 및 40주령 때 날개 정맥으로부터 혈액을 채취하여 HSPs 유전자 발현율 및 텔로미어 함량을 분석하였다. 이러한 시험에 관련된 닭의 관리 및 취급은 본 대학 동물실험윤리위원회의 승인을 득한 후 본 규정을 준수하여 시행하였다(IACUC, 2018-7).
- 열 충격 단백질인 HSP 유전자의 발현율을 분석하기 위하여 각 개체의 혈액으로부터 RNA를 분리하였다. 채취한 전 혈을 QIAampⓇ RNA Blood Mini Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다.
- 사료 급여는 부화계절과는 관계없이 공히 시중 배합사료로 자유급이 후 4주령부터 제한급이 하였으며, 점등관리는 점감점증하여 16주령에 총 16시간으로 고정하였다. 이후 산란기 사양관리는 무창계사 형태의 종계사로 이송 후 2단 4열 케이지에 칸 당 12수씩 수당 580cm2의 밀도로 사육하였으며, 백신 접종 등 기타 사양관리는 H사의 종계 사양관리지침에 따라 수행하였다. 생산능력의 비교를 위하여 주령 별 개체 체중과 생존율, 산란능력을 조사하였고, 열 스트레스 반응 정도 측정을 위하여 10주, 20주 및 40주령 때 날개 정맥으로부터 혈액을 채취하여 HSPs 유전자 발현율 및 텔로미어 함량을 분석하였다.
- 06M KCl(Sigma Chem, St Louis, MO, USA) 저장액에 15분간 저장 처리 후 Carnoy’s 액(methanol 3 : acetic acid 1)으로 3회 고정처리 하였다. 제작된 슬라이드 표본은 RNase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)로 37℃ 항온수조에서 30분간 처리하여 RNA를 제거하고, 80%, 90%, 100% 에탄올로 탈수 건조시켰다. 건조된 슬라이드에 hybridization 용액(13 μL formamide, 5 μL hybridization buffer, 200 ng telomeric DNA probe)을 떨 어뜨린 후 85℃에서 5분간 변성시키고, 38℃에서 12시간 이상 접합하였다.
- 열 충격 단백질인 HSP 유전자의 발현율을 분석하기 위하여 각 개체의 혈액으로부터 RNA를 분리하였다. 채취한 전 혈을 QIAampⓇ RNA Blood Mini Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR을 위한 HSP-70, HSP-90α, HSP-90β 및 reference gene의 primers는 Table 1과 같다.
- (2016)이 제시한 방법을 일부 변형하여 형광접합보인법(Fluorescence in situ Hybridization)으로 분석하였다. 텔로미어 함량 분석에 이용할 telomeric DNA probe는 CCCTAA가 7번 반복된 단일 oligomers를 primer로 하여 PCR로 증폭 후 Dig-PCR probe synthesis kit(Roche, Mannheim, Germany)로 labeling하였다. 백혈구 세포의 표본 제작은 Ficoll을 이용하여 혈액 내 백혈구만을 분리하고, 이들 세포를 0.
대상 데이터
- 여름철 및 겨울철에 발생하여 육성된 병아리의 열 스트레스 반응 정도 및 생산성을 비교 분석하기 위하여 ㈜한협에서 육성 중인 한국토종종계 5계통(GPS)으로부터 이들 간 교잡으로 생산된 25개 조합의 초생추(PS)를 7월 및 11월에 각각 분양 받아 경남과학기술대학교 종합농장에서 사육하였다. 겨울철 시험개체는 토종종계 초생추 암컷 1,156수로 2014년 11월 19일부터 2015년 8월 27일까지 40주간 사육하였고, 여름철 시험개체는 동일 종의 초생추 암컷 934수로 2016년 7월 13일부터 2017년 4월 25일까지 40주간 사육하였다. 각 공시개체들의 사육 기간 동안 외부 대기 온도의 변화는 Fig.
- 여름철 및 겨울철에 발생하여 육성된 병아리의 열 스트레스 반응 정도 및 생산성을 비교 분석하기 위하여 ㈜한협에서 육성 중인 한국토종종계 5계통(GPS)으로부터 이들 간 교잡으로 생산된 25개 조합의 초생추(PS)를 7월 및 11월에 각각 분양 받아 경남과학기술대학교 종합농장에서 사육하였다. 겨울철 시험개체는 토종종계 초생추 암컷 1,156수로 2014년 11월 19일부터 2015년 8월 27일까지 40주간 사육하였고, 여름철 시험개체는 동일 종의 초생추 암컷 934수로 2016년 7월 13일부터 2017년 4월 25일까지 40주간 사육하였다.
데이터처리
- 또한 주령에 따른 텔로미어 함량 비교를 위해서는 동일 통계패키지의 GLM procedure를 이용하여 유의성 검정을 하고, 주령 별 평균값들 간의 다중검정은 Tukey’s HSD procedure로 검정하였다.
- 발생 및 육성 계절에 따른 사육 개체들의 생산능력과 텔로미어 함량 및 HSPs 유전자 발현율의 평균값 비교는 SAS 통계패키지(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 t-test procedure를 이용하여 유의성을 검정하였다. 또한 주령에 따른 텔로미어 함량 비교를 위해서는 동일 통계패키지의 GLM procedure를 이용하여 유의성 검정을 하고, 주령 별 평균값들 간의 다중검정은 Tukey’s HSD procedure로 검정하였다.
- 과정을 마친 표본은 propidium iodide solution(Sigma Chem)으로 염색하고 적녹 파장대의 필터가 부착된 형광현미경(Model AX-70, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰 후 개체 별 100개 이상의 핵을 디지털 카메라(Model DP-70, Olympus, Tokyo, Japan)로 촬영하였다. 촬영된 표본은 이미지 분석프로그램(MetaMorphⓇ, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 텔로미어 함량을 측정하고 분석하였다.
이론/모형
- Reference gene을 이용한 각 분석 대상 유전자의 상대적 정량값 은 Livak and Schmittgen(2001)이 제시한 2—△△Ct 방법으로 측정하였다.
성능/효과
- 1%로 집단 간 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나 발생 및 육성 계절과 상관없이 모든 공시계의 연령이 증가할수록 텔로미어의 함량은 유의하게 감소하였는데, 이는 사육 환경과 관계없이 개체의 텔로미어 길이는 연령이 증가함에 따라 짧아진다는 기본적 이론과 일치되는 결과이다. 텔로미어는 염색체 말단부의 단순 반복 염기서열로 이의 길이는 세포의 노화와 산화적 스트레스에 의해 영향을 받는데, 개체가 스트레스에 노출되면 텔로미어 길이의 감축이 더욱 촉진된다고 알려져 있다(Richter and Proctor, 2007; Beloor et al.
- 이러한 내용들은 사육개체들이 직간접적으로 열 스트레스에 노출될 경우, 텔로미어 길이 감축율에 영향이 있음을 시사하는 결과이다. 그러나 본 연구 결과, 닭에 있어 육성 기간 동안 지속적인 외부 환경 온도의 차이가 개체의 텔로미어 감축율에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보여진다.
- 8일로 겨울철 발생 계군이 여름철 발생 계군에 비하여 3주 정도 빨랐다. 반면, 20주령부터 40주령까지 일계산란율은 여름철 발생 계군이 69.0%이고, 겨울철 발생 계군이 66.1%로 여름철 발생 계군이 겨울철 발생 계군에 비해 유의하게 높았으며, 32주령 난중에서도 여름철 발생 계군이 겨울철 발생 계군에 비해 6 g 정도 높게 나타났다. 이는 병아리의 발생 및 육성 계절이 성숙 후 산란능력에 유의하게 영향을 미친다는 결과로서 육성 초기 때 열에 노출된 닭이 정상 온도 하에서 육성된 닭에 비하여 후기 성장 및 생산능력이 우수하다고 보여 진다.
- 발생 후 10주, 20주 및 40주 때 겨울철에 발생하여 육성된 집단의 개체들이 여름철에 발생하여 육성된 집단에 비해 HSP-70의 경우 1.94∼2.63배 높은 발현율을 보였고, HSP-90α는 2.19∼3.87배, HSP-90β는 2.19∼5.30배 높은 발현율을 나타내어 분석된 모든 HSPs의 발현값은 겨울철 부화 육성군이 여름철 부화 육성군에 비해 공히 높게 나타났다.
- , 2015; Al-Zghoul, 2018). 본 연구에서도 여름철 고온에서 사육된 병아리들이 겨울철에 사육된 병아리들에 비해 후기 생산능력이 양호한 결과를 보이는데, 이는 육성 초기에 고온에 노출된 병아리들이 열 적응으로 인해 후기 생산성이 좋아진 영향도 있겠으나, 여름철 발생 계군은 성숙 후 산란기가 겨울에서 봄 기간이고, 겨울철 발생 계군은 산란기가 여름철에 해당하여 산란시점에 고온 스트레스의 영향으로 생산성 저하가 유발되었다고 사료된다.
- 분석 결과, HSP-70, HSP-90α 및 HSP-90β 유전자 발현율은 발생 계절별 시험 계군 간 모든 주령에서 유의한 차이를 보였다.
- 2와 같다. 분석 결과, 겨울철에 발생하여 육성된 개체들의 체중이 여름철에 육성된 개체들에 비하여 24주령까지는 유의하게 높게 나타났으나, 28주령 이후부터는 오히려 역전 양상을 나타내었다. 이러한 결과는 육성초기에 고온에 노출된 개체들이 열 스트레스로 인해 낮은 체중을 보이다가 육성 후기부터 서서히 열 적응으로 인한 보상성장에 기인된 양상으로 사료된다.
- Table 4는 여름 및 겨울철에 발생하여 육성된 개체들 간의 10주령, 20주령 및 40주령 때 텔로미어의 함량 분석 결과이다. 분석 결과, 육성 계절에 따른 계군 별 텔로미어 함량은 모든 분석 주령에서 유의한 차이가 없는 것으로 나타났으며, 감축율 또한 여름철 발생 집단은 1.0%, 겨울철 발생 집단은 1.1%로 집단 간 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나 발생 및 육성 계절과 상관없이 모든 공시계의 연령이 증가할수록 텔로미어의 함량은 유의하게 감소하였는데, 이는 사육 환경과 관계없이 개체의 텔로미어 길이는 연령이 증가함에 따라 짧아진다는 기본적 이론과 일치되는 결과이다.
- 1%로 여름철 발생 계군이 겨울철 발생 계군에 비해 유의하게 높았으며, 32주령 난중에서도 여름철 발생 계군이 겨울철 발생 계군에 비해 6 g 정도 높게 나타났다. 이는 병아리의 발생 및 육성 계절이 성숙 후 산란능력에 유의하게 영향을 미친다는 결과로서 육성 초기 때 열에 노출된 닭이 정상 온도 하에서 육성된 닭에 비하여 후기 성장 및 생산능력이 우수하다고 보여 진다. 일반적으로 사육 중인 닭이 고온 스트레스를 받게 되면 생존율, 사료효율, 음수량, 성장률, 난질 및 산란율이 저하된다고 한다(Usayran et al.
- 30배 높은 발현율을 나타내어 분석된 모든 HSPs의 발현값은 겨울철 부화 육성군이 여름철 부화 육성군에 비해 공히 높게 나타났다. 이러한 결과는 겨울철에 발생하여 저온상태로 육성 초기를 보내고 점진적으로 외부 온도가 상승하는 시기에 성숙된 개체들이 여름철에 발생하여 고온상태에서 유추기를 보내고 점진적으로 외부 온도가 하강하는 시기에 성숙된 개체들에 비해 열 스트레스 반응 정도가 훨씬 높다라는 것을 의미한다. 이는 발생 및 육성 초기 때 외부로부터 열에 노출된 병아리들이 열에 대한 적응 능력을 습득하여 상대적으로 열저항성이 높다라는 것을 시사한다.
- 이상 본 연구 결과들을 종합할 때 발생 및 육성 초기 때 고온 환경에 노출된 닭들이 적온에서 사육된 닭들에 비해 스트레스 관련 생리적 지표와 생존율 및 생산능력이 우수함으로 육성 초기 열 스트레스가 개체들의 열 적응성을 향상시켜 성숙 후 외부 스트레스에 보다 잘 적응하게하고, 더불어 생산능력에 영향을 미친다고 판단된다.
- Table 2는 여름 및 겨울철에 발생하여 육성된 계군 간의 생존율을 제시한 것으로 0∼15주까지 육성기와 16∼40주까지 산란기로 나누어 분석하였다. 제시된 바와 같이 육성기 생존율에 있어 여름철 발생 계군은 89.3%, 겨울철 발생 계군은 89.0% 로 계군 간 생존율의 차이는 나타나지 않았으나, 16주령 이후 산란기 동안의 생존율은 여름철 발생 계군은 97.1%, 겨울철 발생 계군은 75.1%로 겨울철에 발생하여 육성된 계군이 여름철에 발생한 계군에 비해 현저히 낮게 나타났다. 이는 겨울철에 부화하여 저온 상태에서 초기 육성된 개체들이 산란중기 이후 여름철 고온에 노출되면서 열에 대한 내성이 약하여 집단 폐사가 일어난 결과라 생각된다.
후속연구
- , 2011). 그러나 고온에 노출된 병아리들의 생시 체중이 대조구에 비해 오히려 높다라는 보고(Piestun et al., 2011)와 고온 노출과 체중 간에는 별다른 관계가 없다는 보고(Yahav and Plavnik, 1999) 도 있어 실제 육성 초기 고온 스트레스와 체중 간의 연관성에 대해서는 보다 많은 연구가 필요하다고 사료된다. Table 2는 여름 및 겨울철에 발생하여 육성된 계군 간의 생존율을 제시한 것으로 0∼15주까지 육성기와 16∼40주까지 산란기로 나누어 분석하였다.
- , 2016). 그러므로 병아리의 부화 및 육성시기의 계절적 요인이 발생 후 개체들의 열 스트레스 적응 및 반응 정도에 유의한 영향을 미치리라 사료된다.
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