[논문]초임계 복령피 추출물의 생리활성 및 경피투과 펩티드를 이용한 경피 약물전달의 응용

김민기; 박수인; 안규민; 허수현; 신문삼

doi:10.12925/jkocs.2019.36.3.766

초임계 복령피 추출물의 생리활성 및 경피투과 펩티드를 이용한 경피 약물전달의 응용
Physiological Activity of Supercritical Poria cocos back Extract and Its Skin Delivery Application using Epidermal Penetrating Peptide 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.36 no.3, 2019년, pp.766 - 778

김민기 (을지대학교 대학원 시니어헬스케어학과 화장품약리학 전공) , 박수인 (을지대학교 대학원 시니어헬스케어학과 화장품약리학 전공) , 안규민 (을지대학교 대학원 시니어헬스케어학과 화장품약리학 전공) , 허수현 (을지대학교 대학원 시니어헬스케어학과 화장품약리학 전공) , 신문삼 (을지대학교 대학원 시니어헬스케어학과 화장품약리학 전공)

초록
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본 연구에서는 초임계 공정에 의해 복령피를 추출하였고, 에탄올 복령피 추출물과 비교하여 항염, 미백, 항산화효과를 측정하였다. 또한 선정된 추출물의 제형과 약물전달 펩티드를 활용하여 효율적인 경피투과 방법을 제시하였다. 복령피의 항암, 항염성분으로 알려진 Pachymic acid를 지표성분으로 HPLC 분석 결과 에탄올 복령피 추출물 보다 초임계 복령피 추출물이 2배 이상 높게 추출되는 것으로 나타났다. 복령피의 항산화효과를 확인하기 위하여 DPPH 소거능과 ABTS 소거능은 복령피 에탄올 추출물이 초임계 복령피 추출물보다 더 낮은 농도에서 $IC_{50}$을 나타내었다. 하지만 RAW 264.7 세포 내 NO(Nitric oxide) 생성량을 측정한 결과에서는, 에탄올 복령피 추출물보다 초임계 복령피 추출물이 동일 농도에서 더 낮은 NO 생성량을 나타냈다. 또한 B16 melanoma 세포에 복령피 추출물을 $20{\mu}g/mL$ 농도를 72시간 처리 후 세포 내외 멜라닌 합성을 확인한 결과에서는, 에탄올 복령피 추출물과 초임계 복령피 추출물 모두 효과가 있었으며 초임계 추출물이 더 낮은 멜라닌 함량을 보였다. NO 생성량 실험에서 활용된 RAW 264.7 세포에서는 $800{\mu}g/mL$농도에서도 독성이 나타나지 않았다. 하지만 B16 melanoma 세포에서는 $50{\mu}g/mL$에서도 에탄올 추출물과 초임계 추출물 모두 60 % 미만의 생존율을 나타냈다. 초임계 복령피 추출물을 대상으로 리포좀 제형과 약물전달 펩티드를 활용하여 Franz diffusion cell 실험 결과에서는, 리포좀 제형과 약물 전달 펩티드가 초임계 복령피 추출물을 경피 투과를 증진시켜 주는 것으로 나타났다. 초임계 복령피 추출물이 다양한 효능의 화장품 소재로서 개발될 가능성이 있다고 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, Poria cocos bark were extracted by supercritical process, and anti-inflammatory, whitening, and antioxidant effects were measured in comparison with ethanol extract. Also, An effective percutaneous permeation method using a selected formulation of the extract and a drug delivery peptide was proposed. Pachymic acid, known as the anti-cancer and anti-inflammatory compound of the ventricle, is an indicator component and the HPLC analysis shows that the supercritical extract of the pericardium is more than twice that of the Poria cocos bark extract. In order to confirm antioxidative effect of Bombyx mori, DPPH scavenging ability and ABTS scavenging ability test showed that the ethanol extract of Poria cocos Back had lower concentration than the supercritical extract of Poria cocos back. However, RAW 264.7 Measurements of Nitric oxide (NO) production in cells showed lower NO production at the same concentration than the Poria cocos back ethanol extract. In addition, after 72 hours of processing of $20{\mu}g/mL$ of the Poria cocos back extract in B16 melanoma cells, both the intracellular and extracellular melanin extract were effective and the supercritical extract was lower melanin content. No toxicity was observed at the concentration of $800{\mu}g/mL$ in RAW 264.7 cells used in NO production experiments. However, in B16 melanoma cells, even at $50{\mu}g/mL$, both Poria cocos back ethanol extract and supercritical extract showed a survival rate of less than 60%. The liposome formulation and drug delivery peptides were shown to be useful for percutaneous permeation of Supercritical Extract of Poria cocos back using a liposome formulation and a drug delivery peptide. it is expected that there will be great potential for development as a variety of cosmetic materials for Poria cocos back.

주제어

표/그림 (11)

표 Table 1. Total pachymic acid contents of ethanolic extracts from Poria cocos bark and supercritical extracts from Poria cocos bark.
표 Table 2. DPPH radical scavenging activity rate of ethanolic extracts from Poria cocos back and supercritical extracts from Poria cocos back
표 Table 3. ABTS radical scavenging activity rate of ethanolic extracts from Poria cocos back, supercritical extracts from Poria cocos back
그림 Fig. 1. Nitric oxide levels(of control) of LPS-stimulated RAW 264.7 cell on each concentration of ethanolic extracts from Poria cocos back, supercritical extracts from Poria cocos back.
표 Table 4. Nitric oxide levels(of control) of LPS-stimulated RAW 264.7 cell on each concentration of ethanolic extracts from Poria cocos back, supercritical extracts from Poria cocos back
그림 Fig. 2. Viability level of α-MSH B16 cell on each concentration of ethanolic extracts from Poria cocos back, supercritical extracts from Poria cocos back.
표 Table 5. Viability (% of control) level of α-MSH B16 cell on each concentration of ethanolic extracts from Poria cocos back, supercritical extracts from Poria cocos back
그림 Fig. 3. Melanin level of α-MSH B16 cell on each concentration of ethanolic extracts from Poria cocos back, supercritical extracts from Poria cocos back.
표 Table 6. Melanin level of α-MSH B16 cell on each concentration of ethanolic extracts from Poria cocos back, supercritical extracts from Poria cocos bark
그림 Fig. 4. In vitro skin permeation profiles of Poria cocos back in 1,3 BG and mixed liposome and mixed liposome with R6 peptide.
표 Table 7. In vitro skin permeation profiles of Poria cocos bark in 1,3 BG and mixed liposome and mixed liposome with R6 peptide

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 항알러지, 항암 등 다양한 효과를 가지고 있는 복령피를 대상으로 항염, 미백, 항산화 화장품 소재로서의 가능성을 제시하며 추출방법에 따른 복령피에 포함된 유효성분의 효능을 비교하여 추출조건을 제시하였다. 그리고 본 연구결과는 복령피가 다양한 효능의 화장품 소재로서 적용하는데 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.
본 연구에서는 복령피 속에 내포되어 있는 항염, 미백, 항산화 성분들을 확인하고 에탄올, 초임계 추출법에 따른 효능 차이를 확인하고자 하였다. 또한 복령피에 포함된 Pachymic acid를 효율적으로 추출하기 위한 추출공정을 선정하여 제시하고자 한다.
Pachymic aicd가 포함된 복령피 추출물 또한 난용성이다. 복령피 추출물의 난용성 문제를 해결하고자 리포좀 제형 방법을 이용해서 유효추출물을 리포좀과 혼합하여 난용성 문제를 해결하고자 한다[13].
본 연구에서는 복령피 속에 내포되어 있는 항염, 미백, 항산화 성분들을 확인하고 에탄올, 초임계 추출법에 따른 효능 차이를 확인하고자 하였다. 또한 복령피에 포함된 Pachymic acid를 효율적으로 추출하기 위한 추출공정을 선정하여 제시하고자 한다.
최근 리포좀을 활용한 활성 성분의 약물전달 연구가 많이 진행되고 있다. 본 연구에서는 복령피의 유효성분을 표피의 각질층을 투과시켜 피부에서 유효한 효능을 내고자 한다 [11,12]. 복령피의 유효성분으로 알려진 pachymic acid는 난용성 성분으로 알려져 있다.
복령피는 복령에 비해 활용도가 낮고 현재 많은 양이 버려지고 저렴한 가격에 판매되고 있으며 그 가치가 저평가되어왔다. 본 연구에서는 에탄올 및 초임계 추출법을 이용하여 추출된 복령피의 유효성분을 HPLC를 활용한 분석을 통하여 보다 효율적인 추출법을 제시하고 복령피 추출물의 화장품 소재로서의 활용 가능성을 확인하고자 한다.

제안 방법

96well에 Media를 제거한 후 CCK-8(10 %)혼합한 Media를 plate에 처리 후 2 – 4 h 동안 37 ℃, 5 % CO₂세포 배양기에 배양 후 ELISA Reader로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
ABTS 라디칼 소거능을 측정하기 위하여 복령피 에탄올 추출물, 복령피 초임계 추출물을 각각 450 μg/mL, 225 μg/mL, 112.5 μg/mL의 농도로 희석하여 실험하였다.
B는 4 h에서 26.34 μg/㎠ 투과하였으며 8 h에서 39.51 μg/㎠, 12 h에서 46.37 μg/㎠, 16 h에서 54.45 μg/㎠, 20 h에서 58.27 μg/㎠, 24 h에서 60.48 μg/㎠ 투과하였 으며 C는 4 h에서 35.44 μg/㎠ 투과하였으며 8 h에서 45.18 μg/㎠, 12 h에서 56.20 μg/㎠, 16 h에서 60.61 μg/㎠, 20 h에서 63.98 μg/㎠, 24 h에서 66.40 μg/㎠ 투과하였다.
DPPH 라디칼 소거능을 측정하기 위하여 복령피 에탄올 추출물, 복령피 초임계 추출물을 각각 5,000 μg/mL, 2500 μg/mL, 1250 μg/mL, 625 μg/mL, 312.5 μg/mL의 농도로 희석하여 실험하였다.
배양 후 곧바로 extra cell Melanin을 측정하기 위해 상층액을 96 well에 넣은 후 ELISA Reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 Melanin의 양을 측정하였다. Intra cell Melanin을 측정하기 위해 Media를 제거한 후 1 N NaOH를 처리하고 60℃에서 30분간 방치 후 세포를 용해시켜 ELISA Reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 Melanin의 양을 측정하였다[8].
NO(Nitric oxide) 생성량 측정을 위하여 복령피 에탄올 추출물, 복령피 초임계 추출물을 각각 800 μg/mL, 400 μg/mL, 200 μg/mL, 100 μ g/mL의 농도로 희석하여 실험하였다.
Sodium nitrite를 Griess reagent와 동량으로 혼합 후 상온에서 10분간 반응 후 ELISA reader로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다[19]. NO의 양은 sodium nitrite로부터 얻은 표준곡선을 이용하여 결정하였으며, 최종 NO의 양은 일정 단백질당 NO 양으로 환산하여 음성대조군과 비교하였으며 NO 생성 억제능은 LPS 자극 NO량 - 추출물 NO 양으로 계산하였다.
Pachymic acid를 표준물질로 표준곡선을 구하여 시료의 10 ㎎/mL 농도에서의 pachymic acid 량을 측정하였다. HPLC를 활용한 복령피 추출물의 활성성분인 pachymic acid의 분석결과는 Table 1나타내었다.
단백질 정량법 중 하나인 Lowry assay를 하였으며 Thermo의 Pierce BCA Protein Assay kit 제품을 사용하였다. Reagent A과 Reagent S의 용액 을 50 : 1의 비율로 반응시켜준 후, Reagent B 를 처리하여 37℃, 5 % CO₂세포 배양기에서 10분간 반응시켜주었다. ELISA reader로 562 ㎚ 에서 흡광도를 측정하여 단백질 양을 확인하였다.
일정 농도로 시료와 1μL/mL LPS를 세포에 처리 후, 24h 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 Cell incubator에서 배양하였다. Sodium nitrite를 Griess reagent와 동량으로 혼합 후 상온에서 10분간 반응 후 ELISA reader로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다[19]. NO의 양은 sodium nitrite로부터 얻은 표준곡선을 이용하여 결정하였으며, 최종 NO의 양은 일정 단백질당 NO 양으로 환산하여 음성대조군과 비교하였으며 NO 생성 억제능은 LPS 자극 NO량 - 추출물 NO 양으로 계산하였다.
시료는 에탄올 용매에 녹인 후 일정 농도로 희석하여 사용하였다. 각 시료를 0.2mM DPPH Solution과 1 : 1비율로 혼합하여 암실에 서 30분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용해 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타냈다[17].
ELISA reader로 562 ㎚ 에서 흡광도를 측정하여 단백질 양을 확인하였다. 단백질의 양은 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin)으로부터 얻은 표준곡선을 이용하여 결정하였다.
독성평가 결과를 바탕으로 B16 cell에 대한 복령피 에탄올 추출물, 복령피 초임계 추출물의 미백 실험 농도는 20 μg/mL 이하에서 실험하였다.
또한 복령피 초임계 추출물을 얻기 위하여 추출조의 조건은 온도 40℃, 압력 350bar, 분리조 조건 온도 25℃, 압력 30bar CO₂분당 60mL, EtOH 분당 5mL의 조건에서 2시간 30분 동안 추출을 진행하였다. 회수한 추출물은 필터를 통해 여과한 후 Rotary vacuum evaporator로 50℃에서 감압농축 후 –21℃에서 보관하여 사용하였다.
선정된 복령피 초임계 추출물은 강한 난용성 추출물이기 때문에 단순 수용성용매에는 용해되지 않아 가용화시키기 위해서 1,3 BG와 리포좀을 활용하였다. 또한 복령피의 유효성분을 더욱 효과적으로 피부에 전달하기 위하여 약물전달 펩티드 R6를 혼합하여 실험을 진행하였다. 결과적으로 단순 1,3 BG에 용해시킨 Sample에 비 해 리포좀과 혼합한 Sample 그리고 R6를 혼합한 Sample 역순으로 효과가 좋았다.
실험에 사용된 Sample은 총 3 가지로 A : 복령피 초임계 추출물 + 1,3 BG, B: 복령피 초임계 추출물 + 1,3 BG + 리포좀 C:복령피 초임계 추출물 + 1,3 BG + 리포좀 + R6을 제조하여 실험을 진행하였다. 먼저 Receptor Chamber에 인공피부의 각질층이 위로 되도록 Donor와 Receptor Phase 사이에 고정시켜 실험을 진행하였다. 실험이 진행되는 동안 항온수조의 온도가 사람의 체온가 비슷한 37℃가 되도록 유지시켰다.
본 연구에서는 에탄올 추출과 초임계 추출에 의해 복령피 추출물을 얻었다. 먼저, 복령피 분쇄물에 대하여 100% 에탄올 추출을 실시하였다. 100% 에탄올과 추출 대상물을 20배율로 혼합하여 상온에서 3일간 침지시켜 추출한 것을 필터 (ADVANTEC filter paper 100 circles)를 통해 여과한 후 Rotary vacuum evaporator로 50 ℃ 에서 감압농축하였다.
양성대조군으로는 kojic acid를 사용하였다. 배양 후 곧바로 extra cell Melanin을 측정하기 위해 상층액을 96 well에 넣은 후 ELISA Reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 Melanin의 양을 측정하였다. Intra cell Melanin을 측정하기 위해 Media를 제거한 후 1 N NaOH를 처리하고 60℃에서 30분간 방치 후 세포를 용해시켜 ELISA Reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 Melanin의 양을 측정하였다[8].
복령피 에탄올 추출물과 복령피 초임계 추출물의 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16 cell을 이용하여 실험을 진행하였다. α -MSH를 100 nM 처리한 B16 cell에 복령피 에탄올 추출물과 복령피 초임계 추출물을 5, 10, 20 μg/mL의 농도별로 처리 후 72시간 동안 37 ℃, 5 % CO₂세포 배양기에 배양된 세포를 채취하여 멜라닌 함량을 Extra와 Intra을 측정한 결과, 두 가지 추출방법 모두 농도 의존적으로 멜라닌 생성량이 감소됨을 확인하였다.
복령피 초임계 추출물을 포함한 리포좀과 R6의 경피 투과 증진을 확인하기 위하여 Franz diffusion cell을 이용하여 경피 투과 실험을 진행하였다. 복령피 초임계 추출물은 난용성이라 수용액에 용해되지 않기 때문에 1,3 BG(Butylene Glycol)에 녹인후 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 Sample은 총 3 가지로 A : 복령피 초임계 추출물 + 1,3 BG, B: 복령피 초임계 추출물 + 1,3 BG + 리포좀 C:복령피 초임계 추출물 + 1,3 BG + 리포좀 + R6을 제조하여 실험을 진행하였다.
복령피 초임계 추출물을 포함한 리포좀과 R6의 경피 투과 증진을 확인하기 위하여 Franz diffusion cell을 이용하여 경피 투과 실험을 진행하였다. 복령피 초임계 추출물은 난용성이라 수용액에 용해되지 않기 때문에 1,3 BG(Butylene Glycol)에 녹인후 실험을 진행하였다.
복령피의 항염 지표 성분인 pachymic acid의 함량을 초임계 추출법과 에탄올 추출법을 비교 분석하기위해 HPLC 분석조건을 응용하였다. 시료와 methanol을 섞어 10 ㎎/mL의 농도로 sample을 제조하고 pachymic acid를 농도별로 methanol에 용해하여 제조하였다.
본 연구에서는 에탄올 추출과 초임계 추출에 의해 복령피 추출물을 얻었다. 먼저, 복령피 분쇄물에 대하여 100% 에탄올 추출을 실시하였다.
Franz cell을 이용한 경피 투과 실험은 효능 평가 실험을 바탕으로 초임계 추출물을 선 정하였다. 선정된 복령피 초임계 추출물은 강한 난용성 추출물이기 때문에 단순 수용성용매에는 용해되지 않아 가용화시키기 위해서 1,3 BG와 리포좀을 활용하였다. 또한 복령피의 유효성분을 더욱 효과적으로 피부에 전달하기 위하여 약물전달 펩티드 R6를 혼합하여 실험을 진행하였다.
복령피 초임계 추출물은 난용성이라 수용액에 용해되지 않기 때문에 1,3 BG(Butylene Glycol)에 녹인후 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 Sample은 총 3 가지로 A : 복령피 초임계 추출물 + 1,3 BG, B: 복령피 초임계 추출물 + 1,3 BG + 리포좀 C:복령피 초임계 추출물 + 1,3 BG + 리포좀 + R6을 제조하여 실험을 진행하였다. 먼저 Receptor Chamber에 인공피부의 각질층이 위로 되도록 Donor와 Receptor Phase 사이에 고정시켜 실험을 진행하였다.
96-well에 sample 20 μL와 ABTS solution 180 μL을 혼합 후 7분 동안 암실에서 반응시켜 ELISA reader를 이용하여 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 ascorbic acid와 비교하여 계산하였다.
02 %)를 추가로 첨가되었다. 이러한 공정으로 제조된 리포좀과 1,3 BG에 용해시킨 복령피 초임계 추출물을 1 : 9 비율로 혼합하여 복령피 추출물의 농도를 0.5 %로 제조 후 실험에 사용하였다.
여기에 DC 200 25 %을 70 ℃ 가열 후 넣고 호모믹서를 이용하여 3,000 rpm의 속도로 5 min 간 유화시켜 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀을 1200 bar에서 3 회에 걸쳐 Micro-fluidizer를 냉각 장치를 사용하지 않고 반복 통과하여 리포좀을 제조하였다. 제 조에는 EDTA-2Na (0.
2 mL씩 도포 후 시간에 따라 Receptor Phase를 채취 후 동량을 보충해주었다. 채취한 시료속의 Pachymic acid를 지표성분으로 HPLC 을 이용하여 포함된 양을 분석하였다[12,13].

대상 데이터

, Korea), 항온기 (Changshin, Korea), 초임계 추출장치(Ari instrument, Korea), 경피 약물 전달 실험 장치는 Franz diffusion cells and systems (Permegear, USA)이며 인공피부는 Neoderm-E (Tegoscience, Korea)이며, R6 (hexa-Darginine)는 Dermafirm Co.(Korea)에서 구입하였다.
6. Franz cell을 이용한 경피 투과 실험은 효능 평가 실험을 바탕으로 초임계 추출물을 선 정하였다. 선정된 복령피 초임계 추출물은 강한 난용성 추출물이기 때문에 단순 수용성용매에는 용해되지 않아 가용화시키기 위해서 1,3 BG와 리포좀을 활용하였다.
Column의 Shiseido사의 C18(5 ㎛ Particle size , 25㎝×3.2㎜)를 사용 하였다.
Franz diffusion cell실험은 선행된 실험에 결과 중 항염효과와 미백효능에 뛰어난 복령피 초임계 추출물을 선정하였다. 총 3가지 Sample로 실험을 진행하였으며 세 가지 샘플 모두 경피 투과를 하는 것으로 나타났으며 시간대별 경피 투과량이 증가하는 것을 나타냈다.
난용성 복령피 초임계 추출물을 함유한 리포좀의 사용된 레시틴은 Soya SPL 75H제품을 사용하였으며 glycerin 60 %, 레시틴 5 %, 1,2-hexandiol 2 % 을 가열하여 녹인 후 80 ℃ 에서 용해한 증류수 8 %를 포함하는 수상(water phase)을 넣고 혼합하였다. 여기에 DC 200 25 %을 70 ℃ 가열 후 넣고 호모믹서를 이용하여 3,000 rpm의 속도로 5 min 간 유화시켜 리포좀을 제조하였다.
본 연구에 사용된 복령피는 충청남도 부여군에서 재배된 것을 건화약품(주)에서 구매하여 실험을 진행하였다. 건조된 복령피를 분쇄하여 –23℃ 에 보관하여 사용하였다.
Plate에 잘 붙은 세포에 media를 제거해 주고 α -MSH (Melanocyte-stimulating hormone)과 FBS가 처리된 DMEM(Dulbecco’s modilied Eagle’s medium)을 혼합하여 Well에 Sample을 농도별로 처리하여 72시간 동안 37 ℃, 5 % CO₂세포 배양기에 배양하였다. 양성대조군으로는 kojic acid를 사용하였다. 배양 후 곧바로 extra cell Melanin을 측정하기 위해 상층액을 96 well에 넣은 후 ELISA Reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 Melanin의 양을 측정하였다.
DPPH 라디컬 소거능을 확인하기 위해 DPPH 을 이용하여 각 시료의 프리라디칼 소거능 실험은 Blois의 방법을 참고하여 실행하였다. 에탄올에 DPPH를 희석하여 0.2mM DPPH 용액을 제조하였다. 시료는 에탄올 용매에 녹인 후 일정 농도로 희석하여 사용하였다.
항산화 효과 측정에 사용한 시약은 L(+) ascorbic acid 99.5%는 삼전화학(Korea)에서 구 매하였고, 2,2-Diphenyl-1-pocrylhydrazyl(DPPH), SOD Assay Kit, ABTS, potassium persulfate는 Sigma aldrich(USA)에서 구입하였으며, 미백 실험에서 사용된 시약은 potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic는 대정 (Korea)에서 구매하였고, mushroom tyrosinase, kojic acid는 Sigma aldrich(USA)에서 구입하였 으며, Dulbecco’s modilied Eagle’s medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), trypsin and penicillin-streptomycin (Capricorn Scientific, Germany)이며, 항염 실험에서 사용된 시약은 phosphoric acid, sulfanilamide, naphthylethylenediamine, sodium nitrite, LPS, indomethacin는 Sigma aldrich(USA)에서 구매하였다.

데이터처리

모든 실험의 결과는 3회 반복하여 시행한 것을 평균 ± 표준편차로 표기하였으며, SPSS 18.0 프로그램을 이용하여 독립표본 t-test와 one-way ANOVA 분석으로 p값이 0.05미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다

이론/모형

ABTS 라디칼 소거능을 이용한 항산화 실험은 Van den berg의 방법을 활용하여 측정하였다 [18].
DPPH 라디컬 소거능을 확인하기 위해 DPPH 을 이용하여 각 시료의 프리라디칼 소거능 실험은 Blois의 방법을 참고하여 실행하였다. 에탄올에 DPPH를 희석하여 0.
단백질 정량은 세포 내에 포함된 단백질의 양을 측정하는 것으로, 배지를 회수하고 PBS (phosphate-buffered saline)로 세척 후 1 N NaOH를 처리하여 용해시켜주었다. 단백질 정량법 중 하나인 Lowry assay를 하였으며 Thermo의 Pierce BCA Protein Assay kit 제품을 사용하였다. Reagent A과 Reagent S의 용액 을 50 : 1의 비율로 반응시켜준 후, Reagent B 를 처리하여 37℃, 5 % CO₂세포 배양기에서 10분간 반응시켜주었다.
복령피 에탄올 추출물, 복령피 초임계 추출물의 세포독성과 더불어 미백실험에서의 사용될 농도를 측정하기 위하여 CCK-8 assay를 시행하였다. B16 cell에 대한 복령피 에탄올 추출물, 복령피 초임계 추출물의 세포독성을 평가한 결과 20 μg/mL이하에서의 세포 생존율이 85%이상을 나타냈다.

성능/효과

α -MSH를 100 nM 처리한 B16 cell에 복령피 에탄올 추출물과 복령피 초임계 추출물을 5, 10, 20 μg/mL의 농도별로 처리 후 72시간 동안 37 ℃, 5 % CO₂세포 배양기에 배양된 세포를 채취하여 멜라닌 함량을 Extra와 Intra을 측정한 결과, 두 가지 추출방법 모두 농도 의존적으로 멜라닌 생성량이 감소됨을 확인하였다.
1. HPLC를 이용한 복령피 추출물의 지표성분으로 pachymic acid를 분석한 결과 초임계 추출법이 에탄올 추출법보다 2배 가량 높은 pachymic aicd을 추출하였다. 그 결과 pachymic acid를 효율적으로 추출하기 위해서는 초임계 추출법이 적합한 추출법이며, 초임계 이산화탄소가 비극성 성분을 추출하는데 능력이 뛰어나기 때문에 단순 에탄올 추출보다 더 많은 양이 추출된다고 판단된다.
2. DPPH 라디컬 소거능 복령피 에탄올 추출물이 복령피 초임계 추출물보다 좋은 결과가 나타났다. 또한 ABTS 라디컬 소거능 실험에서도 동일한 결과를 나타냈다.
3. NO(Nitric oxide) 생성량 측정 실험에서는 복령피 에탄올 추출물과 복령피 초임계 추 출물 모두 같은 농도에서 NO 생성량을 저하시켰다. 하지만 같은 농도에서 비교하였을 때 복령피 초임계 추출물이 복령피 에탄올 추출물보다 더 낮은 NO 생성량을 보 였다.
4. B16 cell에 대한 세포생존율은 복령피 에탄올 추출물과 초임계 추출물 모두 낮은 농도에서 독성을 보였다. 하지만 RAW 264.
5. α-MSH 멜라닌 생성 억제 실험에서는 복령피 에탄올 추출물과 초임계 추출물 모두 같은 농도에서 미백효과를 보였다.
40 μg/㎠ 투과하였다. A와 B 그리고 C의 경피 투과 실험 결과 리포좀과 R6 (0.1 %) 를 섞은 C가 가장 높은 경피 투과율을 보였으며 단순 복령피 초임계 추출물을 1,3 BG에 용해시킨 것보다 리포좀과 혼합한 것이 더 높은 투과율을 보였다. 실험 결과 이는 리포좀 제형이 경피 투과에 도움을 주며 또한 R6 경피 투과 펩티드가 복령피 초임계 추출물의 경피 투과를 증진시켜 준다.
B16 cell에 대한 복령피 에탄올 추출물, 복령피 초임계 추출물의 세포독성을 평가한 결과 20 μg/mL이하에서의 세포 생존율이 85%이상을 나타냈다.
77 μg/mL의 pachymic acid 을 함유하고 있었으며, 이는 통계적으로 유의한 차이를 보였다(Table 1). HPLC 분석 결과로 보여질 때 복령피에 포함된 pachymic acid를 효율적으로 추출하기 위해서는 에탄올 추출법 보다 CO₂초임계를 활용한 추출방법이 더 효율적인 추출법이라고 할 수 있다. 그 이유는 pachymic acid는 강한 비극성 물질로 에탄올 추출법보다 CO₂초임계를 활용한 추출방법이 더 약물을 용해시켜 추출하는 것이 더 효율적인 추출방법이라고 사료된다.
또한 복령피의 유효성분을 더욱 효과적으로 피부에 전달하기 위하여 약물전달 펩티드 R6를 혼합하여 실험을 진행하였다. 결과적으로 단순 1,3 BG에 용해시킨 Sample에 비 해 리포좀과 혼합한 Sample 그리고 R6를 혼합한 Sample 역순으로 효과가 좋았다. 실 험 결과를 바탕으로 리포좀 제형은 복령피 추출물을 경피에 전달하는 효과가 있으며 약물전달 펩티드 R6 또한 경피 약물 전달 효과가 있는 것으로 나타났다.
HPLC를 이용한 복령피 추출물의 지표성분으로 pachymic acid를 분석한 결과 초임계 추출법이 에탄올 추출법보다 2배 가량 높은 pachymic aicd을 추출하였다. 그 결과 pachymic acid를 효율적으로 추출하기 위해서는 초임계 추출법이 적합한 추출법이며, 초임계 이산화탄소가 비극성 성분을 추출하는데 능력이 뛰어나기 때문에 단순 에탄올 추출보다 더 많은 양이 추출된다고 판단된다.
대조군인 indomethacin와 비교해봤을 때 복령피 초임계 추출물 800 μg/mL의 농도일 때 비슷한 NO 생성량을 보였다. 그 결과 복령피 초임계 추출물이 복령피 에탄올 추출물보다 더 낮음 NO 생성량을 나타냄으로 복령피 초임계 추출물이 복령피 에탄올 추출물보다 항염 화장품 소재로서 의 가치가 클 것으로 보인다. 하지만 복령피 에탄올 추출물 800 μg/mL NO 생성량을 저해시키기 때문에 복령피 에탄올 추출물 또한 항염 화장품 소재로서 활용 가능할 것으로 보인다.
그 결과는 5000μg/mL, 2500 μg/mL, 1250μg/mL 농도에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
대조군인 ascorbic acid와 비교해보면 ascorbic acid는 20 μg/mL 농도에서 75.46 %의 ABTS 라디칼l 소거능을 나타내었고, 복령피 에탄올 추출물은 450 μg/mL 농도에서 90%의 ABTS 라디칼 소거능을 나타냈다.
대조군인 ascorbic acid와 비교해보면 ascorbic acid는 25 μg/mL 농도에서 95.07%의 DPPH radical 소거능을 나타내었고, 복령피 에탄올 추출물은 1250 μg/mL 농도에서 85.36%의 소거능을 나타냈다.
복령피 에탄올 추출물 450 μg/mL에서 90%, 225 μg/mL에서 75.8 %, 112.5 μg/mL에서 23.81 %의 소거능을 보였으며, 복령피 초임계 추출물 450 μg/mL에서 82.59 %, 225μg/mL에서 37.63 %, 112.5 μ g/mL에서 5.06 %의 소거능을 보였으며 농도의 존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였다 (Table 3).
복령피 에탄올 추출물은 1250 μ g/mL에서 85.36%, 625 μg/mL에서 58.32%, 312.5 μg/mL에서 27.08%의 소거능을 보였으며, 복령피 초임계 추출물은 5000 μg/mL에서 68.8%, 2500μg/mL에서 45.23%, 1250 μg/mL 에서 17.12%의 소거능을 보였으며 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였다(Table 2).
복령피 에탄올 추출물은 9,529.66 ± 3.17 μg/mL, 복령피 초임계 추출물은 20,322.63 ± 5.77 μg/mL의 pachymic acid 을 함유하고 있었으며, 이는 통계적으로 유의한 차이를 보였다(Table 1).
36%의 소거능을 나타냈다. 복령피 에탄올 추출물은 ascorbic acid보다는 DPPH 라디칼 소거 능력이 우수하지 않지만, Ascorbic acid가 강력한 항산화 물질임으로 복령피 에탄올 추출물 또한 항산화 능력을 갖는 것으로 판단된다. 이를 통해 복령피에 항산화 물질이 함유되어 있는 것을 확인하였고, 항산화 화장품 소재로서의 개발 가능성을 확인하였다
복령피 에탄올 추출물이 복령피 초임계 추출물보다 더 낮은 농도에서 더 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보였다. ABTS 라디칼 소거능 실험 결과 통계적으로 유의하게 나타냈다.
복령피 에탄올 추출물이 복령피 초임계 추출물보다 더 낮은 농도에서 더 높은 DPPH radical 소거능을 보였다. 그 결과는 5000μg/mL, 2500 μg/mL, 1250μg/mL 농도에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
B16 cell에 대한 복령피 에탄올 추출물, 복령피 초임계 추출물의 세포독성을 평가한 결과 20 μg/mL이하에서의 세포 생존율이 85%이상을 나타냈다. 복령피 에탄올 추출물이 복령피 초임계 추출물보다 동일 농도에서 더 높은 세포 생존율을 보였다. 하지만 두 가지 추출물 모두에서 50 μg/mL 이상의 농도에서는 급격하게 생존율이 감소하는 것으로 나타났다.
36 μg/mL의 NO 생성량을 보였다. 복령피 초임계 추출물과 복령피 에탄올 추출물 둘다 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소하는 것으로 나타났다(Table 4).
복령피 초임계 추출물과 복령피 에탄올 추출물을 동일 농도에서 비교하였을 때 복령피 초임계 추출물이 더 낮은 NO 생성량을 나타냈다. 대조군인 indomethacin와 비교해봤을 때 복령피 초임계 추출물 800 μg/mL의 농도일 때 비슷한 NO 생성량을 보였다.
하지만 복령피 에탄올 추출물 또한 항산화 능력을 갖는 것으로 사료된다. 본 실험을 통하여 복령피에 함유된 항산화 성분을 추출하기 위해서는 초임계 추출방법보다는 에탄올 추출방법이 더 효율적인 추출방법이라고 판단된다.
결과적으로 단순 1,3 BG에 용해시킨 Sample에 비 해 리포좀과 혼합한 Sample 그리고 R6를 혼합한 Sample 역순으로 효과가 좋았다. 실 험 결과를 바탕으로 리포좀 제형은 복령피 추출물을 경피에 전달하는 효과가 있으며 약물전달 펩티드 R6 또한 경피 약물 전달 효과가 있는 것으로 나타났다. 난용성 복령 피 초임계 추출물을 피부에 침투시기기 위해서는 리포좀 제형과 약물전달 펩티드가 효과적인 방법이라고 판단된다.
실험 결과 복령피 에탄올 추출물의 경우 복령피 초임계 추출물보다 5 μg/mL농도에서 더 낮은 멜라닌 생성량을 보였다.
하지만 10, 20 μg/mL농도에서는 복령피 초임계 추출물이 복령피 에탄올 추출물보다 더 낮은 멜라닌 생성량을 나타냈다. 실험 결과 에탄올 추출법보다는 초임계 추출방법이 복령피 미백화장품 소재개발에 조금 더 적합한 것으로 사료된다. 하지만 두 가지 추출법 모두 멜라닌 생성량을 감소시키는 효과가 대조군에 비해 뛰어난 것으로 나타내고 있으며 두 가지 추출방법에 멜라닌 생성억제 효과가 큰 차이를 보이진 않음으로 두 가지 추출법 모두 미백화장품 소재 개발에 적합하다고 할 수 있다
1 %) 를 섞은 C가 가장 높은 경피 투과율을 보였으며 단순 복령피 초임계 추출물을 1,3 BG에 용해시킨 것보다 리포좀과 혼합한 것이 더 높은 투과율을 보였다. 실험 결과 이는 리포좀 제형이 경피 투과에 도움을 주며 또한 R6 경피 투과 펩티드가 복령피 초임계 추출물의 경피 투과를 증진시켜 준다.
복령피 에탄올 추출물은 ascorbic acid보다는 DPPH 라디칼 소거 능력이 우수하지 않지만, Ascorbic acid가 강력한 항산화 물질임으로 복령피 에탄올 추출물 또한 항산화 능력을 갖는 것으로 판단된다. 이를 통해 복령피에 항산화 물질이 함유되어 있는 것을 확인하였고, 항산화 화장품 소재로서의 개발 가능성을 확인하였다
Franz diffusion cell실험은 선행된 실험에 결과 중 항염효과와 미백효능에 뛰어난 복령피 초임계 추출물을 선정하였다. 총 3가지 Sample로 실험을 진행하였으며 세 가지 샘플 모두 경피 투과를 하는 것으로 나타났으며 시간대별 경피 투과량이 증가하는 것을 나타냈다. A의 경우 4 h에서 16.
NO(Nitric oxide) 생성량 측정 실험에서는 복령피 에탄올 추출물과 복령피 초임계 추 출물 모두 같은 농도에서 NO 생성량을 저하시켰다. 하지만 같은 농도에서 비교하였을 때 복령피 초임계 추출물이 복령피 에탄올 추출물보다 더 낮은 NO 생성량을 보 였다. 따라서 복령피를 항염 화장품 소재로서 개발하기 위해서는 에탄올 추출법보다 초임계 추출법이 더 적합한 추출법이라고 판단되는데 그 이유는 초임계추출물이 에탄 올추출물보다 추출되는 pachymic acid의 양이 더 많이 추출되었기 때문이다.
실험 결과 에탄올 추출법보다는 초임계 추출방법이 복령피 미백화장품 소재개발에 조금 더 적합한 것으로 사료된다. 하지만 두 가지 추출법 모두 멜라닌 생성량을 감소시키는 효과가 대조군에 비해 뛰어난 것으로 나타내고 있으며 두 가지 추출방법에 멜라닌 생성억제 효과가 큰 차이를 보이진 않음으로 두 가지 추출법 모두 미백화장품 소재 개발에 적합하다고 할 수 있다
하지만 초임계 추출물이 10, 20 μg/mL농도에서 Extra cell과 Intra cell 모두 더 낮은 농도의 멜라닌 함량을 보였다.

후속연구

하지만 초임계 추출물이 10, 20 μg/mL농도에서 Extra cell과 Intra cell 모두 더 낮은 농도의 멜라닌 함량을 보였다. 결과적으로 복령 피를 미백화장품 소재로서 활용을 한다면 초임계 추출법을 이용하는 것이 더 효율적 이라 판단된다.
따라서 항알러지, 항암 등 다양한 효과를 가지고 있는 복령피를 대상으로 항염, 미백, 항산화 화장품 소재로서의 가능성을 제시하며 추출방법에 따른 복령피에 포함된 유효성분의 효능을 비교하여 추출조건을 제시하였다. 그리고 본 연구결과는 복령피가 다양한 효능의 화장품 소재로서 적용하는데 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.
하지만 복령피 에탄올 추출물 800 μg/mL NO 생성량을 저해시키기 때문에 복령피 에탄올 추출물 또한 항염 화장품 소재로서 활용 가능할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	복령피란 무엇인가?	또한 복령의 항종 양연구가 보고된 바 있으며 항구토, 항암, 항염증 등의 연구가 진행되어왔다[5-7]. 복령피(Poria cocos bark)는 구멍장이버섯과 복령(poria cocos) 균핵의 바깥 껍질로, 수분을 배출시키는 작용하여 부종을 가라앉히는 효능이 있는 약재로 알려져 있다. 복령피는 사전 연구에 따르면 미백효능이 확인되었으며 항알러지 효과 또한 탁월한 것으로 알려져 있다[8].
	산업화의 부정적인 영향은 무엇이 있는가?	하지만 산업화는 인간에게 이로운 점만 준 것은 아니다. 산업화의 부작용으로 환경호르몬과 미세먼지 등의 다양한 외부적 요인으로 인간의 건강은 악화 되어왔다. 신체의 가장 최외각에서 인간을 보호하는 피부는 외부 유해요소로 부터 가장 큰 영향을 받는 부분이다.
	유효성분의 난용성 문제를 해결하기 위한 방법 중 제형적 접근법의 대표적인 예시인 리포좀 제형법의 장점은 무엇인가?	제형적 접근으로는 리포좀 제형법[10]이 있다. 리포좀이란 유효성분을 효과적으로 피부에 흡수 시킬 수 있는 전달체로 세포막 또는 각질층의 지 질과 유사한 구조와 성분을 가지고 있어 세포막과 융합하거나 리포좀내의 활성 성분을 전달하기에 용의 하다. 최근 리포좀을 활용한 활성 성분 의 약물전달 연구가 많이 진행되고 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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