[논문]칼럼 동위원소 희석법으로 정량한 혈청 속 셀레노단백질과 한국인 위암의 상관관계 연구

김수진; 박용남

doi:10.5012/jkcs.2019.63.5.387

[국내논문] 칼럼 동위원소 희석법으로 정량한 혈청 속 셀레노단백질과 한국인 위암의 상관관계 연구
A Study of Relationship between Korean Stomach Cancer and Selenoproteins in Blood Serum Determined by Post Column Isotope Dilution Method 원문보기

대한화학회지 = Journal of the Korean Chemical Society, v.63 no.5, 2019년, pp.387 - 391

김수진 (한국교원대학교 화학교육과) , 박용남 (한국교원대학교 화학교육과)

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주제어

표/그림 (7)

그림 Figure 1. Comparison of stomach cancer and control groups for each selenoprotein concentration.
표 Table 1. Concentrations of selenoproteins for stomach cancer and control groups determined by PCID
그림 Figure 2. Comparison of two groups with age.
표 Table 2. Concentrations of selenoproteins for controlled group with age
표 Table 3. Concentrations of selenoproteins for stomach cancer group with age
표 Table 4. Concentrations of selenoproteins with cancer developing stage
표 Table 5. Experimental conditions of separating selenoproteins with Affinity columns

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문제 정의

⁹ 동위원소 희석법에서는 단순한 신호의 세기변화는 상관없지만 후 컬럼 동위원소 희석법처럼 스파이크 동위원소를 지속적으로 주입하는 경우에는 바탕에 해당하는 신호가 피크 전후에서 변하게 되고 피크의 모양이 대칭적이지 않게 되어 정확한 농도를 계산하는 것이 어렵게 된다. 따라서 선행연구¹⁰에서처럼 용리액으로 ammonium nitrate(AN)를 사용하여 탄소원을 제거하고 신호의 변화를 최소화하고자 하였다.

제안 방법

따라서 본 연구에서는 77Se을 스파이크 동위원소로 사용하고78 Se을 대응하는 동위원소 피크로 사용하여 77Se/78Se를 측정하여 80[79Br1H]에 의한 간섭을 배제하였다.
80Se에 동중간섭을 일으키는 BrH의 생성을 억제하기 위하여 음이온계 SPE를 사용하여 시료매트릭스에 존재하는 Br의 직접적인 제거를 시도하였다. 0.
즉, 비교적 높은 농도의 Br에서는 SPE 사용 후에도 정확도는 개선되지 않았고, 오히려 SPE 음이온 교환수지가 셀레늄의 일부를 매트릭스와 함께 제거하는 것으로 보인다. 따라서, 본 연구에서는 SPE를 사용하지 않고 ⁷⁷Se/⁷⁸Se를 측정함으로서 ⁸⁰[⁷⁹Br¹H]에 의한 브롬의 간섭을 배제하였다.
위암환자 30명에 대한 혈청에서의 셀레노 단백질을 분석하고 이를 대조군 30명과의 결과와 비교하여 다음의 Table 1에 나타내었다. 대조군으로는 순환기 질환 환자를 사용하였고 그 값들을 일반인에 대한 타 연구들과 비교하였다. 본 연구에서 얻은 순환기 질환 환자들의 값은 90.
위암환자 그룹 또한 나이에 따라 셀레늄의 농도가 대체적으로 감소하는 경향을 보인다. 연령대 별로 나누어서 두 그룹간의 총 셀레노 단백질의 농도를 비교하여 나타내었다(Fig. 2).
혈청은 –70°C에 보관하였으며, 분석하기 전 0.45µmfilter를 이용하여 거른 후 분석하였다.
평형과 용리 완충액을 처음부터 AN으로 사용할 경우 분무기의 끝에서 염이 쉽게 생성되고 시간이 지남에 따라 플라즈마가 꺼지는 현상과 분무효율의 변화로 신호값이 불안정하였다. 따라서 용리를 시작하는 단계에서는 낮은 농도의 AA를 이용하고 GPx와 SelP가 용리된 후에는 높은 농도의 AN을 사용하여 SeAlb를 용리시키면서 염이 생성되는 것을 최소화하여 안정된 바탕값을 갖도록 하였다.

대상 데이터

Table 4은 암 단계에 따른 셀레노 단백질의 농도를 정량한 값이다. 초기를 T1, 중기는 T2와 T3, 말기는 T4로 나타내었고 각 단계별로 약 10여명씩 조사하였다. GPx는 암의 진전에 크게 달라지지 않으며 SelP는 말기에 약간 낮게, 그리고 SeAlb 또한 말기에 가장 낮은 것으로 나타난다.
1% 수준이었다. AA(99.99%)와 AN(98% 이상)는 Sigma-Aldrich(Youngin, South Korea)에서 구입하였다. 위암환자 혈청은 아주대학교 인체자원 단위은행에서 제공받아 사용하였고, 통제군으로 사용된 순환기질환 혈청은 경북대학교 인체자원 단위은행으로부터 제공받았다.
99%)와 AN(98% 이상)는 Sigma-Aldrich(Youngin, South Korea)에서 구입하였다. 위암환자 혈청은 아주대학교 인체자원 단위은행에서 제공받아 사용하였고, 통제군으로 사용된 순환기질환 혈청은 경북대학교 인체자원 단위은행으로부터 제공받았다. 대조군의 평균 연령은 53.

이론/모형

45µmfilter를 이용하여 거른 후 분석하였다. 본 연구에서의 실험방법은 선행연구¹⁷에서 사용한 기법을 기본적으로 적용하였다. Heparin과 Blue 친화 컬럼을 6-way 밸브에 연결시키고 혈청시료를 보내어 SelP와 SeAlb을 분리시킨 뒤, 용리액 0.

성능/효과

¹⁻⁵ Davis²는 임상실험을 통해서 인체에서 셀레늄의 농도가 낮은 그룹에서는 간암 발생률이 약 2배∼6배 정도 더 증가한다고 발표하였다. 또한, 일정 지역의 사람들에게 셀레늄을 보충한 식품이나 효모를 섭취하게 하였을 때 암 발생률이 현저하게 감소함을 확인하였다. Meyer^3,4는 전립선 암환자와 신장 암환자들을 대상으로 연구하였는데 특히 SelP의 농도가 건강한 사람에 비해서 낮음을 보고하였다.
Reszka⁶는 방광암 환자들의 경우 방광 종양 발생 시에 Se의 농도와 GPx의 활성도가 증가하지만 발생 단계가 지난 암 환자들의 경우에는 반대로 감소한다는 흥미로운 연구 결과를 발표한 바 있다. 결론적으로 인체내에서 암 발생 단계전과 발생 후의 셀레노 단백질의 농도의 변화는 서로 밀접한 관계가 있는 것으로 보이며 이에 따라 셀레노 단백질이 암 진단에서 생물학적 지표의 보조 척도가 될 수 있을 것으로 예상된다. 이에 따라, 본 연구실에서는 이미 검정곡선법을 사용하여 혈청에서의 셀레노 단백질을 정량하고 암과의 상관관계를 일차로 보고한 바 있다.
요약하면 본 연구에서는 ⁷⁷Se을 사용한 후 컬럼 동위원소 희석법을 적용하고 셀레늄의 신호에 대한 감도가 변하지 않는 안정된 용리액을 사용하여 위암환자의 혈청 내에서 셀레노 단백질에 대한 정확한 분석을 통해 위암진단에 대한 생지표로서의 활용가능성을 타진하였다.
Se에 동중간섭을 일으키는 BrH의 생성을 억제하기 위하여 음이온계 SPE를 사용하여 시료매트릭스에 존재하는 Br의 직접적인 제거를 시도하였다. 0.25 ppm인 셀레늄 표준용액에 10 ppm의 Br을 넣은 용액을 만들고 동위원소 희석법을 적용하여 구한 결과, SPE사용 전과 후에 각각 128%와 69%의 회수율을 얻었다. 즉, 비교적 높은 농도의 Br에서는 SPE 사용 후에도 정확도는 개선되지 않았고, 오히려 SPE 음이온 교환수지가 셀레늄의 일부를 매트릭스와 함께 제거하는 것으로 보인다.
25 ppm인 셀레늄 표준용액에 10 ppm의 Br을 넣은 용액을 만들고 동위원소 희석법을 적용하여 구한 결과, SPE사용 전과 후에 각각 128%와 69%의 회수율을 얻었다. 즉, 비교적 높은 농도의 Br에서는 SPE 사용 후에도 정확도는 개선되지 않았고, 오히려 SPE 음이온 교환수지가 셀레늄의 일부를 매트릭스와 함께 제거하는 것으로 보인다. 따라서, 본 연구에서는 SPE를 사용하지 않고 ⁷⁷Se/⁷⁸Se를 측정함으로서 ⁸⁰[⁷⁹Br¹H]에 의한 브롬의 간섭을 배제하였다.
1%로 존재한다고 보고하였다. 순환기 질환 그룹은 농도나 분포에서 일반 건강한 사람들과 차이가 없는 것으로 보이며 따라서 이들의 값을 위암의 대조군값으로 사용하여도 좋다고 결론지을 수 있다.
이 때 그림의 각 오차 막대는 표준편차를 나타내고 있다. 위암환자 그룹에서는 세 종류의 셀레노 단백질을 비교해보면 모두 감소되었고 특히 SelP의 감소(43%)가 가장 두드러져 보인다.
대조군의 전체 셀레노 단백질의 함량은 30대에서 70대까지 대체적으로 감소하는 경향을 보이고 있다. 이러한 결과는 Jitaru¹⁵가 건강한 사람들을 대상으로 한 연구에서 일반적으로 연령대가 높아짐에 따라 전체적으로 낮아지는 결과와 일치한다.
이러한 결과는 Jitaru¹⁵가 건강한 사람들을 대상으로 한 연구에서 일반적으로 연령대가 높아짐에 따라 전체적으로 낮아지는 결과와 일치한다. 본 연구에서는 GPx나 SeAlb과는 달리 특이하게 SeAlb에 대한 경향성은 보이지 않았다. Klapcinska¹⁶는 실레지아 지방(체코 북부 및 폴란드 남부지방)에서 10세에서 105세를 대상으로 체내 셀레늄 농도를 자세히 측정하였는데 10세부터 40세까지는 증가(59.
GPx는 암의 진전에 크게 달라지지 않으며 SelP는 말기에 약간 낮게, 그리고 SeAlb 또한 말기에 가장 낮은 것으로 나타난다. 전체 셀레노 단백질의 함량을 보면 초기에서 말기로 진행됨에 따라 약간 감소하는 경향을 보이지만 값의 차이는 크지 않은 것으로 보인다. 이러한 말기로 갈수록 감소되는 경향성은 방광암 환자의 경우에도 마찬가지로 나타난다고 보고한 Reszka⁶의 연구 결과와 유사하다.

후속연구

⁷ 이 방법은 비록 간단하고 상대적으로 쉽게 분석할 수 있으나 확실한 결론을 위하여서는 더욱 엄밀한 정확도를 가진 더 나은 정량방법이 요구된다. 본 연구에서는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서 좀 더 개선된 분리방법과 정확한 정량법인 동위원소 희석법을 적용하여 한국인 위암과 혈청에서의 셀레노 단백질과의 상관관계를 더욱 확실하게 규명할 수 있을 것으로 생각된다. 동위원소 희석법을 이용한 셀레늄의 분석에서는 일차적으로는 ⁷⁸Se를 스파이크 동위원소로 사용하고 ⁸⁰Se를 대응하는 동위원소로 사용하는 것을 생각할 수 있다.
8 µg L⁻¹로 넓은 범위에 거쳐 분포하였고 환자들의 상태와 흡연 여부, 성별 등에 따라 체내 셀레노 단백질 함량의 차이를 보인다고 보고하였다. 좀 더 엄밀한 결론을 위하여서는 흡연유무나 성별, 및 영양상태 등의 여러 변수에 대비하여 더 넓은 시료를 대상으로 확대하여 조사하여야 할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	평형과 용리 완충액을 처음부터 AN으로 사용할 경우의 특징은 무엇인가?	본 연구에서는 이동상의 조건만 변하였는데 다음의 Table 5에 그 조건을 나타내었다. 평형과 용리 완충액을 처음부터 AN으로 사용할 경우 분무기의 끝에서 염이 쉽게 생성되고 시간이 지남에 따라 플라즈마가 꺼지는 현상과 분무효율의 변화로 신호값이 불안정하였다. 따라서 용리를 시작하는 단계에서는 낮은 농도의 AA를 이용하고 GPx와 SelP가 용리된 후에는 높은 농도의 AN을 사용하여 SeAlb를 용리시키면서 염이 생성 되는 것을 최소화하여 안정된 바탕값을 갖도록 하였다.
	용리액으로 ammonium nitrate를 셀레늄의 신호 세기가 용리액의 농도에 따라 변하는 AA 대신 사용한 이유는 무엇인가?	용리액으로는 그 동안 주로 ammonium acetate(AA)가 사용되었는데 셀레늄의 신호의 세기가 용리액의 농도에 따라서 변하게 되는 현상이 관찰되었고, 이는 탄소가 셀레늄의 이온화를 촉진시키기 때문으로 생각된다. 9 동위원소 희석법에서는 단순한 신호의 세기변화는 상관없지만 후 컬럼 동위원소 희석법처럼 스파이크 동위원소를 지속적으로 주입하는 경우에는 바탕에 해당하는 신호가 피크 전후에서 변하게 되고 피크의 모양이 대칭적이지 않게 되어 정확한 농도를 계산하는 것이 어렵게 된다. 따라서 선행연구10에서처럼 용리액으로 ammonium nitrate(AN)를 사용하여 탄소원을 제거하고 신호의 변화를 최소화 하고자 하였다.
	셀레노 단백질이 암 진단에서 생물학적 지표의 보조 척도가 될 수 있는 이유는 무엇인가?	Reszka6 는 방광암 환자들의 경우 방광 종양 발생 시에 Se의 농도와 GPx의 활성도가 증가하지만 발생 단계가 지난 암 환자들의 경우에는 반대로 감소한다는 흥미로운 연구 결과를 발표 한 바 있다. 결론적으로 인체내에서 암 발생 단계전과 발 생 후의 셀레노 단백질의 농도의 변화는 서로 밀접한 관계가 있는 것으로 보이며 이에 따라 셀레노 단백질이 암 진단에서 생물학적 지표의 보조 척도가 될 수 있을 것으로 예상된다. 이에 따라, 본 연구실에서는 이미 검정곡선법을 사용하여 혈청에서의 셀레노 단백질을 정량하고 암과의 상관관계를 일차로 보고한 바 있다.

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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