[논문]코끼리조개(Panopea japonica)에서 분리되는 비브리오속 세균의 동정

서현준; 남우화; 김정호

doi:10.7847/jfp.2020.33.2.127

코끼리조개(Panopea japonica)에서 분리되는 비브리오속 세균의 동정
Identification of Genus Vibrio bacteria isolated from geoduck clam (Panopea japonica) 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.33 no.2, 2020년, pp.127 - 138

서현준 (강릉원주대학교 동해안생명과학연구원) , 남우화 (강릉원주대학교 해양자원육성학과) , 김정호 (강릉원주대학교 동해안생명과학연구원)

초록
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코끼리조개 성패 및 유생으로부터 잠재적 병원성 세균 분리 및 동정을 수행하였다. 분리된 균주는 분자생물학적 기법 및 생화학적 검사를 통해 동정하였으며, 명확한 동정 및 계통수 분석을 위해 16S rDNA와 하우스키핑 유전자 (pyrH, recA, rpoA)를 결합하여 분석하는 MLSA를 적용하였다. 총 141개의 균주가 분리되었으며, 건강한 성패에서는 10개, 수포 병변을 보이는 빈사 상태의 성패에서 52개, 유생에서 79개가 분리되었다. 이 중 빈사상태의 성패에서 46개, 유생에서 39개의 균주가 Vibrio 속 세균으로 동정되었으며, 나머지 균주들은 모두 일반해양세균으로 동정되었다. Vibrio 속 세균 중에서는 수포 병변을 보이는 성패에서 Vibrio splendidus가 가장 많이 분리되었으며 기존의 V. splendidus와 함께 동일한 클러스터를 형성하였다. 하지만, 인위감염실험을 실시하지 않았고 건강한 유생에서도 V. splendidus가 분리되어 성패에서 나타난 수포와 V. splendidus와의 관계는 확실하지 않으며, 차후 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

We attempted to isolate and identify potentially pathogenic bacteria from geoduck clam (Panopea japonica) larvae, juvenile and adult, focusing on Vibrios. The isolates were identified by molecular approach and biochemical characterization. In particular, we applied MLSA (multilocus sequence analysis) to the isolated Vibrios for clear identification and phylogenetic relationships, by combining 16s rDNA and several houskeeping genes (pyrH, recA, rpoA). We obtained 141 isolates; 10 from healthy adults, 52 from moribund adults with blisters and 79 from larvae. 46 from the moribund adults and 39 from the larvae were identified as Vibrio species, while the rest of these samples and all the isolates from healthy adult were identified as marine general bacteria. Among Vibrio species, Vibrio splendidus was the most frequently identified from the moribund adults and clustered with the known V. splendidus in GenBank by MLSA. However, it was still unclear that V. splendidus was the cause of blisters because the artificial infection experiment was not conducted and V. splendidus was isolated also from the larvae. Further studies are necessary to clarify the etiological agent of the blisters found in geoduck clam in this study.

주제어

표/그림 (10)

그림 Fig. 1. Geoduck clam (Panopea japonica) with blisters.
표 Table 1. Sampling of geoduck clam, Panopea japonica
표 Table 2. Oligonucleotide primers used for PCR identification of isolated bacteria.
표 Table 3. GenBank accession numbers of bacterial strains used in this study
표 Table 4. Number of bacterial isolates in this study
표 Table 5A. Species and Number of Vibrios Isolated in this study
표 Table 5B. Percentage occurrence of each Vibrio species isolates from moribund geoduck clam individuals in this study
그림 Fig. 2. Phylogenetic reconstructions based on 3 concatenated genes (pyrH, recA and rpoA). Alignment was conducted with all 3 genes. Gaps and missing parts in the sequence were eliminated to make 1,878 bp in total. The number after bacterial scientific name means strain number registered in the NCBI. The tree was constructed by neighbor-join-ing method. Numbers at nodes denote the level of bootstrap based on 1,000 replicates.
표 Table 6. Estimation of homology among Genus Vibrio species, based on the MLSA of 3 concatenated genetic sequences (pyrH, recA and rpoA genes)
표 Table 7. Differential phenotypic characteristics of Vibrio species isolated in this study and other Vibrio species

AI 본문요약
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문제 정의

, 2007). 본 연구에서는 코끼리조개 양식과정에 있어서 생존 및 성장에 영향을 미칠 가능성이 있는 병원성 세균들을 분리, 동정을 시도하였다. 특히 Vibrio 속 세균들을 대상으로 MLSA (Multilocus Sequence Analysis) 방법을 적용하여 균주를 종 수준까지 명확하게 동정하고, 해당균주들의 생화학적, 생리학적 특징을 조사하였다.

제안 방법

또한 이들 균주를 대상으로 온도 조건별, 염분조건별 배양을 진행하였다. TCBS agar 배지에 배양된 균주를 1.5% NaCl이 첨가된 TSB (Trypticase soybean broth, Difco, USA)배지에 계대배양하여 18~24시간 배양한 후 TSB 배지에 100 ㎕씩 접종하여 배양온도 4, 15, 25, 30, 40℃의 5가지 조건에서 각각 24~48시간 배양하여 각 균주의 성장여부를 관찰하였다. 또한 염분조건은 TSB 배지에 NaCl을 첨가하여 염분농도 0.
생화학적 특징을 확인하였다. TCBS agar 배지에 형성된 집락을 MB 배지에 계대배양하여 15℃에서 24~28시간 배양 후 API 20E kit의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 또한 이들 균주를 대상으로 온도 조건별, 염분조건별 배양을 진행하였다.
5% NaCl이 첨가된 TSB (Trypticase soybean broth, Difco, USA)배지에 계대배양하여 18~24시간 배양한 후 TSB 배지에 100 ㎕씩 접종하여 배양온도 4, 15, 25, 30, 40℃의 5가지 조건에서 각각 24~48시간 배양하여 각 균주의 성장여부를 관찰하였다. 또한 염분조건은 TSB 배지에 NaCl을 첨가하여 염분농도 0.5, 3, 5, 8, 10% 의 TSB 배지를 제작 후 각 100 ㎕씩 접종하여 15℃ 에서 24~48시간 배양하여 각 균주의 성장 여부를 관찰하였다.
TCBS agar 배지에 형성된 집락을 MB 배지에 계대배양하여 15℃에서 24~28시간 배양 후 API 20E kit의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 또한 이들 균주를 대상으로 온도 조건별, 염분조건별 배양을 진행하였다. TCBS agar 배지에 배양된 균주를 1.
일부 성패 시료는 수관부에 수포 형태의 병변이 발견되어 주사기를 사용하여 수포 내의 체액을 채취하여 세균 분리에 사용하였다. 모든 샘플은 증균배지인 MA (Marine agar 2216, Difco, USA)배지와 Vibrio 속 세균의 선택배지인 TCBS agar (Thioulphate citrate bile salts sucrose agar, Difco, USA)배지를 사용하여 코끼리 조개 사육 수온과 동일한 15℃에서 24~48시간 배양하여 세균분리를 시도하였다. 세균 집락이 형성된 배지는 육안으로 관찰하여 우점하고 있는 균주를 선택하여 2회 이상 계대배양을 통해 순수분리한 후에 MB (Marine broth 2216, Difco, USA) 배지에계대배양하여 15℃에서 24~48시간 배양하였다.
분리된 Vibrio 속 세균의 명확한 동정을 위해 16S rDNA gene을 비롯하여 Vibrio 과 세균의 housekeeping gene으로 알려진 pyrH, recA, rpoA gene 의 염기서열을 조합하여 MLSA (Multilocus sequence analysis)를 진행하였다. Vibrio 속에 속하는 참고 균주들의 각각의 유전자 염기서열은 Thompson et al.
분자생물학적 방법으로 동정된 10개의 균주 중에서 중복된 균주를 제외한 5개 균주 V. atlanticus (This study 1~2), V. splendidus (This study 6~7), V. tapetis (This study 5)를 API 20E kit (BioMeriux, France)와 Oxidase test (Becton Dickinson and company, USA)를 통해 생화학적 특징을 조사하였다. 그 결과, Oxidase test에서는 본 연구에 사용된 균주들 모두 Vibrio 속 세균과 동일한 양성 반응을 나타내었다.
분자생물학적 방법으로 동정한 균주 (This study 1, 2, 5, 6, 7)를 대상으로 그람음성 간균의 동정에 사용되는 API 20E test (BioMeriux, France)와 Oxidase test (Becton Dickinson and company, USA)를실시하여 생화학적 특징을 확인하였다. TCBS agar 배지에 형성된 집락을 MB 배지에 계대배양하여 15℃에서 24~28시간 배양 후 API 20E kit의 매뉴얼에 따라 진행하였다.
5% Agarose gel에서 전기영동 한 후 UV transilluminator를 사용하여 target 밴드를 확인하였다. 생성된 밴드는 절단하여 AccuprepⓇ Gel Purification kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 증폭된 산물을 정제, 회수하여 Solgent (Daejeon, Korea)에 sequencing을 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 GenBank에 등록되어 있는 참고 균주들의 유전정보와 함께 MEGA 6 Program (Tamura et al.
모든 샘플은 증균배지인 MA (Marine agar 2216, Difco, USA)배지와 Vibrio 속 세균의 선택배지인 TCBS agar (Thioulphate citrate bile salts sucrose agar, Difco, USA)배지를 사용하여 코끼리 조개 사육 수온과 동일한 15℃에서 24~48시간 배양하여 세균분리를 시도하였다. 세균 집락이 형성된 배지는 육안으로 관찰하여 우점하고 있는 균주를 선택하여 2회 이상 계대배양을 통해 순수분리한 후에 MB (Marine broth 2216, Difco, USA) 배지에계대배양하여 15℃에서 24~48시간 배양하였다. 배양된 세균은 80% glycerol과 동량으로 혼합하여 이후 실험까지 -80℃에서 동결보관하였다.
세균분리를 시도하였다. 유생은 40, 80, 100, 200㎛의 Nylon screen mesh를 사용하여 단계별로 필터링하여 이물질을 제거하고 멸균된 PBS (Phosphate buffered saline)로 수 회 세척한 후, 세척한 시료를 homogenizer를 사용하여 균질화한 후 멸균된 PBS 를 사용하여 10배씩 단계별로 희석하였다. 성패는 멸균된 해수로 세척하여 이물질을 제거한 후 패각근을 절개한 뒤 멸균된 백금이로 중장선(midgut gland) 내부를 수 회 휘저었다.
15 ℃에서 18~24시간 배양한 후 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 pellet 상태로 만든 후에 멸균된 PBS 로 수 회 세척한 다음 동일조건으로 다시 원심분리하여 새로운 세균 pellet을 만들었다. 제작한 pellet 은 QIAamp DNA kit (QIAGEN, Germany) 매뉴얼에 따라 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 16S rDNA primer를 사용하여 PCR을 진행하였고, TCBS agar 배지에서 분리한 균주는 Vibrio 과 세균의 housekeeping gene인 pyrH, recA, rpoA gene primer를 사용하여 추가로 PCR을 수행하였다.
증폭된 PCR 산물은 1.5% Agarose gel에서 전기영동 한 후 UV transilluminator를 사용하여 target 밴드를 확인하였다. 생성된 밴드는 절단하여 AccuprepⓇ Gel Purification kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 증폭된 산물을 정제, 회수하여 Solgent (Daejeon, Korea)에 sequencing을 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
제작한 pellet 은 QIAamp DNA kit (QIAGEN, Germany) 매뉴얼에 따라 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 16S rDNA primer를 사용하여 PCR을 진행하였고, TCBS agar 배지에서 분리한 균주는 Vibrio 과 세균의 housekeeping gene인 pyrH, recA, rpoA gene primer를 사용하여 추가로 PCR을 수행하였다. 본 실험에 사용한 primer sets의 정보는 Table 2에 나타내었다.
코끼리조개를 샘플링한 직후 실험실로 운반하여 세균분리를 시도하였다. 유생은 40, 80, 100, 200㎛의 Nylon screen mesh를 사용하여 단계별로 필터링하여 이물질을 제거하고 멸균된 PBS (Phosphate buffered saline)로 수 회 세척한 후, 세척한 시료를 homogenizer를 사용하여 균질화한 후 멸균된 PBS 를 사용하여 10배씩 단계별로 희석하였다.
본 연구에서는 코끼리조개 양식과정에 있어서 생존 및 성장에 영향을 미칠 가능성이 있는 병원성 세균들을 분리, 동정을 시도하였다. 특히 Vibrio 속 세균들을 대상으로 MLSA (Multilocus Sequence Analysis) 방법을 적용하여 균주를 종 수준까지 명확하게 동정하고, 해당균주들의 생화학적, 생리학적 특징을 조사하였다.

대상 데이터

2018년 9월부터 2020년 8월에 걸쳐 강원도 강릉시에 소재한 강릉원주대학교 해양생물연구센터에서 사육 중인 코끼리조개를 대상으로 성패의 경우 건강한 개체와 수관부에 수포형태의 병변을 보이는 빈사 개체를 총 8회 (21개체) 샘플링하였고, 유생의 경우 수정란부터 치패까지 유생 단계별로 총 10회 샘플링을 실시하였다 (Fig. 1, Table 1). 코끼리 조개는 아이스박스에 해수와 같이 넣어 실험실로 운반한 후 즉시 세균 분리에 사용하였다.
MA 배지와 TCBS agar 배지에서 배양, 분리한 총 141개의 균주를 MB 배지에 계대배양하였다. 15 ℃에서 18~24시간 배양한 후 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 pellet 상태로 만든 후에 멸균된 PBS 로 수 회 세척한 다음 동일조건으로 다시 원심분리하여 새로운 세균 pellet을 만들었다.

데이터처리

, 2013)의 Kimura two-pa-rameter model (Kimura, 1980)을 사용하여 계통수를 제작하였다. 균주들 간의 염기서열 상동성 조사는 MEGA 6 Program의 Distance estimation을 사용하였다.

이론/모형

MLSA 진행시 발생하는 염기서열간의 gap이나 누락된 서열들은 모두 제거하였다. Neighbor joining tree (Saitou and Nei, 1987)는 MEGA 6 Program (Tamura et al., 2013)의 Kimura two-parameter model (Kimura, 1980)을 사용하여 계산하였으며, Bootstrap values 는 1,000번을 기준으로 하였다. 균주들 간의 염기서열 상동성 조사는 MEGA 6 Program의 Distance estimation을 사용하였다.
The number after bacterial scientific name means strain number registered in the NCBI. The tree was constructed by neighbor-join-ing method. Numbers at nodes denote the level of bootstrap based on 1,000 replicates.
analysis)를 진행하였다. Vibrio 속에 속하는 참고 균주들의 각각의 유전자 염기서열은 Thompson et al. (2005), Dieguez et al. (2011), Balboa and Romalde (2013), Gabriel et al. (2014), Pérez-Cataluna et al. (2016)이 사용한 Vibrio 속 세균의 GenBank Accession number를 참고하였다 (Table 3). MLSA 진행시 발생하는 염기서열간의 gap이나 누락된 서열들은 모두 제거하였다.
생성된 밴드는 절단하여 AccuprepⓇ Gel Purification kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 증폭된 산물을 정제, 회수하여 Solgent (Daejeon, Korea)에 sequencing을 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 GenBank에 등록되어 있는 참고 균주들의 유전정보와 함께 MEGA 6 Program (Tamura et al., 2013)의 Kimura two-pa-rameter model (Kimura, 1980)을 사용하여 계통수를 제작하였다. 균주들 간의 염기서열 상동성 조사는 MEGA 6 Program의 Distance estimation을 사용하였다.

성능/효과

유생에서는 40개의 균주가 Pseudoalteromonas sp. (22.5 %, 9/40), Uncultured bacterium (17.5%, 7/40) 등 일반 해양 세균으로, 39개의 균주가 Vibrio 속 세균으로 동정되었다 (Table 4). 빈사개체와 유생에서 분리된 Vibrio 속 균주를 대상으로 housekeeping gene 을 사용하여 PCR 및 sequencing을 실시한 결과 빈사 개체에서 분리된 46개의 Vibrio 속 세균은 V.
(50%, 3/6), Pseudoalteromonas sp. (50%, 3/6)인 일반 해양 세균으로, 46개는 Vibrio 속 세균으로 동정되었다. 유생에서는 40개의 균주가 Pseudoalteromonas sp.
MLSA에 의해 코끼리조개에서 분리된 14개의 균주는 V. atlanticus (This study 1~4), V. tapetis (This study 5), V. spledidus (This study 6~14)로 각각 동정 되었다. 16S rDNA 유전자 단편만을 사용하여 염기서열을 분석한 경우에는 분리된 대다수의 Vibrio 속 균주들을 종 수준까지 동정하지 못하였다.
tapetis (This study 5)를 API 20E kit (BioMeriux, France)와 Oxidase test (Becton Dickinson and company, USA)를 통해 생화학적 특징을 조사하였다. 그 결과, Oxidase test에서는 본 연구에 사용된 균주들 모두 Vibrio 속 세균과 동일한 양성 반응을 나타내었다. API 20E test에서는 본 연구에 사용된 균주 모두 ONPG (β-galractosidase) test, LDC (Lysine Decarboxylase) test, VP (Voges Proskauer) test, GLU (Glucose) test 등이 기존의 연구 결과와 유사하였다.
동정된 Vibrio 속 세균들 중에서 무척 추동 물에 병원성이 있는 것으로 알려진 V. atlanticus (This1~4), V. tapetis (This study 5), V. splendidus (This 6~14)를 선택하여 MLSA를 실시한 결과 This study 1과 3은 V. atlanticus C 14.7, This study 2와 4는 V. atlanticus C 2.4와 동일한 cluster를 형성하였으며, This study 5는 V. tapetis a200, This study 6~14는 V. splendidus LMG 19031^T와 동일한 cluster를 형성하였다 (Fig. 2).
8%, 3/19) 등의 순서로 분리되었다 (Table 5B). 또한, 19 개체 중 7 개체에서는 2종 이상의 Vibrio속 세균이 분리되었으며, 이들 7 개체에서 모두 V. splendidus가 분리되었다 (data not shown).
이러한 병변이 발견된 개체는 검사 당시 빈사 상태이거나 결과적으로 폐사하는 것으로 보아 개체의 생존과 관련이 있는 것으로 생각되어 해당 병변에서 채취한 맑은 액체를 사용하여 세균 분리를 시도하였으며, Vibrio 속에 속하는 수 종의 세균이 분리되었다. 본 연구에서는 V. splendidus가 가장 많이 분리되어 코끼리조개에서 발견된 수포 형태의 병변과 관련이 있는 것으로 의심할 수 있었다. 하지만 이 세균은 유생에서도 분리되었으며, 성패를 대상으로 인위감염실험을 실시하지 않아 본 연구에서 분리된 Vibrio 속 세균이 수포 형태의 병변을 일으킨 1차적인 원인인지, 혹은 2차적으로 침입하여 증식한 결과인지는 확인할 수 없었다.
코끼리조개 (Japanese geoduck)의 질병에 관해서는 아직까지 보고된 바없으며, 본 연구에서 코끼리조개의 유생 및 성패를 채집하여 세균분리를 시도한 결과 총 141개의 세균이 분리되었으며 16S rDNA gene sequencing에 의해 56개의 세균은 일반해양세균으로, 85개의 세균은 비브리오 속 세균으로 동정되었다 (Table 4). 비브리오 속 세균은 housekeeping genes 및 MLSA 를 통해 V. splendidus, V. atlanticus, V. tapetis, V. chagasii 등 다양한 비브리오 속 세균으로 동정 되었다 (Table 5A).
5%, 7/40) 등 일반 해양 세균으로, 39개의 균주가 Vibrio 속 세균으로 동정되었다 (Table 4). 빈사개체와 유생에서 분리된 Vibrio 속 균주를 대상으로 housekeeping gene 을 사용하여 PCR 및 sequencing을 실시한 결과 빈사 개체에서 분리된 46개의 Vibrio 속 세균은 V. splendidus (56.5%, 26/46), V. atlanticus (10.8%, 5/46), V. tapetis (8.7% 4/46) 등으로 동정되었고, 유생에서 분리된 39개의 Vibrio 속 세균은 V. splendidus (20.5%, 8/39), V. atlanticus (10.2%, 4/39), V. chagasii (7.7%, 3/39) 등으로 동정되었다 (Table 5A). 빈사개체 19 개체에서는 V.
염기서열 상동성에서는 This study 1과 3은 V. atlanticus C 14.7, This study 2와 4는 V. atlanticus C 2.4와 상동성이 각각 99.30%, 99.57%이었으며, This study 5는 V. tapetis a200과 상동성이 99.79%, This study 6~14는 V. splendidus LMG 19031^T와 상동성이 99.57~99.95%이었다 (Table 6).
1). 이러한 병변이 발견된 개체는 검사 당시 빈사 상태이거나 결과적으로 폐사하는 것으로 보아 개체의 생존과 관련이 있는 것으로 생각되어 해당 병변에서 채취한 맑은 액체를 사용하여 세균 분리를 시도하였으며, Vibrio 속에 속하는 수 종의 세균이 분리되었다. 본 연구에서는 V.
하지만 이들의 감염에 의해 유의할만한 조직병리학적 변화나 폐사는 확인되지 않았다고 언급하였다. 코끼리조개 (Japanese geoduck)의 질병에 관해서는 아직까지 보고된 바없으며, 본 연구에서 코끼리조개의 유생 및 성패를 채집하여 세균분리를 시도한 결과 총 141개의 세균이 분리되었으며 16S rDNA gene sequencing에 의해 56개의 세균은 일반해양세균으로, 85개의 세균은 비브리오 속 세균으로 동정되었다 (Table 4). 비브리오 속 세균은 housekeeping genes 및 MLSA 를 통해 V.
코끼리조개 성패와 유생으로부터 세균 분리를 한 결과 정상개체에서 10개, 빈사개체에서 52개, 유생에서 79개, 총 141개의 균주가 분리되었다. 이들을 대상으로 16s rDNA sequencing을 실시한 결과 정상개체에서 분리된 균주는 Glaciecola sp.

후속연구

하지만 이 세균은 유생에서도 분리되었으며, 성패를 대상으로 인위감염실험을 실시하지 않아 본 연구에서 분리된 Vibrio 속 세균이 수포 형태의 병변을 일으킨 1차적인 원인인지, 혹은 2차적으로 침입하여 증식한 결과인지는 확인할 수 없었다. 차후 이들 Vibrio 속 세균을 사용한 인위감염을 실시하여 수포 형태의 병변과의 연관성을 밝힐 필요가 있으며, 세균 이외의 병원체가 원인일 가능성도 검토해 볼 필요가 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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