[논문]개 유선종양세포에 대한 자연살해세포 독성

정다운; 변정수; 구나연; 정문희; 김은희; 김형석; 조인수; 송재영; 현방훈; 이지현

doi:10.14405/kjvr.2020.60.1.25

[국내논문] 개 유선종양세포에 대한 자연살해세포 독성
Cytotoxicity of natural killer cells on canine mammary carcinoma cells 원문보기

Korean journal of veterinary research = 대한수의학회지, v.60 no.1, 2020년, pp.25 - 32

정다운 (농림축산검역본부 바이러스질병과) , 변정수 (농림축산검역본부 바이러스질병과) , 구나연 (농림축산검역본부 바이러스질병과) , 정문희 (전남대학교 의과대학 법의학교실) , 김은희 (전남대학교 의과대학 법의학교실) , 김형석 (전남대학교 의과대학 법의학교실) , 조인수 (농림축산검역본부 바이러스질병과) , 송재영 (농림축산검역본부 바이러스질병과) , 현방훈 (농림축산검역본부 바이러스질병과) , 이지현 (농림축산검역본부 바이러스질병과)

Abstract ▼ AI-Helper

Natural killer (NK) cells play have a crucial role in the early phase of immune responses against various pathogens. We compared characteristics of canine NK cells against two canine mammary carcinoma cell lines, REM134 and CF41.Mg. REM134 showed higher expression of progesterone receptor, proliferative cell nuclear antigen, Ki67, multiple drug resistance, Bmi-1, c-myc, E-cadherin, and human epidermal growth factor receptor type-2 than that of CF41.Mg. For specific expansion and activation of NK cells, we isolated CD5 negative cells from canine peripheral blood mononuclear cells and co-cultured K562 cells in the presence of interleukin (IL)-2, IL-15, and IL-21 for 21 days. As a result, we found that expression markers of activated NK cells such as NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, CD244, perforin, granzyme B, and tumor necrosis factor alpha were highly upregulated. In addition, we found there was upregulated production of interferon gamma of activated NK cells against target cells such as REM134 and CF41.Mg. Specifically, we observed that cytotoxicity of NK cells against target cells was more sensitively reacted to CF41.Mg than REM134. Based on the results of this study, we recommend the development of an experimental application of CF41Mg, which has not been reported in canine mammary carcinoma research.

Keyword

표/그림 (7)

표 Table 1. Primer sequences
그림 Fig. 1. Morphology of REM134 (A) and CF41.Mg (B) cells.
그림 Fig. 2. Expression of canine mammary carcinoma markers.
그림 Fig. 3. Isolation and expansion of canine NK cells.
그림 Fig. 4. Expression of activated NK cell markers.
그림 Fig. 5. Production of IFN-γ of activated NK cells against target cells.
그림 Fig. 6. Cytotoxic activity of NK cells against target cells.

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구는 서로 다른 바이오마커를 발현하는 개 유선종양 유래 2가지 세포를 대상으로 개 말초혈액으로부터 분리한 CD5 음성 세포를 체외에서 상당량 증폭 및 NK세포로 활성화한 다음, 개 유선종양세포(표적세포)와 공배양하여 표적세포에 대한 NK세포의 독성 및 그 차이를 분석하였으며, 향후 개 유선종양 면역세포 치료 연구에 도움이 되고자 하였다.

제안 방법

건강한 암컷 개(female beagle)의 말초혈액(Genia Inc., Korea) 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)로부터 NK세포들만 선택적으로 배양하고자 PBMCs에서 CD5음성 세포만을 분리하였다. 말초혈액을 PBS와 1:1로 희석하였으며, Ficoll-Paque (GE Healthcare, Sweden)을 사용하여 희석된 말초혈액으로부터 PBMCs를 분리하여 2회 세척하였다.
또한, NK세포만을 선택적으로 증식하기 위해 사람 혈액암 세포주인 K562를 영양세포(feeder cells)로 사용하였다. K562에 방사선 감마선(100 Gy)을 조사하여 세포 분열을 저해한 다음 6 well plate에서 K562 (5 × 10⁵개/well)와 CD5 음성 세포(1 × 10⁶개/well)를 10% FBS (Gibco), 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 500 U/mL human IL-2 (R&D, USA), 10 ng/mL human IL-15 (R&D) 및 5 ng/mL canine IL-21 (R&D)가 첨가된 RPMI, GlutaMAX^TM (Gibco) 배양액에서 7일 간격으로 계대하여 총 21일간 37^oC, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 배양하였다.
분석 세포에서 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 이용하여 RNA를 추출하고 Nano-drop 1000 (Thermo, USA)을 사용하여 RNA 상태와 농도를 측정한 다음, GoScript^TM Reverse Transcriptase (Promega, USA)를 사용하여 cDNA 합성하였다. qPCR은 96 well plate에 LightCycler^® 480 SYBR Green I Master Mix (Roche Diagnostics, USA)를 사용하여 pre-denaturation (95^oC, 10분), annealing (60^oC, 10초), elongation (72^oC, 10초)을 45 cycle 반복한 후 2^−ΔCt 계산법을 이용하여 melting curve를 분석하였으며, β-actin을 reference gene으로 사용하여 qPCR 결과를 분석하였다.
Reverse Transcriptase (Promega, USA)를 사용하여 cDNA 합성하였다. qPCR은 96 well plate에 LightCycler^® 480 SYBR Green I Master Mix (Roche Diagnostics, USA)를 사용하여 pre-denaturation (95^oC, 10분), annealing (60^oC, 10초), elongation (72^oC, 10초)을 45 cycle 반복한 후 2^−ΔCt 계산법을 이용하여 melting curve를 분석하였으며, β-actin을 reference gene으로 사용하여 qPCR 결과를 분석하였다. 사용된 primer의 정보와 조건은 Table 1에 나타내었다.
REM134와 CF41.Mg에서 유선종양 특이 바이오마커들의 발현을 확인하고자 PR, CD133, MDR (multiple drug resistance), Bmi-1, c-myc, E-cadherin, N-cadherin, HER-2, p53, PCNA 및 Ki67의 발현을 분석하였다. 그 결과, CF41.
개 PBMCs로부터 MACS system으로 CD5 음성 세포를 분리하여 유세포 분석을 통해 그 결과를 확인하였다(Fig. 3A and B).
3A and B). 다음으로 개 CD5 음성 세포와 감마선(100 Gy)이 조사된 K562 세포에 IL-2, IL-15 및 IL-21을 첨가하여 21일간 배양하여 NK세포 체외 증식 및 활성화된 NK세포의 수용체 발현을 분석하였다. 그 결과, 최초의 CD5 음성 세포에 비해 21일간 배양을 거친 CD5 음성 세포는 약 100배 이상 세포수가 증식하였으며(Fig.
IFN-γ 생성 증가는 활성화된 NK세포가 표적세포를 인지하여 나타나는 주요한 특징 중 하나이다. CD5 음성 세포를 21일간 NK세포로 활성화하여 특이마커의 현저한 발현을 확인하였으므로 활성화된 NK세포와 표적세포를 24시간 공배양하여 IFN-γ 생성이 증가하는지를 분석하였다. 그 결과, 활성화된 NK세포와 표적세포인 REM134 (181.
NK세포의 표적세포(target cells, T) REM134, CF41.Mg에 대한 세포 독성을 분석하고자 활성화된 NK세포를 작동 세포(effector cells, E)로 활용하여 E:T 비율이 25:1–1.56:1이 되도록 혼합하여 세포 독성을 분석하였다. 그 결과 NK세포는 표적세포인 REM134, CF41.
Fanelli 등은 사람 유방암 17개 조직에서 PR의 발현과 세포 증식 관련성을 조사하였는데, PR을 발현하는 44%가 세포 증식과 관련되어 있고 33%는 관련이 없었으며 22%는 PR을 발현하는 조직에서 오히려 낮은 세포 증식을 나타냈다고 보고하였다[17]. 본 연구에서는 대표적인 개 유선종양세포인 REM134와 CF41.Mg를 이용하여 종양 형성, 증식, 전이 등 관련 특성을 비교하였다. 그 결과, REM134에 비해 CF41.
표적세포인 REM134와 CF41.Mg에 대한 개 NK세포의 활성을 분석하고자 IFN-γ ELISA kit (DY781B, R&D systems, USA)를 이용하여 활성화된 NK세포의 주요한 특징인 IFN-γ의 생성을 분석하였다. REM134, CF41.
Mg에 대한 개 NK세포의 활성을 분석하고자 IFN-γ ELISA kit (DY781B, R&D systems, USA)를 이용하여 활성화된 NK세포의 주요한 특징인 IFN-γ의 생성을 분석하였다. REM134, CF41.Mg와 NK 세포를 1:10 (2 × 10⁵ : 2 × 10⁶) 비율로 RPMI, GlutaMAX^TM(Gibco)에 10% FBS (Gibco), 100 U/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin이 첨가된 세포 배양액으로 37^oC, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 24시간 공배양한 다음, 상층액을 수집하여 IFN-γ의 농도를 측정하였다.
표적세포인 REM134와 CF41.Mg에 대한 개 NK세포의 독성을 분석하고자 lactase dehydrogenase (LDH) 방출을 이용한 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 NK세포의 표적세포에 대한 세포 독성을 분석하였다. NK세포와 표적세포를 25:1, 12.
Mg에 대한 개 NK세포의 독성을 분석하고자 lactase dehydrogenase (LDH) 방출을 이용한 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 NK세포의 표적세포에 대한 세포 독성을 분석하였다. NK세포와 표적세포를 25:1, 12.5:1, 6.25:1, 3.13:1, 1.56:1 비율로 U bottom 96 well plate에 세포를 분주하여 NK세포와 표적세포를 37^oC, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 4시간 공배양한 다음 흡광도 490 nm에서 LDH를 측정하였다.

대상 데이터

개 유선종양세포인 REM134 (ECACC, UK)와 CF41.Mg(ATCC, USA)를 사용하였다. REM134 세포와 CF41.
수집한 세포를 유세포 분석(FACS Cabilur, USA)을 통해 CD5 음성 세포임을 확인하였다. 또한, NK세포만을 선택적으로 증식하기 위해 사람 혈액암 세포주인 K562를 영양세포(feeder cells)로 사용하였다. K562에 방사선 감마선(100 Gy)을 조사하여 세포 분열을 저해한 다음 6 well plate에서 K562 (5 × 10⁵개/well)와 CD5 음성 세포(1 × 10⁶개/well)를 10% FBS (Gibco), 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 500 U/mL human IL-2 (R&D, USA), 10 ng/mL human IL-15 (R&D) 및 5 ng/mL canine IL-21 (R&D)가 첨가된 RPMI, GlutaMAX^TM (Gibco) 배양액에서 7일 간격으로 계대하여 총 21일간 37^oC, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 배양하였다.
개 유선종양세포인 REM134와 CF41.Mg 1 × 10⁶개를 각각 T75 플라스크에 부착하였다. 최초 부착 이후 REM134는 상피세포 형태로 자라는 것을 확인하였고 CF41.

데이터처리

모든 실험 결과는 평균과 표준편차(mean ± SD)로 나타내었으며, 각 실험군의 평균값 비교는 one-way ANOVA(analysis of variance)와 Student’s t-test (JMP^® 6.0; SAS Institute, USA)에 의해 검정하였다.

성능/효과

PBMCs를 대상으로 CD5 (MCA1037PE, BioRad, USA) 항체를 30분간 염색한 다음, anti-PE microbeads(Miltenyi Biotec, USA)로 2차 염색하여 MACS 시스템(Miltenyi Biotec)으로 CD5 항체가 부착되지 않은 세포를 수집하였다. 수집한 세포를 유세포 분석(FACS Cabilur, USA)을 통해 CD5 음성 세포임을 확인하였다. 또한, NK세포만을 선택적으로 증식하기 위해 사람 혈액암 세포주인 K562를 영양세포(feeder cells)로 사용하였다.
Mg 1 × 10⁶개를 각각 T75 플라스크에 부착하였다. 최초 부착 이후 REM134는 상피세포 형태로 자라는 것을 확인하였고 CF41.Mg는 중간엽세포와 유사한 형태로 자라는 것을 확인하였으며, 2가지 세포 모두 3일 후 약 80% confluency에 도달하였다(Fig. 1).
Mg에서 유선종양 특이 바이오마커들의 발현을 확인하고자 PR, CD133, MDR (multiple drug resistance), Bmi-1, c-myc, E-cadherin, N-cadherin, HER-2, p53, PCNA 및 Ki67의 발현을 분석하였다. 그 결과, CF41.Mg은 REM134에 비해 유의적으로 Bmi-1, MDR, cmyc, HER-2, PCNA 및 Ki67의 발현이 낮았고 CD133, N-cadherin의 발현에는 큰 차이가 없었으며, p53과 E-cadherin의 발현은 오히려 유의적으로 높음을 확인하였다(Fig. 2).
다음으로 개 CD5 음성 세포와 감마선(100 Gy)이 조사된 K562 세포에 IL-2, IL-15 및 IL-21을 첨가하여 21일간 배양하여 NK세포 체외 증식 및 활성화된 NK세포의 수용체 발현을 분석하였다. 그 결과, 최초의 CD5 음성 세포에 비해 21일간 배양을 거친 CD5 음성 세포는 약 100배 이상 세포수가 증식하였으며(Fig. 3C), 활성화된 NK세포의 특이마커인 NKp30 (17.
그 결과, 최초의 CD5 음성 세포에 비해 21일간 배양을 거친 CD5 음성 세포는 약 100배 이상 세포수가 증식하였으며(Fig. 3C), 활성화된 NK세포의 특이마커인 NKp30 (17.6 ± 1.4), NKp44 (24.7 ± 2.0), NKp46 (522.9 ± 22.8), NKG2D (63.6 ± 2.2), CD244 (1.3 ± 0.0), perforin (118.6 ± 10.6), granzyme B (229.2 ± 14.6) 및 TNF-α (6.0 ± 0.6)의 발현이 현저하게 증가하였음을 확인하였다(Fig. 4).
CD5 음성 세포를 21일간 NK세포로 활성화하여 특이마커의 현저한 발현을 확인하였으므로 활성화된 NK세포와 표적세포를 24시간 공배양하여 IFN-γ 생성이 증가하는지를 분석하였다. 그 결과, 활성화된 NK세포와 표적세포인 REM134 (181.1 ± 10.0 pg/mL), CF41.Mg (172.6 ± 1.2 pg/mL)와 함께 공배양한 상층액에서 NK세포 단독 배양군(78.9 ± 0.7 pg/mL) 보다 2배 이상 높은 IFN-γ 생성을 확인하였다(Fig. 5).
56:1이 되도록 혼합하여 세포 독성을 분석하였다. 그 결과 NK세포는 표적세포인 REM134, CF41.Mg에서 세포 독성을 나타내었는데, E:T 비율이 25:1인 경우, REM134는 32.9%, CF41.Mg은 68.2%의 세포 독성이 확인되었다. 즉, NK세포의 2가지 표적세포에 대한 세포 독성을 비교한 결과, REM134에 비해 CF41.
2%의 세포 독성이 확인되었다. 즉, NK세포의 2가지 표적세포에 대한 세포 독성을 비교한 결과, REM134에 비해 CF41.Mg에서 현저하게 높은 세포독성이 관찰되었다(Fig. 6).
Mg를 이용하여 종양 형성, 증식, 전이 등 관련 특성을 비교하였다. 그 결과, REM134에 비해 CF41.Mg는 PR 수용체의 발현이 현저히 낮았으며, PCNA 및 Ki67의 발현도 같은 경향을 나타내었다.
Jacobs 등은 myc의 비정상적인 신호에 의해 나타나는 세포주기 조절 유전자인 INK4a/AR의 발현을 Bmi-1가 하향 조절하여 Bmi-1과 c-myc의 협력 작용으로 종양 발생을 유도한다고 보고한 바 있다[20]. 본 연구에서는 REM134와 CF41.Mg를 이용하여 악성 종양 관련 특이마커들의 발현을 비교한 결과, REM134은 CF41.Mg에 비해 MDR, Bmi-1 및 c-myc의 높은 발현을 확인하였다.
Mg에서 E-cadherin의 낮은 발현과 N-cadherin의 높은 발현을 확인하여 전이성이 있다고 보고한 바 있다. 본 연구에서는 REM134와 CF41.Mg를 이용하여 E-cadherin 및 N-cadherin의 발현을 비교한 결과, REM134에 비해 CF41.Mg에서 E-cadherin 발현이 낮음을 확인하였으나, N-cadherin의 발현에서는 큰 차이가 없음을 확인하였다.
Mg는 REM134에 비해 HER-2의 발현이 낮고 p53을 높게 발현하였다. 또한, NK세포의 표적세포에 대한 세포 독성 비교에서도 NK세포에 대하여 CF41.Mg는 REM134에 비해 높은 세포 독성을 나타내어 NK세포에 민감하게 반응함을 확인하였다. 현재 REM134를 이용한 개 유선종양 연구가 다수이나, NK세포에 대한 항암 면역 요법 기초 연구에 있어서 CF41.

후속연구

Mg는 REM134에 비해 높은 세포 독성을 나타내어 NK세포에 민감하게 반응함을 확인하였다. 현재 REM134를 이용한 개 유선종양 연구가 다수이나, NK세포에 대한 항암 면역 요법 기초 연구에 있어서 CF41.Mg 또한 개 유선종양 연구에 유용할 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	NK세포는 무엇인가?	각종 면역세포 중 NK세포는 생체 내 암 발생을 억제하는 최전선의 핵심 면역세포로써 항원특이적인 수용체를 가진 T세포, B세포와 달리 다양한 선천면역 수용체를 세포 표면에 발현하고 이들을 통해 정상세포와 암세포를 구분하며, 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme B)을 분비하여 즉각적으로 암세포를 사멸하는 특징을 가진다. 이러한 NK세포는 암의 발생, 전이, 재발에 중요한 역할을 하는 암줄기세포(cancer stem cells)를 효과적으로 제거할 수 있어 항암 면역요법에서 많은 장점을 갖고 있다.
	바이오마커의 사용이 중요한 이유는?	사람에서 유방암을 진단하는 대표적 바이오마커로는 estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), human epidermal growth factor receptor type-2 (HER-2) 등이 있으며, 유방암의 약 70% 정도는 암세포 성장 촉진에 이러한 호르몬들이 영향을 미친다고 알려져 있다[1]. 개의 유선종양에서는 이러한 호르몬 수용체뿐만 아니라 proliferative cell nuclear antigen (PCNA), tumor suppressor protein p53(p53), E-cadherin, endothelial growth factor 및 암줄기세포 특이마커 등이 알려져 있으며, 이러한 마커들은 종양의 악성도에 따라 다른 발현을 나타내므로 항암 면역요법에 대한 반응은 유선종양과 관련된 특이마커에 따라 다르게 결정될 수 있다[12]. 이러한 바이오마커는 특정 치료에 대한 잠재적인 반응을 결정하는 데에 유용한 정보를 제공하고 성공적인 치료 전략을 위해 중요하게 사용된다[13].
	NK세포의 장점은?	각종 면역세포 중 NK세포는 생체 내 암 발생을 억제하는 최전선의 핵심 면역세포로써 항원특이적인 수용체를 가진 T세포, B세포와 달리 다양한 선천면역 수용체를 세포 표면에 발현하고 이들을 통해 정상세포와 암세포를 구분하며, 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme B)을 분비하여 즉각적으로 암세포를 사멸하는 특징을 가진다. 이러한 NK세포는 암의 발생, 전이, 재발에 중요한 역할을 하는 암줄기세포(cancer stem cells)를 효과적으로 제거할 수 있어 항암 면역요법에서 많은 장점을 갖고 있다. 다양한 암 환자에서 NK세포의 기능 결함이 보고되고 있으며, 이 기능 결함의 정도가 향후 임상에서의 예후와 밀접한 상관관계가 있다는 것이 보고되었다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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