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문제 정의
- 이전 보고들에서 Torilis japonica extract (TJE)는 MAPKinase와 NF-κB와AP-1 전사인자의 활성을 억제함을 보여 주었다10,11). 따라서 본 연구에서는 자외선에 의한 MMP-1과 MMP-3 활성에 TJE의 억제 효과가 있을 것으로 사료되어, 효과와 그 기전을 관찰하여 그 결과를보고하는 바이다.
- 따라서 본 저자는 UVB 노출 후 유도되는 MMP-1과 MMP-3발현 조절에 있어 사상자 추출물의 효과와 신호 기전에 초점을 두었다. 본 연구에서 HDFs에서 사상자 추출물의 처리가 UVB에 의해유도되는 MMP-1과 MMP-3의 발현을 억제하는 것을 보여주었다(Fig.
제안 방법
- HDFs에 UVB 25 mJ/㎠를 조사한 후 사상자 추출물을 3시간동안 처리하였다. 차가운 PBS로 세척 후, cytoplasmic과 nuclearextract 분리는 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic ExtractionReagents (Thermo Scientific.
- HDF는 PBS로 두 번 세척한 후 소량의 PBS를 넣고 UVcrosslinker (6×8 W, 312 nm, Model CL-508M, Vilberlourmat, Paris, France)를 이용하여 UVB 25 mJ/㎠를 조사해 주었다.
- . Realtime RT-PCR (Applied Biosystems, USA)을 수행하여 MMP-1과MMP-3 유전자 발현양을 확인하였고, housekeeping gene(GAPDH)과 비교하여 정량화하였다. MMP-1 (NM 002424.
- Trizol Reagent (Life Technology, USA)을 이용하여 RNA를추출하였고, Prime- Script™ RT reagent Kit (TaKaRa, Shiga,Japan)를 이용하여 제품 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다.
- 따라서 본 실험은 25 μg/ml과 50 μg/ml의 농도를 최적농도로 설정하여 다음 실험을 진행하였다.
- 따라서, HDFs에서 UVB 조사에 의해유도되는 MMP-1과 MMP-3 발현 증가에 대한 사상자 추출물의 효과를 확인하였다. UVB 조사에 의해 증가된 MMP-1과 MMP-3 단백질 발현은 사상자 추출물 처리에 의해 효과적으로 억제되었다 (Fig.
- 자외선 자극에 의한 세포생존율에 대한 사상자의 영향을 살펴보기 위해 HDFs에 25 mJ/㎠UVB를 조사한 후 사상자를 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 후세포를 trypsine처리에 의해 배양접시에서 떼어 낸 후 trypanblue 염색 후 hemocytometer에서 염색되지 않은 세포를counting 하여 측정하였다. 세포수는 다음 식으로 결정하였다.
- 사상자 추출물의 MMP-1과 MMP-3 억제 효과의 세포 내 기전을 더 명확하게 하기 위하여 전사인자 활성에 대한 영향을 확인하였다. 그 결과 UVB 조사에 의해 세포질 내 NF-κB 조절 매개체인IκBα의 붕괴에 의해 NF-κB의 구성 인자인 p65와 p50의 세포질에서 핵으로의 이동 증가에 의해 NF-κB의 활성화가 증가되고, 핵내AP-1의 구성 인자인 c-Jun의 인산화 증가에 의해 AP-1의 활성화가 증가되었다.
- 사상자 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 HDFs에 다양한농도로 처리한 후 24시간 배양하였다. 그 후 세포 생존율을EZ-Cytox Enhanced Cell Viability Aassay Kit를 사용하여 측정한 결과 100 μg/ml까지 유해한 영향은 나타나지 않았다(Fig.
- 우선, UVB가 유도하는 세포 독성에 대한 사상자 추출물의 세포 보호 효과를 확인하기 위하여,HDFs에 UVB 25 mJ/㎠을 조사 후 25 μg/ml과 50 μg/ml의 사상자 추출물를 세포에 처리 한 후 24 시간 배양 후 trypan blue 염색을 하였다. 염색되지 않은 세포를 살아있는 세포로 판단하여 그개수를 세어 확인하였다. 그 결과 UVB에 대한 세포 독성이 사상자추출물 처리에 의해 보호되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 우선, UVB가 유도하는 세포 독성에 대한 사상자 추출물의 세포 보호 효과를 확인하기 위하여,HDFs에 UVB 25 mJ/㎠을 조사 후 25 μg/ml과 50 μg/ml의 사상자 추출물를 세포에 처리 한 후 24 시간 배양 후 trypan blue 염색을 하였다.
- 20 μg의 단백질은 전기영동을 시행하여 분리하였고, Hybond™-polyvinylidenefluoride membranes (GE Healthcare Life Sciences,Buckinghams hire, UK)에 이동하였다. 일차항체는 1 : 1000으로희석하여 사용하였고, 단백질 발현양은 image analyzer (Uvitex,Cambri dge, UK)를 사용하여 확인하였다.
- 반응 후ELISA reader (SunriseTM; Tecan, Männedorf, Switzerland)를사용하여 450 nm 흡광도를 측정하였다. 자외선 자극에 의한 세포생존율에 대한 사상자의 영향을 살펴보기 위해 HDFs에 25 mJ/㎠UVB를 조사한 후 사상자를 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 후세포를 trypsine처리에 의해 배양접시에서 떼어 낸 후 trypanblue 염색 후 hemocytometer에서 염색되지 않은 세포를counting 하여 측정하였다.
- 차가운 PBS로 세척 후, cytoplasmic과 nuclearextract 분리는 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic ExtractionReagents (Thermo Scientific. Rockford, USA)를 사용하여 제품 매뉴얼에 따라서 수행하였다.
대상 데이터
- β-actin 항체는 SIGMA에서 구입하였다.
- 일차항체 proliferating cell nuclear antigen (PCNA), p65, p50,그리고 IκBα 및 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (SantaCruz, CA, USA)에서 구입하였다. High glucose-containingDMEM, 소배아혈청, 항생제, trypsin 그리고 phosphatebuffered saline (PBS)는 Gibco-BRL에서 구입하였다.
- MMP-1과 MMP-3 항체는R&D Systems (R&D systems, Minnea polis, USA)에서 구입하였다.
- 사람 피부에서 분리한 피부 섬유아세포 neonatal humandermal fibro blasts (HDFs)는 GIBCO (Invitrogen, Carlsbad,CA, USA) 회사에서 구입하여 사용하였으며, DMEM 배지에 10 %소 배아 혈청과 1 % 항생제를 첨가하여 사용하였고 37℃, 5 %CO2가 든 incubator에서 배양하였다. MMP-1과 MMP-3 항체는R&D Systems (R&D systems, Minnea polis, USA)에서 구입하였다.
- 사상자는 광명당(울산, 대한민국)에서 구입한 후 원광대학교 한의과대학 본초학 교실에서 진품 여부를 검증 받았으며, 추출물을아래와 같이 분리하였다. 사상자 100 g을 1000 ml의 증류수에 2시간 동안 100 ℃에서 전탕 후 무형광 솜을 이용하여 여과한 후침전물이 생기지 않도록 45 ℃에서 Rotary Evaporator(N-1000SWD, EYELA, JAPAN)를 이용하여 농축한 다음 건조하여6.
- 일차항체 proliferating cell nuclear antigen (PCNA), p65, p50,그리고 IκBα 및 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (SantaCruz, CA, USA)에서 구입하였다.
- β-actin 항체는 SIGMA에서 구입하였다. 일차항체phospho(p)-p38, p-ERK, p-JNK, p38, ERK, JNK 그리고p-c-Jun은 cell signaling (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다.일차항체 proliferating cell nuclear antigen (PCNA), p65, p50,그리고 IκBα 및 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (SantaCruz, CA, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 2)primer: sense, 5'-AGTGACTGGGAACCGATGCTGA-3' andantisense, 5'-CTCTTGGCAAATCTGGCCTGTAA-3'; MMP-3 (NM 002422) primer: sense, 5'-ATTCCATGGAGCCAGGCTTTC-3' and anti sense,5'-CATTTGGGTCAAACTCCAACTGTG-3'and GAPDH (NM 002046) primer: sense, 5'-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3' and anti sense, 5'-CGCCCCACTTGATTTTGG-3'. 이를 One-Way ANOVA test (Microcal Origin;version6.0; Microsoft; USA)를 이용하여 유의성을 검증하였다.그리고, p < 0,05dl 것만 유의한 것으로 하였다.
이론/모형
- MAPKinase는 p38, ERK와 JNK로 구성되어 있으며,UVB 자극에 의해 활성을 가진 인산화 형태가 유도된다고 알려져있다10). 따라서, 사상자 추출물의 UVB-induced MAPKinase 활성에 대한 영향을 확인하기 위하여, western blot 방법을 이용하여MAPKinase 인사화를 측정하였다. 그림 3에서 보는 것과 같이UVB 조사는 MAPKinase 구성원인 p38, ERK, JNK의 인산화를 매우 효과적으로 증가시키며, 사상자 추출물의 처리는 ERK를 제외한p38과 JNK의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다(Fig.
- 사상자의 농도에 대한 세포 생존율에 대한 영향은 EZ-CytoxEnhanced Cell Viability Aassay Kit (DOGEN, Seoul, Korea)를 사용하여 제공되는 방법에 따라서 측정하였다.
성능/효과
- 그 결과 UVB 조사에 의해 세포질 내 NF-κB 조절 매개체인IκBα의 붕괴에 의해 NF-κB의 구성 인자인 p65와 p50의 세포질에서 핵으로의 이동 증가에 의해 NF-κB의 활성화가 증가되고, 핵내AP-1의 구성 인자인 c-Jun의 인산화 증가에 의해 AP-1의 활성화가 증가되었다.
- 염색되지 않은 세포를 살아있는 세포로 판단하여 그개수를 세어 확인하였다. 그 결과 UVB에 대한 세포 독성이 사상자추출물 처리에 의해 보호되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B).
- 그 기전으로는MAPKinase의 인산화를 억제하고, 전사인자인 NF-κB 와 AP-1의활성을 억제하는 것으로 확인되었다. 이런 결과들은 사상자 추출물이 자외선에 의한 피부노화에서 예방물질 및 치료제의 후보 물질이될 수 있는 실험적 근거로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 따라서, 사상자 추출물의 UVB-induced MAPKinase 활성에 대한 영향을 확인하기 위하여, western blot 방법을 이용하여MAPKinase 인사화를 측정하였다. 그림 3에서 보는 것과 같이UVB 조사는 MAPKinase 구성원인 p38, ERK, JNK의 인산화를 매우 효과적으로 증가시키며, 사상자 추출물의 처리는 ERK를 제외한p38과 JNK의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 3).
- 2A). 또한 Real time PCR 방법을 이용하여 mRNA 발현을 조사한결과 사상자 추출물이 UVB 조사에 의해 증가하는 MMP-1과MMP-3의 mRNA 발현을 유의하게 억제함을 확인하였다(Fig. 2B).
- 또한, NF-κB와 AP-1은 자외선에의한 피부세포 노화에서 중요한 역할을 하는 전사인자로 알려져 있으며10), 본 연구 결과에서도 사상자 추출물은 UVB에 의해 활성화되는 두 전사인자의 활성을 억제하였다(Fig. 4).
- 본 연구를 통하여 사상자 추출물은 HDFs에서 UVB로 유도된MMP-1과 MMP-3 발현을 유의하게 억제하였다. 그 기전으로는MAPKinase의 인산화를 억제하고, 전사인자인 NF-κB 와 AP-1의활성을 억제하는 것으로 확인되었다.
- 본 연구에서 HDFs에서 사상자 추출물의 처리가 UVB에 의해유도되는 MMP-1과 MMP-3의 발현을 억제하는 것을 보여주었다(Fig. 2). 이러한 결과는 사상자 추출물이 자외선에 의한 피부 노화예방 및 치료효과가 있을 것임을 시사한다.
- MAPKinase 억제제가 자외선 유도 MMP발현 억제한다는 연구결과를 봐도 알 수 있듯이 자외선에 의한 피부 노화에서도 중요 신호경로 단백질로 알려져 있다23). 본 연구에서 사상자 추출물은 p38과 JNK 두 가지 MAPKinase 활성을 억제하는 것을 보여주었다(Fig. 3). 또한, NF-κB와 AP-1은 자외선에의한 피부세포 노화에서 중요한 역할을 하는 전사인자로 알려져 있으며10), 본 연구 결과에서도 사상자 추출물은 UVB에 의해 활성화되는 두 전사인자의 활성을 억제하였다(Fig.
- 이러한 UVB에 의한 NF-κB 와 AP-1활성 증가를사상자 추출물 처리에 의해서 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 4).
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 사상자 추출물은 자외선에 의한 피부 노화에서MAPKinase 활성 억제에 의한, NF-κB 와 AP-1 활성 억제에 의해MMP-1과 MMP-3 발현을 억제함으로써 자외선에 의한 피부노화증상을 완화시킬 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 그 기전으로는MAPKinase의 인산화를 억제하고, 전사인자인 NF-κB 와 AP-1의활성을 억제하는 것으로 확인되었다. 이런 결과들은 사상자 추출물이 자외선에 의한 피부노화에서 예방물질 및 치료제의 후보 물질이될 수 있는 실험적 근거로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 향후 본 연구를 바탕으로 사상자 추출물의 자외선에 의한 피부노화 효과를 전임상과 임상적으로 입증하기 위한 후속 연구가 행해져야 하며, 이를 통해 사상자 추출물이 항 노화 제제 개발의 후보물질이 될 수 있을 것이다.
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