[논문]미세먼지의 di(2-ethylhexyl) phthalate가 유도한 피부상피세포 사멸 신호전달기전 연구

박정배; 김지윤; 성정희; 김용웅; 이세중

doi:10.5322/jesi.2020.29.3.249

미세먼지의 di(2-ethylhexyl) phthalate가 유도한 피부상피세포 사멸 신호전달기전 연구
Di(2-ethylhexyl) Phthalate Induces the Apoptotic Cell Death Mediated by Production of Reactive Oxygen Species in Human Keratinocyte 원문보기

Journal of environmental science international = 한국환경과학회지, v.29 no.3, 2020년, pp.249 - 255

박정배 (대구한의대학교 제약공학과) , 김지윤 (대구한의대학교 제약공학과) , 성정희 (리엔젠 부설연구소) , 김용웅 (대구한의대학교 제약공학과) , 이세중 (대구한의대학교 제약공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Particulate matter with an aerodynamic diameter of less than 2.5 μM (PM2.5) is one of the major environmental pollutants. Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), an endocrine disrupting chemical in PM2.5, has been utilized for the manufacturing of polyvinyl chloride to increase the flexibility of final products. In the present study, we investigated the ecotoxicological effect of DEHP on the viability of skin keratinocytes (HaCaT). DEHP induced apoptotic cell death mediated by phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase through the production of intracellular Reactive Oxygen Species (ROS). Interestingly, we found that DEHP induces the phosphorylation of the nuclear factor-kappa B responsible for the expression of cleaved caspase-3 as an executional cell death protease in HaCaT cells. On the basis of these results, we suggest that DEHP in PM2.5 induces the apoptotic death of human keratinocytes via ROS-mediated signaling events.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

특히 최근에 환경 오염의 증가로 인해 미세먼지로부터 피부질환에 대한 우려로 다양한 안티폴루션(anti-pollution) 화장품이 증가 하는 추세지만 이러한 제품의 문제점은 대부분 피부에 부착된 미세먼지를 닦아낼 수 있는 클렌징 제품이며 실제 피부손상 및 피부질환 유도기작은 아직 규명되지 않았다. 따라서 이 연구는 미세먼지에 다량 존재하는 프탈 레이트가 피부상피세포의 손상에 미치는 작용기작 및 그신호전달체계를 밝히고자 한다.
프탈레이트[di(2-ethylhexyl) phthalate]는 미세먼지 내에 다량으로 존재하는 내분비계 교란물질 중 하나이며, 플라스틱 제품의 제조 시 가소제로 흔히 사용되는 물질로 알려져 있다. 본 연구에서는, 프탈레이트가 피부상피 세포에서의 세포사멸에 미치는 세포수준의 신호전달기 전에 대하여 알아보았다. 프탈레이트는 세포 내 활성산 소종(reactive oxygen species)의 생성을 통해 mitogen -activated protein kinases 중 extracellular signal -regulated kinase의 인산화를 촉진하였다.

제안 방법

프탈레이트[di(2-ethylhexyl) phthalate]가 피부상피 세포(HaCaT cells)에 미치는 영향을 알아보기 위해 water soluble tetrazolium salt (WST)와 mitochondrial dehydrogenase의 반응으로 형성되는 세포생존율의 지표인 formazan의 양을 측정하는 EZ-CYTOX 실험을 진행하였다(Kim et al., 2013). Fig.

대상 데이터

본 실험에 사용된 시약 중, di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)는 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였고, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 배지와 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)은 GE Healthcare Life Sciences (Morningside, Queensland, Australia)에서 구입하였으며, JNK, phospho-JNK, ERK, phospho-ERK, p38 MAPK, phospho-p38 MAPK, NF-κBp65, phospho-NF-κBp65, caspase-3 및 β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Paso Robles, CA, USA)의 제품을 사용하였다. 사용된 시약은 순도가 높은 (순도 99% 이상) 등급을 구입하였다.
세포 내 활성산소량은 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (CM-H₂DCFDA)를 이용해 측정하였다. 피부 상피세포에 프탈레이트를 처리한 후, 10 mM의 CM -H₂DCFDA를 30분 동안 처리하고 어두운 곳에서 배양 하였다.
인간유래 피부각질세포(skin keratinocyte, HaCaT) 는 미국 세포주은행(american type culture collection, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였으며, DMEM 배지에 10%의 FBS, 100 U/ml의 penicillin 및 100 μg/ml의 streptomycin을 혼합한 후 37℃와 5%의 CO₂조건의 세포배양기에서 배양하였다.

데이터처리

)로 나타냈다. 통계적 유의적 차이는 GraphPad (Prism 6, GraphPad Software, CA, USA) 를 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법으로 결정하였으며, P-values < 0.05의 값들을 유의 적인 결과로 고려하였다.

이론/모형

프탈레이트가 피부상피세포에 미치는 독성효과를 측정하기 위해 EZ-CYTOX (DoGen Bio, Seoul, Korea) 를 사용하였다. 세포를 96-well flat bottom plates에 분주하고 실험의 마지막 단계에서 10 μl의 EZ-CYTOX를각 well에 첨가하였다.

성능/효과

Fig. 2A에서 보는 바와 같이, 500 μM의프탈레이트에 의해 유도된 피부상피세포의 활성산소종을 시간에 따라 측정하였을 때, 세포 내 활성산소 발생 수준은 대조군과 비교하여 30분째 36%만큼 유의적 수준 으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 실험의 결과는 세포 내 활성산소를 CM-H₂DCFDA로 염색하여 형광현미경 사진을 통해 관찰할 수 있었다(Fig.
Fig. 4에서 보는 바와 같이, 500 μM의 프탈 레이트를 피부상피세포에 처리하였을 때, NF-κB 단백질의 인산화 수준은 대조군과 비교하여 1시간째 유의적 으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. NF-κB는 세포의 증식, 분화, 염증반응 및 세포사멸 등에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 조절하는 세포 내 신호전달체계의 중심 이며, 대부분의 세포에 있어서 NF-κB는 IκB라는 inhibitory protein이 결합된 상태로 존재하고 있다가 NF-κB가 활성화되면 IκB와 분리되어 핵막을 통과하여핵 내로 이동한 후 세포자살과 관련된 다양한 mRNA의생성에 관여한다고 알려져 있다(Baeuerle and Henkel, 1994).
, 2018). 따라서 이러한 연구결과들은 미세먼지 속 환경호르몬은 피부상피세포 손상에 유의적인 영향이 있음을 시사한다.
, 2017). 따라서 이와 같은 결과는 미세먼지에 존재하는 내분비계 교란물질인 프탈레이트가 세포 내 활성산소종 발생을 통하여 피부상피세포 손상의 신호전달기작을 유도한다는 것을 시사한다.
NF-κB는 세포의 증식, 분화, 염증반응 및 세포사멸 등에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 조절하는 세포 내 신호전달체계의 중심 이며, 대부분의 세포에 있어서 NF-κB는 IκB라는 inhibitory protein이 결합된 상태로 존재하고 있다가 NF-κB가 활성화되면 IκB와 분리되어 핵막을 통과하여핵 내로 이동한 후 세포자살과 관련된 다양한 mRNA의생성에 관여한다고 알려져 있다(Baeuerle and Henkel, 1994). 따라서, 이와 같은 결과는 프탈레이트가 NF-κB의 인산화 및 핵내로의 이동을 유도하여 세포사멸에 관련한 유전자의 발현을 조절하는 것임을 알 수 있다.
또한 프탈레 이트는 피부상피세포에서 전사인자인 nuclear factor -kappa B의 인산화를 통해 세포사멸의 유발인자 중 하나인 caspase-3의 활성을 자극하였다. 이러한 결과를 종합해보면, 미세먼지의 프탈레이트는 피부상피세포에서 활성산소종의 생산을 통해 피부세포의 사멸을 유도하여 피부세포손상을 일으키는 내분비계 교란물질이다라고 요약할 수 있다.
지금까지의 연구를 종합해 볼 때, 프탈레이트는 피부 상피세포에서 세포 내 활성산소종을 생성하고, ERK 및 NF-κB의 인산화를 통해 caspase-3의 활성을 조절하여 피부세포손상을 야기시킨다는 것을 알 수 있다. 향후 피부상피세포에서 프탈레이트가 유도하는 세포사멸 신호 전달 기전을 밝히기 위해 프탈레이트의 수용체 작용기전에 대한 분자생물학적인 연구가 더 필요하며, 피부손상에 있어서 프탈레이트의 유해 메커니즘을 억제할 수 있는 제어제에 대한 연구가 수행되어야 할 것이다.

후속연구

지금까지의 연구를 종합해 볼 때, 프탈레이트는 피부 상피세포에서 세포 내 활성산소종을 생성하고, ERK 및 NF-κB의 인산화를 통해 caspase-3의 활성을 조절하여 피부세포손상을 야기시킨다는 것을 알 수 있다. 향후 피부상피세포에서 프탈레이트가 유도하는 세포사멸 신호 전달 기전을 밝히기 위해 프탈레이트의 수용체 작용기전에 대한 분자생물학적인 연구가 더 필요하며, 피부손상에 있어서 프탈레이트의 유해 메커니즘을 억제할 수 있는 제어제에 대한 연구가 수행되어야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	피부는 인체에서 어떠한 역할을 하는가?	피부는 인체에서 외부의 자극으로부터 내부를 보호하는 장벽기능의 역할을 하며, 끊임없는 세포분열과 분화를 통해 새로운 표피(skin keratinocyte)를 만들어 신체 내부의 체 액이 빠져나가는 것을 방지한다(Kim and Jung, 2012). 그중 피부를 구성하고 있는 표피세포는 자가포식 및 세포면역 반응을 통하여 이러한 외부자극을 제어하는 것으로 알려져 있다(Yoon et al.
	표피세포의 기능은 무엇인가?	피부는 인체에서 외부의 자극으로부터 내부를 보호하는 장벽기능의 역할을 하며, 끊임없는 세포분열과 분화를 통해 새로운 표피(skin keratinocyte)를 만들어 신체 내부의 체 액이 빠져나가는 것을 방지한다(Kim and Jung, 2012). 그중 피부를 구성하고 있는 표피세포는 자가포식 및 세포면역 반응을 통하여 이러한 외부자극을 제어하는 것으로 알려져 있다(Yoon et al., 2013).
	프탈레이트는 무엇을 통해 caspase-3의 활성을 자극하는가?	프탈레이트는 세포 내 활성산 소종(reactive oxygen species)의 생성을 통해 mitogen -activated protein kinases 중 extracellular signal -regulated kinase의 인산화를 촉진하였다. 또한 프탈레 이트는 피부상피세포에서 전사인자인 nuclear factor -kappa B의 인산화를 통해 세포사멸의 유발인자 중 하나인 caspase-3의 활성을 자극하였다. 이러한 결과를 종합해보면, 미세먼지의 프탈레이트는 피부상피세포에서 활성산소종의 생산을 통해 피부세포의 사멸을 유도하여 피부세포손상을 일으키는 내분비계 교란물질이다라고 요약할 수 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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