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문제 정의
- tolaasii 균주들 중 대표 균주를 선발하여 이들의 병원 특성들을 확인하였다[10]. 이를 바탕으로 본 연구에서는 다양한 시기와 장소에서 분리한 갈반병 원인균주들을 병원 특성에 따라 분류하고, 이 균주들이 분비하는 tolaasin 펩티드의 독성을 조사하였다.
제안 방법
- , Tokyo, Japan)를 이용하여 220nm의 파장에서 확인하였다. Gel permeation chromatography 로부터 얻은 tolaasin 활성을 갖는 분획들의 펩티드 분석은 Protein-Pak 60 column으로 구성된 HPLC (YL9100 Series HPLC, Younglin Co. Ltd., Anyang, Korea)를 이용하였으며, 이동상은 10mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)이며, 0.5mL/min 유속의 조건에서 분석하였다.
- 모든 균주들의 chromatograme 조금의 차이는 있으나 앞과 뒤의 크고 작은 2개 또는 앞의한 밴드가 얻어졌으며, 각각을 band A와 band B로 구별하였다. Gel permeation chromatography 방법을 통해 얻은 분획들 중 세포 독성을 보이는 분획을 추적하기 위하여 모든 분획에서 용혈활성을 측정하였다(Fig. 2). 균주들은 크로마토그래피 분획들 중 15-25번 분획 부근에서 높은 흡광도를 보였고(band A), 특히 Ptα 소그룹에 속한 P.
- Gel permeation chromatography로부터 얻은 각 균주들의 분획들은 질량분석기로 분석하였다. 분획에 포함된 tolaasin 및 유사체는 원활한 측정을 위해 ziptip (Millipore ziptips, Sigma- Aldrich, St.
- 측정한 모든 시료의 mass to charge (m/z) 범위는 300에서 20, 000 m/z까지 측정하였다. Tolaasin의 분자량을 측정하기 전, external calibratione bradykinin, angiotensin, bombesin, renin, somatostatin 등의 다양한 standard peptide mixture로 수행하였다.
- 각 균주들의 배양액을 농축하여 얻은 분획들을 HPLC를 이용하여 분석하였다. Ptα와 Ptγ 소그룹에 속한 균주에서는 용혈활성을 가진 band A 분획을 분석하였고, 용혈활성이 없는 Ptβ 소그룹 균주에서는 Ptα 소그룹에서 용혈활성을 보인 분획과 같은 tolaasii
- Tolaasin의 순수분리는 Cho 등[9]의 방법에 따라 수행하였으며, gel permeation chromatography 와 high-performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 분석하였다. 간략히, Sephadex G-75로 충전된 column (1.7 ×45cm)에 crude tolaasin을 가한 후, 1mL/min의 유속으로 용출하여 각 분획에서 펩티드 물질의 함유 여부를 UV/Vis spectrophotometer (U-2000, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 220nm의 파장에서 확인하였다. Gel permeation chromatography 로부터 얻은 tolaasin 활성을 갖는 분획들의 펩티드 분석은 Protein-Pak 60 column으로 구성된 HPLC (YL9100 Series HPLC, Younglin Co.
- 다양한 P. tolaasii 균주들을 PAF (Pseudomonas agar F; MgSO4 ·7H2O 1.5g, K2HPO4 1.5g, Bacto-peptone 10g, Bacto-tryptone 10g, glycerol 10mL per liter) 액체 배지에 접종하여 배양한 후, 균체가 제거된 배양상징액에 30%의 ammonium sulfate를 가하고 4oC에서 정치한 후 초원심분리하여 crude tolaasin을 얻었고, 이를 순수분리에 사용하였다. Tolaasin의 순수분리는 Cho 등[9]의 방법에 따라 수행하였으며, gel permeation chromatography 와 high-performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 분석하였다.
- 이러한 HPLC chromatogram을 가진 각 균주들의 분획에 포함된 펩티드의 분자량을 MALDI-TOF mass spectrometry를 이용하여 분석하였다. 먼저 각 균주들의 mass spectrum을 비교하기 위하여, 전체 측정 범위(m/z 300-3, 500)의 spectrum을 비교하였다(Fig. 4). Ptα 소그룹 균주인 P.
- 이 균주들을 48시간 배양한 후 독성펩티드를 포함한 배양상징액을 농축한 후, gel permeation chromatography 를 이용하여 균주들의 펩티드 합성 및 분비 특성을 조사하였다. 모든 균주들의 chromatograme 조금의 차이는 있으나 앞과 뒤의 크고 작은 2개 또는 앞의한 밴드가 얻어졌으며, 각각을 band A와 band B로 구별하였다. Gel permeation chromatography 방법을 통해 얻은 분획들 중 세포 독성을 보이는 분획을 추적하기 위하여 모든 분획에서 용혈활성을 측정하였다(Fig.
- 번호의 분획을 분석하였다(Fig. 3). Ptα 소그룹인 P.
- tolaasii HK23 변이주들을 각 소그룹별 대표균주로 선발하였다. 이 균주들을 48시간 배양한 후 독성펩티드를 포함한 배양상징액을 농축한 후, gel permeation chromatography 를 이용하여 균주들의 펩티드 합성 및 분비 특성을 조사하였다. 모든 균주들의 chromatograme 조금의 차이는 있으나 앞과 뒤의 크고 작은 2개 또는 앞의한 밴드가 얻어졌으며, 각각을 band A와 band B로 구별하였다.
- 이전 연구에서 시기와 장소를 달리하여 갈반병에 감염된 버섯에서 다양한 갈반병 유발 균주들을 분리하였고, 이들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 GenBank database에 등록된 염기서열과 비교하여 Pseudomonas tolaasii 변이균주들(Pt 그룹)을 얻었다. Pt 그룹에 속한 균주들은 유전자 계통수 분석에서 서로 가깝게 위치하나, 세 그룹으로 나뉘어 있어 이들을 Ptα (6264, HK1-HK5)와 Ptβ (HK7-HK22), Ptγ (HK23) 소그룹으로 세분류 하였다[10].
- 이전 연구에서 충북 및 경북 지역에서 분리한 P. tolaasii 균주들 중 대표 균주를 선발하여 이들의 병원 특성들을 확인하였다[10]. 이를 바탕으로 본 연구에서는 다양한 시기와 장소에서 분리한 갈반병 원인균주들을 병원 특성에 따라 분류하고, 이 균주들이 분비하는 tolaasin 펩티드의 독성을 조사하였다.
- Mass spectrume 20kV의 가속 전압으로 양이온 모드에서 기록되었으며, 레이저로 500번 조사하여 얻은 수치의 평균치로 나타내었다. 측정한 모든 시료의 mass to charge (m/z) 범위는 300에서 20, 000 m/z까지 측정하였다. Tolaasin의 분자량을 측정하기 전, external calibratione bradykinin, angiotensin, bombesin, renin, somatostatin 등의 다양한 standard peptide mixture로 수행하였다.
- 흰색침강선형성검정법은 Pseudomonas reactans ATCC 51314 균주 배양액을 PAF 고체 배지 중간에 일직선으로 접종한 후, 이와 약 5mm의 간격을 두고 P. tolaasii 균주 배양액 3μL를 점적하여 이루어졌다. 접종을 완료한 agar plate는 25oC에서 24-48시간 동안 배양하며, 두 균주 사이에 흰색 침전 형성 여부를 확인하였다[11].
대상 데이터
- Pt 그룹에 속하는 균주들의 병원 특성 구명을 위하여 Ptα 소그룹의 P. tolaasii 6264와 HK1, Ptβ 소그룹의 P. tolaasii HK19, Ptγ 소그룹에서 P. tolaasii HK23 변이주들을 각 소그룹별 대표균주로 선발하였다. 이 균주들을 48시간 배양한 후 독성펩티드를 포함한 배양상징액을 농축한 후, gel permeation chromatography 를 이용하여 균주들의 펩티드 합성 및 분비 특성을 조사하였다.
이론/모형
- 측정 직전에 염류를 제거한 시료를 matrix와 1μL씩 취하여 혼합하고, 이혼합액을 stainless steel target plate (384-well plate, Shimadzu, Tokyo, Japan)에 점적한 후 건조시켰다. Tolaasin의 분자량 측정은 MALDI-TOF/TOF mass spectrometry (ultrafleXtremeⅢ, Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 이용하였다. Mass spectrume 20kV의 가속 전압으로 양이온 모드에서 기록되었으며, 레이저로 500번 조사하여 얻은 수치의 평균치로 나타내었다.
- 5g, Bacto-peptone 10g, Bacto-tryptone 10g, glycerol 10mL per liter) 액체 배지에 접종하여 배양한 후, 균체가 제거된 배양상징액에 30%의 ammonium sulfate를 가하고 4oC에서 정치한 후 초원심분리하여 crude tolaasin을 얻었고, 이를 순수분리에 사용하였다. Tolaasin의 순수분리는 Cho 등[9]의 방법에 따라 수행하였으며, gel permeation chromatography 와 high-performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 분석하였다. 간략히, Sephadex G-75로 충전된 column (1.
- 8 분의 지연시간을 갖는 매우 작은 peak들이 얻어졌다. 이러한 HPLC chromatogram을 가진 각 균주들의 분획에 포함된 펩티드의 분자량을 MALDI-TOF mass spectrometry를 이용하여 분석하였다. 먼저 각 균주들의 mass spectrum을 비교하기 위하여, 전체 측정 범위(m/z 300-3, 500)의 spectrum을 비교하였다(Fig.
성능/효과
- 이전 연구에서 수행한 Pt 그룹에 속한 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열은 근소한 차이를 보였음에도, 본 연구에서 밝힌 균주들의 병원 특성 및 독성 펩티드 분비에서는 큰 차이를 보였다. Ptα 소그룹 균주들은 용혈활성 및 갈반형성능, 흰색침강선형성능에서 모두 양성의 반응을 보였고, tolaasin류의 펩티드를 분비하였다. 그러나, Ptβ 소그룹에 속한 균주들은 갈반형성능만 보이며 그외 다른 병원 특성에서는 음성으로 나타났고 tolaasin류의 펩티드 독소는 분비하지 않았다.
- 4). Ptα 소그룹 균주인 P. tolaasii 6264 균주에서는 band A와 B 모두에서 약 m/z 2,000 부근에서 높은 intensity를 보였고, 그 외 Ptβ와 Ptγ 소그룹 균주인 P. tolaasii HK19와 HK23 균주는 band A에서 m/z 2,000 부근의 peak를 확인할수 없었다. 이를 tolaasin 펩티드 유사체만을 확인할 수 있는 범위로 m/z 1, 900-2, 100으로 좁혀 확인하였다(Fig.
- 3). Ptα 소그룹인 P.6264와 HK1 균주의 펩티드 분획에서는 각각 10.5분과 17.8분의 지연시간(retention time)에서 크고 작은 peak가 각각 나타났고, Ptγ 소그룹인 P. tolaasii HK23 균주의 분획에서도 유사하게 11.0분과 17.8분의 지연시간을 보이는 peak가 관측되었다. Ptβ 소그룹인 P.
- tolaasii 6264와 HK1 균주는 band A와 band B 모두에서 용혈활성이 얻어졌다. Ptβ 소그룹에 속한 P.tolaasiiHK19 균주에서는 모든 분획에서 용혈활성이 보이지 않았고, Ptγ 소그룹인 P. tolaasii HK23 균주는 band A에 속한 넓은 범위의 분획에서 용혈활성이 얻어졌다. P.
- 각 균주들의 분획별로 용혈활성을 측정한 결과, Ptα 소그룹에 속한 P. tolaasii 6264와 HK1 균주는 band A와 band B 모두에서 용혈활성이 얻어졌다. Ptβ 소그룹에 속한 P.
- 2). 균주들은 크로마토그래피 분획들 중 15-25번 분획 부근에서 높은 흡광도를 보였고(band A), 특히 Ptα 소그룹에 속한 P.tolaasii6264와 HK1 균주에서는 40-60번째 분획의 두번째 흡수 밴드 (band B)에서도 큰 흡광도가 얻어졌다.
- 1). 그러나, Ptα 소그룹을 제외한 Ptβ와 Ptγ 소그룹에 속한 균주들은 모두 침전을 형성하지 않아 tolaasin류 펩티드를 생산하지 않음을 확인하였다.
- Yun의 연구[15]는 Ptα 소그룹과 같이 용혈 활성과 갈반형성능, 흰색침강선형성능 등의 모든 병원 특성에서 양성의 결과를 보인 균주에서는 균체에 lysozyme과 sonication 처리를 통해 세포막조직을 파괴하였을 때, 세포 내에 합성 및 축적되어 있던 tolaasin 펩티드 및 유사체 성분들이 세포 밖으로 유출되어 용혈 활성이 크게 나타났다. 그러나, Ptβ 소그룹과 같이 갈반형성능에서만 양성의 결과를 보인 균주에서는 세포막을 파괴하여도 용혈활성이 나타나지 않아 펩티드의 분비능에 이상이 있기 보다는 균주 자체의 tolaasin 펩티드 합성이 이루어지지 않음을 알 수 있었다(자료미제시).
- Ptα 소그룹 균주들은 용혈활성 및 갈반형성능, 흰색침강선형성능에서 모두 양성의 반응을 보였고, tolaasin류의 펩티드를 분비하였다. 그러나, Ptβ 소그룹에 속한 균주들은 갈반형성능만 보이며 그외 다른 병원 특성에서는 음성으로 나타났고 tolaasin류의 펩티드 독소는 분비하지 않았다. 또한, Ptγ 소그룹에 속한 균주는 용혈활성과 갈반형성능을 보였으나, tolaasin류 펩티드는 분비하지않았다.
- Tolaasin 분자가 다중체를 형성하여 세포막에 pore를 형성하는 것은 이미 보고한 바 있다[13]. 그에 반해, P. tolaasii HK19와 P.tolaasii HK23 균주에서는 tolaasin 및 그 유사체를 확인할 수 없었으며, 주로 1, 100-1, 200 Da 사이의 m/z 범위에서 펩티드 성분들을 확인할 수 있었다(Fig. 5C and 5D). 질량 분석에 의해 얻어진 균주별 모든 펩티드들은 Table 1에 나타냈으며, Ptβ와 Ptγ 소그룹 균주는 Ptα 소그룹 균주와 펩티드 종류가 뚜렷이 다름을 확인할 수 있었다.
- 또한, Ptγ 소그룹에 속한 균주는 용혈활성과 갈반형성능을 보였으나, tolaasin류 펩티드는 분비하지않았다. 따라서, 세균의 병원 특성은 16S rRNA 유전자 염기서열에 따른 분류와 반드시 일치하는 결과를 보이지는 않음을 확인할 수 있었다.
- 그러나, Ptβ 소그룹에 속한 균주들은 갈반형성능만 보이며 그외 다른 병원 특성에서는 음성으로 나타났고 tolaasin류의 펩티드 독소는 분비하지 않았다. 또한, Ptγ 소그룹에 속한 균주는 용혈활성과 갈반형성능을 보였으나, tolaasin류 펩티드는 분비하지않았다. 따라서, 세균의 병원 특성은 16S rRNA 유전자 염기서열에 따른 분류와 반드시 일치하는 결과를 보이지는 않음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서 Pt 그룹에 속한 균주들의 병원 특성과 펩티드독소 tolaasin류의 조성을 분석하였을 때, Ptα 소그룹에 속한 균주들은 모두 tolaasin I과 tolaasin II를 비롯하여 1, 973 Da과 2, 005 Da의 tolaasin 유사체를 분비하였다. 그러나, Ptβ 소그룹과 Ptγ 소그룹에 속한 균주는 tolaasin 유사체보다는 분자량이 작은 성분을 분비하고 있으나, 이들의 세포 독성이나 버섯에 갈반을 형성하는 활성은 확인하지 못하였다.
- reactans 균주가 분비하는 펩티드 물질인 WLIP (white line inducing principle)라는 물질과 반응하여 흰색의 침전을 형성한다[12]. 이러한 반응을 이용하여 그간에 분리한 Pt 그룹 균주들의 흰색침강선형성능을 확인한 결과, 용혈활성과 갈 반형 성능을 모두 가진 P. tolaasii 6264 및 HK1-HK5 균주들만이 P. reactans ATCC 51314 균주와의 대치배양에서 흰색의 침전을 형성하여, Pt 그룹에 속하는 변이 균주중 Ptα 소그룹 균주들만이 tolaasin 을 분비함을 확인하였다(Fig. 1). 그러나, Ptα 소그룹을 제외한 Ptβ와 Ptγ 소그룹에 속한 균주들은 모두 침전을 형성하지 않아 tolaasin류 펩티드를 생산하지 않음을 확인하였다.
- 그러나, 16S rRNA 유전자 염기서열은 약 1,500 개의짧은 염기서열로, 세균의 모든 특성을 반영하지 못하여 분류 정보로서의 이용이 제한적일 수밖에 없다[18, 19]. 이전 연구에서 수행한 Pt 그룹에 속한 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열은 근소한 차이를 보였음에도, 본 연구에서 밝힌 균주들의 병원 특성 및 독성 펩티드 분비에서는 큰 차이를 보였다. Ptα 소그룹 균주들은 용혈활성 및 갈반형성능, 흰색침강선형성능에서 모두 양성의 반응을 보였고, tolaasin류의 펩티드를 분비하였다.
후속연구
- 따라서 tolaasine 합성의 전구체나 유사 형태로 분비될 수 있으며, 이들이 배양액 중에 존재할 수 있어, Ptβ 소그룹 균주의 경우에도 완전한 tolaasin 분자보다는 전구체의 작은 분자 형태로 존재할 가능성도 배제할 수 없다. 이에 tolaasin 전구체를 포함한 펩티드들이 버섯에 갈반을 형성하는 활성을 갖는지를 조사하여야 할 것이다. Yun의 연구[15]는 Ptα 소그룹과 같이 용혈 활성과 갈반형성능, 흰색침강선형성능 등의 모든 병원 특성에서 양성의 결과를 보인 균주에서는 균체에 lysozyme과 sonication 처리를 통해 세포막조직을 파괴하였을 때, 세포 내에 합성 및 축적되어 있던 tolaasin 펩티드 및 유사체 성분들이 세포 밖으로 유출되어 용혈 활성이 크게 나타났다.
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