말뚝버섯 자실체의 항산화, 항콜린에스테라제 및 염증 저해 활성 Antioxidant, anti-cholinesterase, and inflammation inhibitory activities of fruiting bodies of Phallus impudicus var. impudicus L.원문보기
본 연구에서는 말뚝버섯의 자실체 메탄올 추출물의 항산화, cholinesterase 저해 및 항염증 효과를 탐색하였다. DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl radical 소거능, 철 이온 제거능 및 환원력 등의 항산화 효과를 측정한 결과 DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl radical 소거능 및 환원력은 양성대조군으로 사용한 BHT에 비해 낮았으나 실험에 시용한 2.0 mg/ml의 농도에서 50% 이상의 저해효과를 나타내었고 철 이온 제거능은 BHT에 비해 높게 나타나서 다른 종류의 식의약용 버섯에 비해 항산화 효과가 우수하였다. 치매환자의 기억력 감퇴와 관련된 acetylcholinesterase와 butyrylcholinesterase의 저해실험에서 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물은 실험에 사용한 전 농도 범위에서 양성대조군인 galanthamine에 비해 유의하게 낮았지만 1.0 mg/ml의 농도에서 50% 이상의 저해 효과를 나타냈다. In vitro 항염증 실험에서 RAW 264.7 대식세포에 서로 다른 농도의 메탄올 추출물을 처리한 후 염증 유발물질인 LPS를 처리하여 RAW 264.7 세포가 생성한 NO의 양을 측정한 결과 추출물을 투여한 실험군의 NO 농도가 LPS만 단독으로 처리한 양성대조군에 비해 유의하게 낮았고 처리한 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 생성된 NO의 양은 유의하게 감소하는 경향을 나타났다. 또한 in vivo 항염증 실험에서 먼저 각기 다른 농도의 메탄올 추출물을 생쥐의 뒷발에 주사한 후 추가로 기염제인 carrageenan을 주사하여 흰쥐 뒷발에 유도된 부종 (edema)이 추출물에 의해 저해되는 정도와 염증 치료제로 처방되는 indomethacin을 양성대조군으로 하여 실험을 진행하였다. 실험 결과 흰쥐에 주사한 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 흰쥐 뒷발에 유도된 부종의 용적도 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것이 관찰되어 말뚝버섯 자실체에는 염증을 저해하는 성분이 함유되어 있는 것으로 사료되었다. 따라서 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물에는 항산화, acetylcholinesterase과 butyrylcholinesterase의 저해 및 항염증 효과를 나타내는 유용 성분이 함유되어 있어 앞으로 의약용 기초 소재로서의 이용 연구가 필요하다고 사료된다.
본 연구에서는 말뚝버섯의 자실체 메탄올 추출물의 항산화, cholinesterase 저해 및 항염증 효과를 탐색하였다. DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl radical 소거능, 철 이온 제거능 및 환원력 등의 항산화 효과를 측정한 결과 DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl radical 소거능 및 환원력은 양성대조군으로 사용한 BHT에 비해 낮았으나 실험에 시용한 2.0 mg/ml의 농도에서 50% 이상의 저해효과를 나타내었고 철 이온 제거능은 BHT에 비해 높게 나타나서 다른 종류의 식의약용 버섯에 비해 항산화 효과가 우수하였다. 치매환자의 기억력 감퇴와 관련된 acetylcholinesterase와 butyrylcholinesterase의 저해실험에서 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물은 실험에 사용한 전 농도 범위에서 양성대조군인 galanthamine에 비해 유의하게 낮았지만 1.0 mg/ml의 농도에서 50% 이상의 저해 효과를 나타냈다. In vitro 항염증 실험에서 RAW 264.7 대식세포에 서로 다른 농도의 메탄올 추출물을 처리한 후 염증 유발물질인 LPS를 처리하여 RAW 264.7 세포가 생성한 NO의 양을 측정한 결과 추출물을 투여한 실험군의 NO 농도가 LPS만 단독으로 처리한 양성대조군에 비해 유의하게 낮았고 처리한 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 생성된 NO의 양은 유의하게 감소하는 경향을 나타났다. 또한 in vivo 항염증 실험에서 먼저 각기 다른 농도의 메탄올 추출물을 생쥐의 뒷발에 주사한 후 추가로 기염제인 carrageenan을 주사하여 흰쥐 뒷발에 유도된 부종 (edema)이 추출물에 의해 저해되는 정도와 염증 치료제로 처방되는 indomethacin을 양성대조군으로 하여 실험을 진행하였다. 실험 결과 흰쥐에 주사한 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 흰쥐 뒷발에 유도된 부종의 용적도 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것이 관찰되어 말뚝버섯 자실체에는 염증을 저해하는 성분이 함유되어 있는 것으로 사료되었다. 따라서 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물에는 항산화, acetylcholinesterase과 butyrylcholinesterase의 저해 및 항염증 효과를 나타내는 유용 성분이 함유되어 있어 앞으로 의약용 기초 소재로서의 이용 연구가 필요하다고 사료된다.
Phallus impudicus var. impudicus L. is an edible mushroom that has long been used as folk medicine in China. The aim of this study was to evaluate the antioxidant, anti-cholinesterase, and inflammation inhibitory activities of a methanol extract of fruiting bodies of P. impudicus var. impudicus L. T...
Phallus impudicus var. impudicus L. is an edible mushroom that has long been used as folk medicine in China. The aim of this study was to evaluate the antioxidant, anti-cholinesterase, and inflammation inhibitory activities of a methanol extract of fruiting bodies of P. impudicus var. impudicus L. The extract exhibited good 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl scavenging activity, excellent ferrous ion chelating activity, and moderate hydroxyl radical scavenging activity compared with BHT at 2.0 mg/ml. However, the reducing power of the extract was significantly lower than that the BHT positive control. Although the inhibitory activities of methanol extract on acetylcholinesterase and butyryl cholinesterase were significantly lower than the galanthamine positive control at the concentration tested, the inhibition of acetylcholinesterase and butyryl cholinesterase was 52.83% and 55.17%, respectively, at 1.0 mg/ml. The methanol extract also demonstrated excellent inhibition of inflammation-related activities, such as production of nitric oxide in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 macrophage cells and acute edema induced by administration of carrageenan on the hind paw of rats. The collective results suggest that the fruiting body of P. impudicus var. impudicus L. might be a good source of antioxidant, anti-cholinesterase, and anti-inflammation compounds.
Phallus impudicus var. impudicus L. is an edible mushroom that has long been used as folk medicine in China. The aim of this study was to evaluate the antioxidant, anti-cholinesterase, and inflammation inhibitory activities of a methanol extract of fruiting bodies of P. impudicus var. impudicus L. The extract exhibited good 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl scavenging activity, excellent ferrous ion chelating activity, and moderate hydroxyl radical scavenging activity compared with BHT at 2.0 mg/ml. However, the reducing power of the extract was significantly lower than that the BHT positive control. Although the inhibitory activities of methanol extract on acetylcholinesterase and butyryl cholinesterase were significantly lower than the galanthamine positive control at the concentration tested, the inhibition of acetylcholinesterase and butyryl cholinesterase was 52.83% and 55.17%, respectively, at 1.0 mg/ml. The methanol extract also demonstrated excellent inhibition of inflammation-related activities, such as production of nitric oxide in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 macrophage cells and acute edema induced by administration of carrageenan on the hind paw of rats. The collective results suggest that the fruiting body of P. impudicus var. impudicus L. might be a good source of antioxidant, anti-cholinesterase, and anti-inflammation compounds.
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문제 정의
, 1987). 따라서 본 연구에서는 말뚝버섯의 자실체의 생리활성 효과를 알아보기 위해 중국에서 생산된 말뚝버섯의 자실체를 메탄올을 이용해 추출물은 만든 뒤 항산화, 콜린에스테라제 저해 및 항염증 효과에 대한 실험을 수행하였다.
본 연구에서는 말뚝버섯의 자실체 메탄올 추출물의 항산화, cholinesterase 저해 및 항염증 효과를 탐색하였다. DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl radical 소거능, 철 이온 제거능 및 환원력 등의 항산화 효과를 측정한 결과 DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl radical 소거능 및 환원력은 양성대조군으로 사용한 BHT에 비해 낮았으나 실험에 시용한 2.
제안 방법
DMEM 배지가 들어있는 96 well plate에 RAW 264.7 세포를 5×104 cell/well로 분주하고 12시간 배양 후 말뚝버섯 메탄올 추출물을 0, 0.25, 0.5 및 1.0 mg/ml의 농도로 처리하고 1시간 경과 후 1 µg/ml 농도의 LPS를 추가 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
Gallic acid (Sigma Co., Ltd., St. Louis, MO, USA)를 0~100 µg/ml의 농도로 제조한 후 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선을 이용하여 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였다.
3 ml를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 방치한 후 UV/VIS Spectrophotometer (OptizenPOP, Korea)를 이용해 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 하여 얻은 표준 검량선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.
그 원리는 버섯에 함유되어 있는 항산화 물질에 의해 Fe2+ 이온이 제거되어 더 이상의 ferrozine-Fe2+ 복합체가 형성되지 않는 것을 측정하였다. 각각의 농도별 버섯의 메탄올 추출물을 준비한 후 2.0 ml 추출물에 2 mM FeCl2(Sigma Aldrich Co., USA) 0.05 ml를 혼합한 후 0.2 mL의 5 mM ferrozine을 첨가하여 반응을 시작한 후 메탄올 2.75 ml를 첨가하여 총용량이 5 ml가 되도록 하고 vortex mixer를 이용하여 강하게 진탕한 뒤 UV/ VIS spectrophotometer (Optizen POP, Korea)를 이용해 반응액의 흡광도를 562 nm에서 측정하여 다음의 계산식에 의해 철 이온 제거능을 계산하였다. 양성대조군으로는 BHT를 사용하였다.
(2002)의 방법에 준하여 수행하였다. 그 원리는 버섯에 함유되어 있는 항산화 물질에 의해 Fe2+ 이온이 제거되어 더 이상의 ferrozine-Fe2+ 복합체가 형성되지 않는 것을 측정하였다. 각각의 농도별 버섯의 메탄올 추출물을 준비한 후 2.
3). 따라서 lipopolysaccharide (LPS)의 유도에 의해 RAW 264.7 대식세포가 생산하는 nitric oxide 생성 실험은 메탄올 추출물 0.25~1.0 mg/ml 농도의 범위에서 수행하였다.
7 세포가 생성한 NO의 양을 측정한 결과 추출물을 투여한 실험군의 NO 농도가 LPS만 단독으로 처리한 양성대조군에 비해 유의하게 낮았고 처리한 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 생성된 NO의 양은 유의하게 감소하는 경향을 나타났다. 또한 in vivo 항염증 실험에서 먼저 각기 다른 농도의 메탄올 추출물을 생쥐의 뒷발에 주사한 후 추가로 기염제인 carrageenan을 주사하여 흰쥐 뒷발에 유도된 부종 (edema)이 추출물에 의해 저해되는 정도와 염증 치료제로 처방되는 indomethacin을 양성대조군으로 하여 실험을 진행하였다. 실험 결과 흰쥐에 주사한 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 흰쥐 뒷발에 유도된 부종의 용적도 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것이 관찰되어 말뚝버섯 자실체에는 염증을 저해하는 성분이 함유되어 있는 것으로 사료되었다.
말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물이 RAW 264.7 대식세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물을 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0mg/ml의 농도로 조정하여 RAW 264.7 대식세포에 처리하고 24시간 배양 후 MTT 방법을 이용하여 세포의 생존율을 조사하였다. 실험결과 RAW 264.
1 ml의 1% carrageenan 용액을 뒷발바닥에 주사하였다. 말뚝버섯 추출물의 소염효과는 각각의 추출물과 carrageenan을 주사하여 생긴 뒷발바닥의 부종 용적을 plethysmometer(MK-101P, Tokyo, Japan)로 측정해 구하였다. 즉, 흰쥐 뒷발에 부종 유발제인 carrageenan을 주입하기 전을 0으로 하고 주입 후 2, 4, 6시간 경과 후 증가한 뒷발의 용적을 각각의 실험군 별로 측정하여 다음의 식에 의해 부종의 증가율을 구하였다.
(1962)의 방법에 따라 수행하였으며 각각의 처리 당 5마리의 흰쥐를 사용하였다. 먼저 생리식염수에 5 mg/kg의 indomethacin과 0, 5, 15, 50 mg/kg 농도의 말뚝버섯 메탄올 추출물을 녹인 뒤 흰쥐 마리당 각각 0.1 ml씩 오른쪽 뒷발바닥에 주사하고 30분 지난 후 0.1 ml의 1% carrageenan 용액을 뒷발바닥에 주사하였다. 말뚝버섯 추출물의 소염효과는 각각의 추출물과 carrageenan을 주사하여 생긴 뒷발바닥의 부종 용적을 plethysmometer(MK-101P, Tokyo, Japan)로 측정해 구하였다.
Louis, MO, USA) 100 µl를 넣어 총량이 200 µl가 되도록 하고 상온에서 10분간 반응시킨 후 생성된 NO의 양을 microplate reader(SpectraMax 340PC, California, USA)를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 농도는 아질산염 (NaNO2)의 표준 곡선을 이용해 구하였다.
시료를 메탄올로 녹여 최종 농도가 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/ml이 되도록 정량하여 96 well plate에 각 시료를 100 µl를 주입하고.
5 ml, 10%, w/v)를 첨가하여 650×g에서 10분간 원심 분리하였다. 원심 분리 한 상층액 5 ml에 3차 증류수 5ml와 1% ferric chloride 1 ml를 첨가 후 UV/VISspectrophotometer (Optizen POP, Korea)를 이용하여 700nm에서 흡광도를 측정하였다.
35 U/ml butyrylcholine iodide 30 µl를 첨가해 2분 동안 반응시킨 후 microplate reader (SpectraMax 340PC, California, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 효소 대신 동량의 assay buffer를 가한 것을 control로 galanthamine를 가한 것을 양성대조군으로 사용하였으며, BChE의 저해활성은 다음의 계산식을 이용해 구하였다.
0 mg/ml 농도로 희석된 10 µl의 시료를 가하고 상온에서 10분 동안 진탕배양 한 후 10 µl의 10 mM DTNB와 5 µl의 100 mM acetylthiocholine을 가하여 2분 동안 반응시킨 후 microplate reader(SpectraMax 340PC, California, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 효소 대신 동량의 assay buffer를 가한 것을 control로 galanthamine을 양성대조군으로 사용하였으며, AChE의 저해활성은 다음의 계산식을 이용해 구하였다.
(2003)의 방법에 따라 건조한 말뚝버섯 자실체 분말에 80% 메탄올을 이용해 성분을 추출하여 실험에 사용하였다. 즉, 30 g의 말뚝버섯 자실체의 분말을 80%의 메탄올 용액(덕산약품공업, Korea) 600 ml에 침지하여 48시간 동안 상온에서 3회 추출한 후 이 추출액을 모으고 여과지 (Avantec Toyo Co., No. 2, Japan)로 여과한 후 40℃에서 회전 감압농축기(N-1000, EYELA Co., Japan)을 이용하여 감압 농축한 뒤 동결건조기(FDU-8612, Operon Co., Korea)를 이용해 농축액내의 수분을 제거하여 15.91% (w/w)의 메탄올 추출물을 얻었다.
총 폴리페놀 함량의 측정은 Folin-Denis의 방법을 변형한 Swain and Hills (1959)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 말뚝버섯 메탄올 추출물을 1 mg/ml의 농도로 용해한 각 용매 별 추출액에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10%의 NaCO3 용액을 각각 1 ml씩 차례로 가한 후 실온에서 1시간 방치 후 UV/VIS Spectrophotometer (Optizen POP, Korea)를 이용해 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid (Sigma Co.
말뚝버섯 추출물의 소염효과는 각각의 추출물과 carrageenan을 주사하여 생긴 뒷발바닥의 부종 용적을 plethysmometer(MK-101P, Tokyo, Japan)로 측정해 구하였다. 즉, 흰쥐 뒷발에 부종 유발제인 carrageenan을 주입하기 전을 0으로 하고 주입 후 2, 4, 6시간 경과 후 증가한 뒷발의 용적을 각각의 실험군 별로 측정하여 다음의 식에 의해 부종의 증가율을 구하였다.
지수기에 도달한 세포주를 DMEM 배지가 분주된 96 plate well에 2 × 105 cell/ml의 농도로 분주하고 24시간 배양한 후, 배지의 상층액을 제거하고 말뚝버섯 추출물을 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml의 농도로 200 µl 새로운 배지에 첨가하여 48시간 동안 배양하였다.
대상 데이터
Shim et al. (2003)의 방법에 따라 건조한 말뚝버섯 자실체 분말에 80% 메탄올을 이용해 성분을 추출하여 실험에 사용하였다. 즉, 30 g의 말뚝버섯 자실체의 분말을 80%의 메탄올 용액(덕산약품공업, Korea) 600 ml에 침지하여 48시간 동안 상온에서 3회 추출한 후 이 추출액을 모으고 여과지 (Avantec Toyo Co.
본 실험에 사용한 말뚝버섯의 자실체는 중국 귀주성의 버섯농장에서 생산된 것을 중국 북경의 Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College의 Guo Shun-xing 교수를 통해 구하였다.
본 실험에는 5주령의 Sprague-Dawley계 암컷 흰쥐를 Daehan Bio-Link사(Eumseong, Korea)에서 분양받아 동물 사육실에서 1주일간 온도 20±1℃, 습도 45±5%, 명암주기 각각 12시간의 조건에서 일반사료로 적응 시킨 후 실험을 수행하였다.
실험에 사용한 생쥐의 RAW 264.7 대식 세포는 서울대학교의 한국세포주은행에서 분양받았으며 이들 세포의 배양에는 DMEM 배지 (GIBCO, Grand Island, NY, USA)을 기본배지로 하여 10% fetal bovine serum (FBS)을 구입하여 100 U/ml penicillin 및 100 µg/ml streptomycin이 함유한 배지를 조제하여 37℃, 5%의 CO2 배양기에서 3일에 한 번씩 계대 배양하였다.
DPPH 라디칼 소거 활성은 다음의 계산식을 이용해 구하였다. 양성대조군으로는 BHT를 사용하였다.
데이터처리
각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 p＜0.05의 수준에서 Duncan‘s multiple range test로 차이를 검증하였다.
본 연구에서는 3회 이상 반복 실시한 결과를 mean±SD로 나타내었으며, 통계는 SPSS ver. 11.5 (SPSS, Chicago, IL, USA) 를 이용하였다.
이론/모형
말뚝버섯의 총 플라보노이드 함량은 Moreno et al.(2000)의 방법에 따라 1 mg/ml 농도의 시료액에 10% aluminum nitrate 0.1 ml, 1M potassium acetate 0.1 ml 및 ethanol 4.3 ml를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 방치한 후 UV/VIS Spectrophotometer (OptizenPOP, Korea)를 이용해 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 하여 얻은 표준 검량선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.
Halliwell and Gutteridge (1987)의 방법에 따라 시험관에 1 mM FeSO4/EDTA 용액, 추출물을 각 0.2 ml 씩 가하고 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) 1.2 ml와 10 mM H2O2를 가하여 37℃ 항온수조에서 1시간 반응시켰다. 여기에 2.
7 macrophages. NO concentration in culture medium was determined by Griess assay. Values are means ± standard deviation (SD, n = 3).
말뚝버섯 메탄올 추출물의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거활성은 Blois (1958)의 방법으로 측정하였다. 시료를 메탄올로 녹여 최종 농도가 0.
말뚝버섯 메탄올 추출물의 AChE 저해활성은 Ellman et al. (1961)의 방법에 따라 acetylthiocholine을 기질로 사용하였으며 AChE에 의해 생성되는 thiocholine을 DTNB와 반응시켜 그 결과 생성되는 5-thio-2-nitrobenzoate를 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 즉, 96 well microplate에 100 µl의 AChE assay buffer (0.
말뚝버섯 메탄올 추출물의 BChE 저해활성은 Orhan et al. (2006)의 방법에 따라 butyrylcholine iodide를 기질로 사용하였으며 BChE의 가수 분해로 생성된 thiocholine을 DTNB와 반응시켜 그 결과 생성된 반응물의 흡광도를 측정하였다. 즉, 96 well microplate에 120 µl의 BChE assay buffer (0.
말뚝버섯 메탄올 추출물의 NO 생성 저해 효과는 Ryu et al. (2003)의 방법을 이용해 수행하였다. DMEM 배지가 들어있는 96 well plate에 RAW 264.
말뚝버섯 메탄올 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 독성은 Mosmann의 방법 (1983)에 따라 수행하였다. 지수기에 도달한 세포주를 DMEM 배지가 분주된 96 plate well에 2 × 105 cell/ml의 농도로 분주하고 24시간 배양한 후, 배지의 상층액을 제거하고 말뚝버섯 추출물을 0.
말뚝버섯 메탄올 추출물의 철 이온 제거능은 Yena et al. (2002)의 방법에 준하여 수행하였다. 그 원리는 버섯에 함유되어 있는 항산화 물질에 의해 Fe2+ 이온이 제거되어 더 이상의 ferrozine-Fe2+ 복합체가 형성되지 않는 것을 측정하였다.
말뚝버섯 메탄올 추출물의 환원력 활성 실험은 Gulcin et al. (2003)의 방법에 따라 수행하였다. 시료 2.
총 폴리페놀 함량의 측정은 Folin-Denis의 방법을 변형한 Swain and Hills (1959)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 말뚝버섯 메탄올 추출물을 1 mg/ml의 농도로 용해한 각 용매 별 추출액에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10%의 NaCO3 용액을 각각 1 ml씩 차례로 가한 후 실온에서 1시간 방치 후 UV/VIS Spectrophotometer (Optizen POP, Korea)를 이용해 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 실험에는 5주령의 Sprague-Dawley계 암컷 흰쥐를 Daehan Bio-Link사(Eumseong, Korea)에서 분양받아 동물 사육실에서 1주일간 온도 20±1℃, 습도 45±5%, 명암주기 각각 12시간의 조건에서 일반사료로 적응 시킨 후 실험을 수행하였다. 흰쥐의 급성 부종 유발은 Winter et al. (1962)의 방법에 따라 수행하였으며 각각의 처리 당 5마리의 흰쥐를 사용하였다. 먼저 생리식염수에 5 mg/kg의 indomethacin과 0, 5, 15, 50 mg/kg 농도의 말뚝버섯 메탄올 추출물을 녹인 뒤 흰쥐 마리당 각각 0.
성능/효과
본 연구에서는 말뚝버섯의 자실체 메탄올 추출물의 항산화, cholinesterase 저해 및 항염증 효과를 탐색하였다. DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl radical 소거능, 철 이온 제거능 및 환원력 등의 항산화 효과를 측정한 결과 DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl radical 소거능 및 환원력은 양성대조군으로 사용한 BHT에 비해 낮았으나 실험에 시용한 2.0 mg/ml의 농도에서 50% 이상의 저해효과를 나타내었고 철 이온 제거능은 BHT에 비해 높게 나타나서 다른 종류의 식의약용 버섯에 비해 항산화 효과가 우수하였다. 치매환자의 기억력 감퇴와 관련된 acetylcholinesterase와 butyrylcholinesterase의 저해실험에서 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물은 실험에 사용한 전 농도 범위에서 양성대조군인 galanthamine에 비해 유의하게 낮았지만 1.
0 mg/ml의 농도에서 50% 이상의 저해 효과를 나타냈다. In vitro 항염증 실험에서 RAW 264.7 대식세포에 서로 다른 농도의 메탄올 추출물을 처리한 후 염증 유발물질인 LPS를 처리하여 RAW 264.7 세포가 생성한 NO의 양을 측정한 결과 추출물을 투여한 실험군의 NO 농도가 LPS만 단독으로 처리한 양성대조군에 비해 유의하게 낮았고 처리한 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 생성된 NO의 양은 유의하게 감소하는 경향을 나타났다. 또한 in vivo 항염증 실험에서 먼저 각기 다른 농도의 메탄올 추출물을 생쥐의 뒷발에 주사한 후 추가로 기염제인 carrageenan을 주사하여 흰쥐 뒷발에 유도된 부종 (edema)이 추출물에 의해 저해되는 정도와 염증 치료제로 처방되는 indomethacin을 양성대조군으로 하여 실험을 진행하였다.
0 mg/kg의 indomethacin을 주사한 양성대조군과 유사하여 통계적으로 유의하지 않았다. 따라서 말뚝버섯 메탄올 추출물에는 carrageenan에 의해 유도된 부종을 저해하는 유효한 성분이 함유되어 있는 것으로 사료되었다. Lim et al.
(2010)이 보고한 노랑느타리의 DPPH 라디칼 소거능 효과에 비해 본 실험의 말뚝버섯의 DPPH 소거능이 조금 높았다. 따라서 말뚝버섯 메탄올 추출물의 DPPH 소거활성은 합성산화제 BHT에 비해 대부분의 실험농도에서 낮게 나타났지만 위의 다른 종류의 버섯에 비해서는 높은 것으로 나타나 DPPH 항산화 효과가 상대적으로 높다고 사료되었다.
68에 비해 낮은 수준이었다. 따라서 본 실험에 사용한 말뚝버섯의 환원력은 양성대조군 galanthamine에 비해서는 유의하게 낮았지만 위의 잎새버섯의 자실체나 신령버섯 균사체의 환원력에 비해서는 효과가 높은 것으로 나타났다.
80%로 증가했다. 따라서 흰쥐의 뒷발에 주사한 말뚝버섯 메탄올 추출물은 실험에 사용한 모든 농도 범위 내에서 부종을 저해하는 효과가 있었다. 5 mg/kg과 15 mg/kg 농도의 메탄올 추출물을 투여한 실험군의 부종저해 효과는 5.
또한 RAW 264.7 세포에 메탄올 추출물 1.0 mg/ml와 LPS를 1 µg/ml를 처리하여 생성된 NO는 10.17 µM를 나타내 양성대조군에 비해 약 4.24배 낮아져 메탄올 추출물이 LPS에 의해 유도된 RAW 264.7 세포내의 NO의 생성을 크게 감소시킨 다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
1A에 나타내었다. 말뚝버섯 메탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 0.125~1.0 mg/ml의 농도 범위에서 23.17~87.67%로 나타나 동일 농도에서의 양성대조군 BHT의 96.20~96.53%에 비해 유의하게 낮았으나 2.0 mg/ml의 추출물 농도에서의 소거활성은 92.33%로 나타나 동일농도에서의 BHT 소거활성 96.97%에 비해서 조금 낮았으나 통계적인 유의성은 없었다. 따라서 메탄올 추출물의 2.
-ferrozine 복합체 형성을 저해한다는 이론에 근거한 것이다. 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물은 0.125~2.0 mg/ml 농도 범위에서 37.33~79.17%의 철 이온 제거능을 보여 양성대조군인 BHT의 20.83~68.83%에 비해 철 이온 제거 효율이 유의하게 높았다 (Fig. 1C). 본 실험에서 말뚝버섯 메탄올 추출물 2.
AChE는시냅스신호전달물질인아세틸콜린 (acetylcholine)을 아세틸과 콜린으로 분해하여 기억력을 감퇴시키는 역할을 하는 효소이다. 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물은 AChE에 대해 0.063~1.0 mg/ml 농도에서 34.50~52.83%의 저해효과가 나타나 양성대조군인 galathamine의 86.13~97.83%에 비해 실험에 사용한 모든 농도범위에서 저해 효과가 유의하게 낮았다 (Fig. 2A). 말뚝버섯 추출물의 AChE 저해효과는 처리농도가 증가함에 따라 저해효과도 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다.
BChE는 AChE와 같이 정보를 전달하는 신경전달물질인 BCh를 분해하여 기억력을 감퇴시키는 역할을 한다고 보고된 효소이다. 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물의 BChE에 대한 저해활성은 0.063~1.0 mg/ml의 농도에서 각각 36.67~55.17%로 나타나 동일 농도범위에서의 양성대조군 galathamine의 저해효과 50.5~81.17%에 비해 유의하게 낮았다 (Fig. 2B). Yoon과 Jang (2018)은 마른진흙버섯 자실체의 메탄올 추출물을 이용해 BChE에 대한 저해 활성을 조사한 결과 0.
2A). 말뚝버섯 추출물의 AChE 저해효과는 처리농도가 증가함에 따라 저해효과도 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. Nguyen et al.
말뚝버섯 자실체 메탄올 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 Table 1에 표시하였다. 메탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 3.18 mg GAE/g과 0.87mg QE/g으로 나타나 플라보노이드의 양에 비해 폴리페놀의 양이 약 3.66배 많았다. González-Palma et al.
98% 증가한 것으로 나타났다. 반면 말뚝버섯의 메탄올 추출물을 5 mg/kg 주사 후 carrageenan을 투여한 실험군의 부종용적은 35.60~38.40% 증가했고, 메탄올 추출물을 15 mg/kg 투여한 실험군의 부종용적은 29.20~34.00%로 증가했으며, 50 mg/kg의 메탄올 추출물을 주사한 실험군의 부종용적은 21.00~28.80%로 증가했다. 따라서 흰쥐의 뒷발에 주사한 말뚝버섯 메탄올 추출물은 실험에 사용한 모든 농도 범위 내에서 부종을 저해하는 효과가 있었다.
0 mg/ml 농도에서의 DPPH 라디칼 소거활성은 동일농도에서의 BHT의 소거활성과 유사한 효과를 나타냈다. 본 실험 결과는 An et al. (2019)이 보고한 흰우단버섯과 박막깔대기버섯 자실체를 70% 발효주정을 이용해 추출한 물질의 1.0 mg/ml 농도에서의 DPPH 라디칼 소거능이 각각 69.7%과 64.2%였다는 결과와 Um et al. (2010)이 보고한 노랑느타리의 DPPH 라디칼 소거능 효과에 비해 본 실험의 말뚝버섯의 DPPH 소거능이 조금 높았다. 따라서 말뚝버섯 메탄올 추출물의 DPPH 소거활성은 합성산화제 BHT에 비해 대부분의 실험농도에서 낮게 나타났지만 위의 다른 종류의 버섯에 비해서는 높은 것으로 나타나 DPPH 항산화 효과가 상대적으로 높다고 사료되었다.
(2010)은 carrageenan을 주사하여 부종이 유발된 흰쥐에 목질진흙버섯의 열수추출물을 투여하고 소염효과를 확인한 결과 목질진흙버섯 추출물의 농도가 높아짐에 따라 소염효과도 이에 비례해서 유의하게 증가한다고 보고하였다. 본 실험에서도 carrageenan만을 처리한 대조군과 달리 메탄올 추출물을 5~50 mg/kg의 농도로 처리한 실험군에서 추출물의 농도가 증가함에 따라 소염효과도 지속적으로 증가하는 것을 확인되었다. 따라서 앞으로는 소염효과가 높은 말뚝버섯의 자실체에 함유되어있는 유용성분에 대한 추가적인 분석연구가 필요한 것으로 사료되었다.
실험 결과 RAW 264.7 세포만을 배양한 대조군의 NO 농도는 6.37 µM를 나타냈으며 RAW 264.7 세포에 메탄올 추출물만을 1.0 mg/ml의 농도로 처리한 실험군의 NO 농도는 6.83 µM로 대조군에 비해 0.46 µM 증가하였다.
또한 in vivo 항염증 실험에서 먼저 각기 다른 농도의 메탄올 추출물을 생쥐의 뒷발에 주사한 후 추가로 기염제인 carrageenan을 주사하여 흰쥐 뒷발에 유도된 부종 (edema)이 추출물에 의해 저해되는 정도와 염증 치료제로 처방되는 indomethacin을 양성대조군으로 하여 실험을 진행하였다. 실험 결과 흰쥐에 주사한 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 흰쥐 뒷발에 유도된 부종의 용적도 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것이 관찰되어 말뚝버섯 자실체에는 염증을 저해하는 성분이 함유되어 있는 것으로 사료되었다. 따라서 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물에는 항산화, acetylcholinesterase과 butyrylcholinesterase의 저해 및 항염증 효과를 나타내는 유용 성분이 함유되어 있어 앞으로 의약용 기초 소재로서의 이용 연구가 필요하다고 사료된다.
7 대식세포에 처리하고 24시간 배양 후 MTT 방법을 이용하여 세포의 생존율을 조사하였다. 실험결과 RAW 264.7 세포는 0.063~1.0 mg/ml의 농도 범위에서 97.33~78.67%의 세포가 생존하여 실험에 사용한 농도 범위에서 거의 독성을 나타내지 않았다 (Fig. 3). 따라서 lipopolysaccharide (LPS)의 유도에 의해 RAW 264.
5에 표시하였다. 실험결과 기염제인 carrageenan만을 주사한 대조군의 경우 흰쥐 뒷발의 부종 용적은 2~6 시간 후에 42.16~66.70% 증가했으나, 소염제인 indomethacin을 쥐 뒷발에 5 mg/kg 투여 후 carrageenan을 주사하고 2~6 시간 경과 후 측정한 부종용적은 14.14~29.98% 증가한 것으로 나타났다. 반면 말뚝버섯의 메탄올 추출물을 5 mg/kg 주사 후 carrageenan을 투여한 실험군의 부종용적은 35.
0 mg/ml의 농도에서 50% 이상의 저해효과를 나타내었고 철 이온 제거능은 BHT에 비해 높게 나타나서 다른 종류의 식의약용 버섯에 비해 항산화 효과가 우수하였다. 치매환자의 기억력 감퇴와 관련된 acetylcholinesterase와 butyrylcholinesterase의 저해실험에서 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물은 실험에 사용한 전 농도 범위에서 양성대조군인 galanthamine에 비해 유의하게 낮았지만 1.0 mg/ml의 농도에서 50% 이상의 저해 효과를 나타냈다. In vitro 항염증 실험에서 RAW 264.
후속연구
따라서 말뚝버섯 자실체의 AChE에 저해활성은 위의 기와층버섯과 마른진흙버섯에 비해 낮았지만 1.0 mg/ml 농도에서의 저해율이 50%를 상회해 Alzheimer’s disease와 같이 기억력을 감퇴시키는 치매 질환의 개선에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
실험 결과 흰쥐에 주사한 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 흰쥐 뒷발에 유도된 부종의 용적도 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것이 관찰되어 말뚝버섯 자실체에는 염증을 저해하는 성분이 함유되어 있는 것으로 사료되었다. 따라서 말뚝버섯 자실체의 메탄올 추출물에는 항산화, acetylcholinesterase과 butyrylcholinesterase의 저해 및 항염증 효과를 나타내는 유용 성분이 함유되어 있어 앞으로 의약용 기초 소재로서의 이용 연구가 필요하다고 사료된다.
본 실험에서도 carrageenan만을 처리한 대조군과 달리 메탄올 추출물을 5~50 mg/kg의 농도로 처리한 실험군에서 추출물의 농도가 증가함에 따라 소염효과도 지속적으로 증가하는 것을 확인되었다. 따라서 앞으로는 소염효과가 높은 말뚝버섯의 자실체에 함유되어있는 유용성분에 대한 추가적인 분석연구가 필요한 것으로 사료되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
AChE는 어떤 역할을 하는가?
기억력의 감퇴에 가장 큰 영향을 미치는 효소에는 acetylcholinesterase(AChE)와 butyrylcholinesterase(BChE) 효소가 있다. AChE는 대뇌피질에 들어있는 아세틸콜린을 아세틸과 콜린으로 분해하여 뇌의 아세틸콜린의 농도를 감소시켜 기억력을 감퇴시킨다. 따라서 초기의 AD를 치료하는데 의료기관에서 사용하는 방법은 AChE와 BChE의 활성을 저해하는 Donepezil, Rivastigmine, Galantamine 등과 같은 약제를 처방하고 있으나 장기복용에 따른 오심, 구토, 체중 감소, 수면 장해 등의 부작용이 발생하고 있다 (Ikeya et al.
알츠하이머 병의 치료제인 Donepezil, Rivastigmine, Galantamine 등과 같은 약제의 부작용은?
AChE는 대뇌피질에 들어있는 아세틸콜린을 아세틸과 콜린으로 분해하여 뇌의 아세틸콜린의 농도를 감소시켜 기억력을 감퇴시킨다. 따라서 초기의 AD를 치료하는데 의료기관에서 사용하는 방법은 AChE와 BChE의 활성을 저해하는 Donepezil, Rivastigmine, Galantamine 등과 같은 약제를 처방하고 있으나 장기복용에 따른 오심, 구토, 체중 감소, 수면 장해 등의 부작용이 발생하고 있다 (Ikeya et al., 2004).
치매의 중요 증상은 무엇인가?
노화와 밀접한 관련이 있는 질병에 치매가 있으며, 매년 65세 이상 노인의 치매 환자 수가 전 세계에서 증가하고 있다. 치매의 중요 증상은 기억력 감퇴와 인지 능력의 퇴화이며 이로 인해 인간의 삶이 황폐화되고 완치가 불가능한 퇴행성 질병이다 (Nordberg, 1996). 치매 중 가장 많이 알려진 병은 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease, AD)으로 전 세계 치매 환자의 약 70% 이상을 차지하고 있다(Selkoe, 1991).
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