[논문]테스토스테론 물질 검출을 위한 in vitro TCD 시스템 구축

이동근; 조정권; 이상현

doi:10.5352/jls.2019.29.10.1159

테스토스테론 물질 검출을 위한 in vitro TCD 시스템 구축
Establishment of an In Vitro TCD (Testosterone Compound Detection) System 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.10, 2019년, pp.1159 - 1163

이동근 (신라대학교 제약공학과) , 조정권 (신라대학교 일반대학원 생명과학과) , 이상현 (신라대학교 제약공학과)

초록
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남성호르몬 감소와 관련된 남성갱년기에 대한 관심이 고조되고 있지만, 남성호르몬의 정량을 위해 항체를 이용하는 고가의 kit가 이용되고 있다. 본 연구에서는 in vitro 전사 활성 시험법을 이용하여 남성 스테로이드호르몬의 활성 혹은 농도를 검증하는 시스템을 구축하였다. 테스토스테론-AR (androgen receptor) 복합체와 반응하는 ARE-AdE1bTATA 염기서열이 삽입되고 리포터로 luciferase를 발현하는 테스토스테론 유사활성 검증 리포터 플라스미드인 pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA를 제조하고, 인체 전립선암 세포인 LNcap-LN3 세포에 stable transfection을 실시하였다. 구축된 LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA TCD (testosterone compound detection) 시스템은 표준물질인 테스토스테론의 $10^{-13}{\sim}10^{-8}M$ 범위에서 농도 증가에 비례하는 정량성을 보였다. 이 연구에서 확립된 in vitro TCD 시스템을 이용하면 천연물 유래 테스토스테론 유사물질 및 테스토스테론 저하물질의 대량 탐색 등이 가능할 것이므로, 건강기능성 식품이나 의약품 신소재의 개발에 기여할 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Although there is a growing interest in male menopause, a phenomenon associated with male hormone depletion, current kits using antibodies to quantify male hormones are expensive. In this study, we constructed an in vitro system for verifying the activity or concentration of male steroid hormones using a transcriptional activity test. A reporter plasmid, pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA, which reacts to testosterone, was constructed. In this plasmid, the ARE-AdE1bTATA sequences can be bounded by the testosterone - androgen receptor complex to express luciferase as a reporter. Then, a stable transfection was performed on the human prostate cancer cell line, LNcap-LN3. The constructed LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA testosterone compound detection (TCD) system showed quantitatively proportional luciferase activities to concentrations of $10^{-13}$ to $10^{-8}M$ of standard testosterone. The established in vitro TCD system will contribute to the development of materials for health/functional foods and drugs as it will be possible to search en masse for testosterone-like or testosterone-inhibiting substances derived from natural materials.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Construction of a testosterone responsive reporter plasmid. An ARE-AdE1BTATA fragment was inserted in the NheΙ-Hind Ⅲ sites of pGL2-Neo.
그림 Fig. 2. Responsive diagram of LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA to testosterone.
그림 Fig. 3. DNA-PAGE of plasmid. pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA plasmid was separated by 8% DNA-PAGE and stained with EtBr after treated with NheΙ and HindⅢ restriction enzyme.
그림 Fig. 4. Testosterone-responsive quantitative curve of constructed TCD system.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구진이 수용체전사활성 시험법으로 천연물의 에스트로겐 유사활성을 측정할 때, 리포터로 CAT (chloramphenicol acetyltransferase)를 사용하고 CAT을 정량하기 위해 항체를 이용하는 CAT-ELISA Kit를 사용하다가[6, 18] 항체를 이용하지 않게 리포터로 luciferase를 사용하여 실험의 난이도와 비용의 한계를 극복할 수 있었다[11]. 이에 본 연구에서 테스토스테론 활성 혹은 테스토스테론 유사활성을 검증하기 위해 luciferase를 리포터로 이용하는 시스템을 개발하였다.
수용체전사활성 시험법은 많은 시료를 한꺼번에 처리할 수 있는 장점이 있음에도, 국내에서는 수용체 전사활성 시험법으로 에스트로겐 유사활성 검출에 대한 보고는 있었지만 테스토스테론 유사활성 검출에 관한 보고는 거의 없는 실정이다. 이에 본 연구에서는 수용체 전사활성 시험법으로 남성호르몬 활성을 측정할 수 있는 TCD (testosterone compound detection) 시스템을 구축하고 표준물질인 테스토스테론을 사용하여 시스템의 유용성을 파악하였다.

제안 방법

Austria)를 이용하여 벡터 DNA를 정제하였다. ARE 리포터 플라스미드 제작용 벡터는 정제된 벡터 DNA를 제한효소 NheI (Takara, Japan)과 HindⅢ (Takara, Japan)로 처리한 후에 BAP (bacterial alkaline phosphatase) 처리와 정제를 수행하였다. 셋째, ARE-AdE1BTATA DNA 단편을 pGL2-Neo 벡터와 ligation하여 얻은 재조합 플라스미드 pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA로 E.
coli DH5α 세포를 배양한 후, FavorPrep plasmid extraction mini kit (Favorgen Biotech Corp. Austria)로 pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA 플라스미드를 정제하였고, 제한효소 NheI과 HindⅢ로 처리한 후, 아가로스겔 전기영동을 수행하여 ARE-AdE1BTATA DNA 단편을 확인하였다.
본 연구진은 CAT (chloramphenicol acetyltransferase) 리포터를 이용한 in vitro 에스트로겐 검출시스템을 구축하고 오미자, 택사, 지황, 산약, 복령 등의 에스트로겐 유사활성을 검증하였다[6, 18]. 이 방법은 수용체 전사활성 시험법의 일종이지만, CAT을 항원으로 반응하는 항체를 필요로 하는 CAT ELISA Kit를 사용하여 시간과 비용이 비교적 많이 드는 한계가 있었다.
테스토스테론 유사활성 측정을 위한 세포배양에 FBS에 포함되어 있는 스테로이드를 Dextrancoated charcoal (Sigma, USA)로 미리 제거한 CSF를 사용하여 테스토스테론 활성 측정에 방해가 없도록 하였다. 여기에 표준물질로서 대표적인 테스토스테론 물질인 5-α-DHT (dihydroxy-testosterone, Sigma, USA)를 95% 에탄올에 녹여 최종 농도가 10^-13~10^-8 M이 되도록 첨가하였으며, 음성대조군은 에탄올 만을 동일한 양으로 첨가하였다. 그 후 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 48시간 배양한 다음 세포를 회수하였고, 1X PBS 4 ml로 세포를 세척한 후 원심분리(3,000 ×g, 5분)하여 상등액을 제거하는 과정을 2회 실시하였다.
이 방법은 수용체 전사활성 시험법의 일종이지만, CAT을 항원으로 반응하는 항체를 필요로 하는 CAT ELISA Kit를 사용하여 시간과 비용이 비교적 많이 드는 한계가 있었다. 이에 항체를 사용하지 않으면서 수용체 전사활성 시험법을 수행할 수 있는 시스템을 마련하고자, 에스트로겐 수용체를 다량 생산하는 인체유방암 세포주를 이용하여 구축하였고 이를 이용하여 감초, 황기 및 산약의 에스트로겐 유사 활성을 검증하였다[11].
테스토스테론 수용체를 과다 생산하는 남성전립선암 세포주 LNcap-LN3의 염색체에 pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA 플라스미드를 stable transfection 방법으로 도입시켜 TCD system을 구축하였다(Fig. 2).
테스토스테론 유사물질 검정용 LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA 세포를 10% Charcoal stripped FBS (CSF) 및 1% penicillin-streptomycin (100 units/ml, Corning, USA)이 포함된 DMEM에서 세포밀도가 약 90%가 될 때까지 배양한 후, 1X PBS (Corning, USA) 4 ml로 세척하고 10% CSF 및 1% penicillin-streptomycin (100 units/ml)을 포함하는 DMEM 배지로 교환하였다. 테스토스테론 유사활성 측정을 위한 세포배양에 FBS에 포함되어 있는 스테로이드를 Dextrancoated charcoal (Sigma, USA)로 미리 제거한 CSF를 사용하여 테스토스테론 활성 측정에 방해가 없도록 하였다. 여기에 표준물질로서 대표적인 테스토스테론 물질인 5-α-DHT (dihydroxy-testosterone, Sigma, USA)를 95% 에탄올에 녹여 최종 농도가 10^-13~10^-8 M이 되도록 첨가하였으며, 음성대조군은 에탄올 만을 동일한 양으로 첨가하였다.
Luciferase 유전자를 포함한 리포터 벡터는 이전 연구에서 제조한 pGL2-Neo 플라스미드를 이용하였다[18]. 테스토스테론 유사활성을 검증하는 염기서열(ARE-AdE1BTATA)의 클로닝을 위해 첫째, ARE-AdE1BTATA (GCT AGC AGA ACA GTT TGT AAC GAC GTT ACA AAC TGT TCT AGC TCG TTA CAA ACT GTT CTA AGC TCA GAT CTG GGT ATA TAA TAA GCT T) (밑줄부분에 각각 NheI과 HindⅢ의 인식서열 첨가)에 해당하는 sense와 antisense oligo-DNA를 ㈜바이오니아(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다. 이들을 annealing하여 이중가닥 DNA로 만든 후, T4 polynucleotide kinase (Takara, Japan)를 이용하여 5’ 말단에 인산을 참가하였다.

데이터처리

모든 결과는 Macintosh용 통계프로그램 Aabel 2.0 (Gigawiz Ltd Co., USA)으로 one-way ANOVA를 수행하였고 Fisher’s PLSD의 다중범위 유의성 검증을 실시하였다. 유의성은 p< 0.

성능/효과

08 mg/ml 농도의 G418을 포함하는 DMEM으로 교환하며 배양하였다. Stable transfection의 결과로 확립된 G418 저항성 및 테스토스테론 검증 시스템을 가지는 LNcapLN3 세포를 LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA 세포로 명명하였다.
본 연구에서 개발된 LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATATCD (testosterone compound detection) 시스템은 테스토스테론의 농도에 비례하는 활성을 보였다. 본 연구진이 구축한 in vitro 에스트로겐 유사활성 검증 시스템은 estrogen의 농도에 정량적인 luciferase 활성을 보였으며 감초, 황기 및 산약의 경우 에스트로겐 유사활성을 보였다[11].
본 연구진이 구축한 in vitro 에스트로겐 유사활성 검증 시스템은 estrogen의 농도에 정량적인 luciferase 활성을 보였으며 감초, 황기 및 산약의 경우 에스트로겐 유사활성을 보였다[11]. 본 연구에서 구축된 in vitro TCD 시스템으로 식약처에 등록된 남성갱년기 완화용 건강식품 재료에 속하는 민들레추출물을 검증하니, 추출물 농도에 비례하는 테스토스테론 유사활성을 보였다(자료 미제시). 따라서 본 연구에서 구축된 in vitro TCD 시스템으로 천연물 유래의 테스토스테론 유사물질 그리고 테스토스테론 저하물질의 대량 탐색 등이 항체이용법보다 낮은 비용으로 가능할 것이므로, 건강기능성 식품이나 의약품 신소재의 개발에 기여할 것으로 판단된다.
본 연구에서 개발된 LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATATCD (testosterone compound detection) 시스템은 테스토스테론의 농도에 비례하는 활성을 보였다. 본 연구진이 구축한 in vitro 에스트로겐 유사활성 검증 시스템은 estrogen의 농도에 정량적인 luciferase 활성을 보였으며 감초, 황기 및 산약의 경우 에스트로겐 유사활성을 보였다[11]. 본 연구에서 구축된 in vitro TCD 시스템으로 식약처에 등록된 남성갱년기 완화용 건강식품 재료에 속하는 민들레추출물을 검증하니, 추출물 농도에 비례하는 테스토스테론 유사활성을 보였다(자료 미제시).

후속연구

본 연구에서 구축된 in vitro TCD 시스템으로 식약처에 등록된 남성갱년기 완화용 건강식품 재료에 속하는 민들레추출물을 검증하니, 추출물 농도에 비례하는 테스토스테론 유사활성을 보였다(자료 미제시). 따라서 본 연구에서 구축된 in vitro TCD 시스템으로 천연물 유래의 테스토스테론 유사물질 그리고 테스토스테론 저하물질의 대량 탐색 등이 항체이용법보다 낮은 비용으로 가능할 것이므로, 건강기능성 식품이나 의약품 신소재의 개발에 기여할 것으로 판단된다.
본 연구진이 구축한 in vitro 에스트로겐 유사활성 검증 시스템과[11] 함께 사용하면 후보물질의 남성호르몬 혹은 여성호르몬 유사활성의 및 저해활성의 정도를 파악할 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	갱년기 장애의 완화 및 개선에 대한 요구가 높은 까닭은 무엇인가?	갱년기 장애가 치명적인 질병을 유도하지는 않지만, 갱년기로 자존감 저하나 우울감 등의 심리적 문제와 함께 지질대사 이상 등 육체적 문제도 일으킬 수 있다. 즉, 경제성장과 의료기술의 발달로 평균수명이 증가하는 정량적으로 긍정적인 측면과 함께 노인 인구의 증가에 따라 삶의 질 향상과 건강한 삶이라는 정성적 측면도 중요하며 갱년기 장애의 완화 및 개선에 대한 요구가 높다[10]. 갱년기 장애 개선 방법에 대한 연구가 빠르게 진행되고 있으며, 국내에서도 갱년기 장애와 호르몬의 관계에 관한 연구 등이 진행 중이다[7, 19].
	에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)란 무엇인가?	호르몬이 작용하기 위해 서는 호르몬이 작용하는 표적세포에 호르몬의 수용체가 있어야 한다. 여성호르몬 수용체인 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)와 남성호르몬 수용체인 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR)가 뇌를 포함한 몸 전체에 분포한다[2].
	호르몬 보충요법(testosterone replacement therapy, TRT)의 부작용은 무엇이 있는가?	남성의 갱년기 증상을 완화시키거나 치료를 위해 음주감소나 운동 같은 행동치료와 함께 화학적으로 합성한 호르몬 보충요법(testosterone replacement therapy, TRT)을 사용한다 [9, 16]. 하지만 이를 장기적으로 사용하면 전립선 암이나 하부 요로증상의 악화, 간독성, 적혈구증가증, 수면무호흡증 등의 부작용이 있어 주의가 필요하다[16]. 따라서 부작용이 없는 대체요법으로 식물성 테스토스테론에 대한 연구가 필요하며, 식품의약품안전처의 개별인정형 기능성원료 중에서 갱년기 남성 건강에 도움이 되는 것으로 마카젤라틴화 분말, MR-10 민들레등 복합추출물, 옻나무 추출분말 등이 2016년 현재 허가가 난상태이다[5].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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