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중금속 흡착능 Leuconostoc mesenteroides CJNU 0705 균주를 활용한 피부 건강기능성 소재 개발
Development of Skin Health Promoting Materials Using Leuconostoc mesenteroides 원문보기

Microbiology and biotechnology letters = 한국미생물·생명공학회지, v.48 no.4, 2020년, pp.455 - 462  

한민희 (한국교통대학교 생명공학전공) ,  문기성 (한국교통대학교 생명공학전공)

초록
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Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주는 모유에서 분리되었으며 16S rRNA 유전자 염기서열 분석과 자당(2%)이 포함된 tryptic soy agar plate상에서의 덱스트란 생성능을 통하여 동정하였다. Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주는 미세먼지 속에 존재하는 피부 유해성 중금속인 납과 카드뮴에 대한 흡착능이 있으며 이러한 성질은 사균 상태에서도 확인되었다. 또한 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주는 여드름 원인균인 P. acnes 균주에 대하여 항균활성을 나타내었다. 마지막으로 피부 건강기능소재로 잘 알려진 녹차, 당근, 개똥쑥, 파슬리, 브로콜리 및 옥수수수염 추출물을 기본 배지(A)로 하여 2% 자당(B) 혹은 2% 자당과 3% 효모추출물(C)을 각각의 추출물에 첨가한 후 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주를 접종 및 배양하여 덱스트란 생산량을 확인한 결과 C 배지가 최적배지로 확인되었으며 덱스트란의 생산은 주사전자현미경 사진으로도 관찰되었다. 결론적으로 모유 유래의 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주나 이를 이용한 천연발효추출물은 피부 건강기능소재로 활용될 수 있을 것이다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

Leuconostoc mesenteroides CJNU 0705 was isolated from a breast milk sample and identified by 16S rRNA gene sequencing and confirmed by its ability to produce dextran from tryptic soy agar plates supplemented with 2% sucrose. This strain can absorb various heavy metals including lead (Pb) and cadmium...

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

  • mesenteroides 균종으로 동정되어 추가 검증을 위해 덱스트란 생산 유무를 확인하였다. 2% 자당(Daejung Co.)이 함유된 tryptic soy agar (BD) 고체배지에 배양액 2 μl (ca. 106 CFU)를 점적하여 25℃에서 배양한 결과 콜로니로부터 점질물이 생산되는 것을 관찰하였다 (Fig. 1B) [5, 9]. 유산균이 생산하는 세포 외 다당체(EPS, exopolysaccharides)는 다양한 환경으로부터 세포를 보호하는 기능을 하며 또한 다른 세포와의 상호작용에서도 중요한 역할을 한다[12].
  • 107 CFU/ml) 접종한 후 25℃에서 배양하면서 경시적으로 생균수를 측정하였다. 48시간 배양액에 대해서는 원심분리(5,000 rpm, 4℃, 5분) 후 세포를 회수하여 주사전자현미경(scanning electron microscope; JSM-6700F, JEOL, Japan) 사진을 촬영하였다. 또한 24시간 배양액의 균체량과 덱스트란 생성량을 확인하기 위하여 원심분리(5,000 rpm, 4℃, 15분)한 후 상등액에 2배의 100% EtOH을 첨가하여 24시간 동안 상온에서 방치하였다.
  • , Korea)이 함유된 tryptic soy agar (BD) 고체배지에 배양액 2 μl (ca.106 CFU)를 점적하여 25℃에서 배양하면서 콜로니 주변에 점질물이 생성되는지를 확인하였다[5, 9].
  • Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주는 모유에서 분리되었으며 16S rRNA 유전자 염기서열 분석과 자당(2%)이 포함된 tryptic soy agar plate상에서의 덱스트란 생성능을 통하여 동정하였다. Leu.
  • 추출물(A), 추출물+자당(2%)(B) 및 추출물+ 자당(2%)+효모추출물(3%)(C)을 배지로 사용하여 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주를 1% (ca. 107 CFU/ml) 접종한 후 25℃에서 배양하면서 경시적으로 생균수를 측정하였다. 48시간 배양액에 대해서는 원심분리(5,000 rpm, 4℃, 5분) 후 세포를 회수하여 주사전자현미경(scanning electron microscope; JSM-6700F, JEOL, Japan) 사진을 촬영하였다.
  • 또한 피부 건강에 유익한 것으로 잘 알려진 천연원료(녹차, 당근, 개똥쑥, 파슬리, 브로콜리, 옥수수수염)의 추출물에 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주를 적용하여 덱스트란 생산 조건을 확립하였다.
  • Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주를 접종하여 덱스트란 생산 조건을 최적화하였다. 즉, 원료 분말 혹은 원물을 1차 증류수와 혼합(최종농도 2%)하여 100℃에서 1시간 열수추출한 후 원심분리(4, 000 rpm, 4℃, 10분)하고 상등액을 0.
  • 마지막으로 피부친화적 천연원료를 기본 배지원으로 하여 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주의 덱스트란 생산조건을 최적화하였다.
  • Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주의 생균 및 사균에 대한 중금속 흡착능 실험을 진행하였다. MRS broth에서 배양된 Leu.
  • Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주의 생균 및 사균에대해 중금속 흡착능을 확인하였다. 납의 경우 대조구(무처리구)의 잔류 농도는 35.
  • MRS broth에서 배양된 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주의 생균과 80℃, 30분의 조건으로 처리한 사균 5 ml을 취하여 원심분리 (10, 000 rpm, 4℃, 5분)한 후 상등액을 제거하고 3차 증류수 100 µl로 세포 현탁 후 최종농도 100 ppm의 CdSO4 및 Pb(NO3)2 용액 5ml에 각각 첨가하였다. 이를 30℃, 200rpm 으로 6시간 동안 진탕 배양하였으며 원심분리(10, 000 rpm, 4℃, 5분) 후 상등액을 주사여과(0.
  • Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주의 중금속(납과 카드뮴) 흡착능을 검증하였으며 피부 건강기능 소재로서의 활용성을 높이기 위하여 여드름 원인균으로 잘 알려진 Propionibacterium acnes 균주에 대한 항균활성을 확인하였다. 또한 피부 건강에 유익한 것으로 잘 알려진 천연원료(녹차, 당근, 개똥쑥, 파슬리, 브로콜리, 옥수수수염)의 추출물에 Leu.
  • CJNU 0705 균주가 Leu. mesenteroides 균종으로 동정되어 추가 검증을 위해 덱스트란 생산 유무를 확인하였다. 2% 자당(Daejung Co.
  • CJNU 0705 균주가 Leu. mesenteroides 균종으로 동정되어 추가 검증을 위해 덱스트란 생성 유무를 확인하였다. 즉, CJNU 0705 균주를 tryptic soy broth (BD)에 계대 배양하여 활성화시킨 후 2% 자당(w/v; Daejung Co.
  • 이후 원심분리(5,000 rpm, 4℃, 15분)하여 상등액을 제거하고 100% EtOH로 현탁한 후 은박접시에 담아 80℃에서 건조하여 무게를 측정하였다[5]. 균체는 증류수에 현탁한후 상기의 조건으로 건조하여 무게를 측정하였다.
  • acnes 균주에 대하여 항균활성을 나타내었다. 마지막으로 피부 건강기능소재로 잘 알려진 녹차, 당근, 개똥쑥, 파슬리, 브로콜리 및 옥수수수염 추출물을 기본 배지(A)로 하여 2% 자당(B) 혹은 2% 자당과 3% 효모추출물 (C)을 각각의 추출물에 첨가한 후 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주를 접종 및 배양하여 덱스트란 생산량을 확인한 결과 C 배지가 최적배지로 확인되었으며 덱스트란의 생산은 주사전자현미경 사진으로도 관찰되었다.
  • 보관된 균주들을 대상으로 그람염색 및 현미경 관찰을 통하여 유산균으로 추정되는 CJNU 0705 균주를 선발하였다. 선발된 CJNU 0705 균주는 16SrRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정하였다. 즉, 국내 생명공학기업(Macrogen Co.
  • mesenteroides CJNU 0705 균주의 생균과 80℃, 30분의 조건으로 처리한 사균 5 ml을 취하여 원심분리 (10, 000 rpm, 4℃, 5분)한 후 상등액을 제거하고 3차 증류수 100 µl로 세포 현탁 후 최종농도 100 ppm의 CdSO4 및 Pb(NO3)2 용액 5ml에 각각 첨가하였다. 이를 30℃, 200rpm 으로 6시간 동안 진탕 배양하였으며 원심분리(10, 000 rpm, 4℃, 5분) 후 상등액을 주사여과(0.45 μm 주사필터; Anylab, Korea)하여 잔류 중금속을 유도결합플라즈마 질량분석기 (ICP-MS, Australia)로 정량분석하였다.
  • 7% agar, w/v)를 부었다. 이를 상기의 혐기적 방법으로 48시간 배양한 후 콜로니 주변에 생성되는 생육저해환(inhibition zone)을 관찰하였다.
  • 1% 펩톤수(w/v)로 10 진 희석하고 MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) 고체배지(BD, Sparks, MD)에 도말하여 37℃, 24시간 혐기적으로 배양하였다. 즉, GasPakTM EZ Anaerobe Container System (BD)을 사용하여 혐기 jar (Oxoid Ltd., UK)에서 24시간 배양한 후 무작위로 콜로니를 채취하여 MRS broth에서 배양한 다음 2차에 걸쳐 3분획법으로 순수분리하여 -76℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 보관된 균주들을 대상으로 그람염색 및 현미경 관찰을 통하여 유산균으로 추정되는 CJNU 0705 균주를 선발하였다.
  • 선발된 CJNU 0705 균주는 16SrRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정하였다. 즉, 국내 생명공학기업(Macrogen Co., Korea)에 의뢰하여 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머를 이용한 16S rRNA 유전자 PCR 증폭, 염기서열 분석 및 동정을 수행하였다.
  • 45 µm 멤브레인 필터(Merck Millipore, Ireland)로 감압 여과하였다. 추출물(A), 추출물+자당(2%)(B) 및 추출물+ 자당(2%)+효모추출물(3%)(C)을 배지로 사용하여 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주를 1% (ca.
  • 45 µm 멤브레인 필터(Merck Millipore, Ireland)로 감압 여과하였다. 추출물(A), 추출물+자당(2%)(B) 및 추출물+ 자당(2%)+효모추출물(3%)(C)을 배지로 사용하여 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주를 1% (ca.

대상 데이터

  • 즉, MRS 고체배지에 하룻밤 배양한 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주 2 μl (ca. 106 CFU)를 점적하여 37℃, 12시간 배양한 후 그 위에 지시균(P. acnes KCTC 3314)이 1% (ca. 107 CFU/ml) 함유된 RCM (reinforced clostridial medium; BD) soft agar (0.7% agar, w/v)를 부었다. 이를 상기의 혐기적 방법으로 48시간 배양한 후 콜로니 주변에 생성되는 생육저해환(inhibition zone)을 관찰하였다.
  • 기증받은 모유(2007년 충북지역)를 0.1% 펩톤수(w/v)로 10 진 희석하고 MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) 고체배지(BD, Sparks, MD)에 도말하여 37℃, 24시간 혐기적으로 배양하였다. 즉, GasPakTM EZ Anaerobe Container System (BD)을 사용하여 혐기 jar (Oxoid Ltd.
  • 녹차와 당근 분말은 농업회사법인 푸른산㈜ (서울) 제품을 구매하였고 개똥쑥과 파슬리 분말은 인그린㈜ (포천) 제품을 구매하였으며 브로콜리 분말과 옥수수수염 원물은 서원대학교(청주)로부터 제공받았다.
  • , UK)에서 24시간 배양한 후 무작위로 콜로니를 채취하여 MRS broth에서 배양한 다음 2차에 걸쳐 3분획법으로 순수분리하여 -76℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 보관된 균주들을 대상으로 그람염색 및 현미경 관찰을 통하여 유산균으로 추정되는 CJNU 0705 균주를 선발하였다. 선발된 CJNU 0705 균주는 16SrRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정하였다.
  • 식물성 천연 원료인 녹차, 당근, 개똥쑥, 파슬리, 브로콜리, 옥수수수염은 분말 혹은 원물 형태로 구매 혹은 제공받았다. 녹차와 당근 분말은 농업회사법인 푸른산㈜ (서울) 제품을 구매하였고 개똥쑥과 파슬리 분말은 인그린㈜ (포천) 제품을 구매하였으며 브로콜리 분말과 옥수수수염 원물은 서원대학교(청주)로부터 제공받았다.

데이터처리

  • The values indicate averages of triplicate experiments. **, p<0.01 and ***, p<0.001 when compared with the hot-water extracts by one-way ANOVA with Duncan's multiple range test.
  • 3반복 실험의 결과 값은 평균 혹은 평균±표준편차로 나타내었으며 SPSS (ver. 25, SPSS Inc., USA) 프로그램을 사용하여 일원분산분석(one-way ANOVA)으로 유의성을 검증하고 Duncan’s multiple range test로 사후 검정하였다.

이론/모형

  • acnes 균종에 대한 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주의 항균활성 유무를 확인하기 위하여 한천확산법(agar diffusion method)을 사용하였다. 즉, MRS 고체배지에 하룻밤 배양한 Leu.
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