[논문]유기인 계열 독성물질 분해를 위한 바이오스캐빈저 최신 연구 동향

김희정; 정근홍; 계영식

doi:10.14478/ace.2020.1017

유기인 계열 독성물질 분해를 위한 바이오스캐빈저 최신 연구 동향
Recent Trend in Bioscavengers for Inactivation of Toxic Organophosphorus Compounds 원문보기

공업화학 = Applied chemistry for engineering, v.31 no.2, 2020년, pp.125 - 137

김희정 (육군사관학교 물리화학과) , 정근홍 (육군사관학교 물리화학과) , 계영식 (육군사관학교 물리화학과)

초록
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최근 몇 년간 유기인 계열 독성물질이 민간인을 대상으로 사용되어 전 세계적으로 큰 위협이 되고 있다. 독성물질에 대한 예방이 불가능한 현 치료대책 대신, 보다 개선된 치료 대책으로서의 바이오스캐빈저에 대한 연구가 활발히 진행됐다. 바이오스캐빈저는 유기인 계열 독성물질이 인체 내 표적 기관에 도달하기 전, 독성물질 자체를 비활성 상태로 전환하거나 독성물질과 기질 간의 결합을 차단함으로써 중독을 예방하는 단백질 및 효소를 일컫는다. 특히 독성물질을 분해하는 과정에서 활성 상태를 유지함으로써 적은 양의 단백질로도 독성물질의 중독을 빠르게 치료하는 촉매성 바이오스캐빈저 개발에 많은 노력이 투여되어 왔다. 본 리뷰에서는 촉매성 바이오스캐빈저 개발을 위해 분자진화 및 단백질 공학 기술을 적용한 최신 연구들에 대해 소개하고, 끝으로 이러한 효소들을 임상적으로 승인된 약으로 개발하기 위해 남은 몇 가지 과제들을 간단히 제시할 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

In recent years, toxic organophosphorus compounds (OPs) have been used for civilians, becoming a great threat to the world. Alternative to the current treatment policy unpredictable for any prevention, researches on bioscavenger as an improved treatment have been actively conducted. Bioscavengers refer to proteins and enzymes that prevent intoxication by inactivating or binding toxic OPs before they reaches the target. In particular, extensive efforts have been made to develop catalytic bioscavengers that quickly detoxify OPs even with a small dose of the protein by performing multiple binding and hydrolysis processes with OPs. This review introduces the latest studies and results for developing catalytic bioscavengers using molecular evolution and protein engineering techniques. We will briefly present some of the remaining challenges on developing enzymes into clinically approved drugs.

주제어

표/그림 (7)

그림 Figure 1. Structures and names of representative toxic organophosphorus chemicals.
그림 Figure 2. Representative medical organic materials for inactivating toxic organophosphorus chemicals.
그림 Figure 3. Classification of catalytic bioscavenger candidates.
그림 Figure 4. Comparison between stoichiometric and catalytic bioscavengers upon their detoxifying mechanism of organophosphorus compounds.
표 Table 1. Catalytic Bioscavengers and Their Strategy for Improvement of Hydrolysis Efficiency on Toxic Organophosphorus Chemicals
표 Table 2. Recent Research Trend on Catalytic Bioscavenger as a Post Prevention and Treatment on Toxic Organophosphorus Chemicals[131]
표 Table 3. Bioscavengers Catalytic Efficiency of Wild Type and the Most Improved Variants[131]

AI 본문요약
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문제 정의

소만에 대해서는 Y337A/F338A-HuAChE 돌연변이가 가장 높은 가수분해 효율을 보였으며, 이를 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol,PEG)로 전처리(PEGylated)하고 HI-6 옥심으로 후처리 한 경우, 쥐는 고용량의 소만에 의한 2번의 순차적 중독에서도 생존하는 것으로 나타났다[42-44]. Y337A/F338A-HuAChE 돌연변이를 다수의 독성물질에 대해서도 효율을 높이기 위해 타분을 활용하여 추가 연구하였고,이 연구에서는 재활성제로서 가장 적합한 옥심을 선별해내는 실험이 시도되었다. 시험된 새로운 옥심 중에는 2-PAM보다 긴 알킬 사슬(alkyl chain)을 갖고 있는 hexyl 2-PAM이 재활성제로 사용되었을 경우, Y337A/F338A-HuAChE가 타분에 대해 높은 효율을 가질 수 있었다[45].
정제된 PTE는 소만 및 사이클로 사린 가수분해의 경우 중간 정도의 효율을 보였지만[84] VX에 대해서는 효율이 훨씬 낮았으며[85], 파라옥손에 대한 가수분해 효율과 비교했을 때에도 작용제에 대한 가수분해 효율은 현저히 낮은 수준이었다(Table 3)[83]. 따라서 PTE를 기반으로 한 효율적이고 넓은 스펙트럼을 갖는 촉매성 바이오스캐빈저를 개발하기 위해 유도 진화 및 전산 설계 방법의 적용이 필요했다.
DFPase는 비포유류 단백질이기 때문에 포유동물의 면역원성으로 인해 혈액 내에서 제거될 확률이 높다. 따라서 혈액 내 단백질 반감기 시간을 늘리기 위한 방법으로 비활성 폴리머로 단백질을 변형시켜 면역원성 감소, 단백질 분해와 세포독성으로부터의 보호, 분자량 증가로 신장에서의 제거율 감소 등의 효과를 얻고자 했다[102,103]. 이 모든 과정을 거쳐 만들어진 PEGylated DFPase 변이체를 3 × LD₅₀ 용량의 소만에 노출시키기 5 min 전 쥐에 투여한 결과, 무처리의 대조군은 중독 후 15 min 내에 사망한 반면 PEGylated DFPase 변이체를 주사한 쥐는 중독 후 24 h가 경과한 이후에도 생존하였다(Table 2)[103].
따라서 독성물질에 대한 천연 효소의 활성 및 선택성을 모두 향상시킴으로써 효과적인 치료물질로 사용될 수 있는 촉매성 바이오스캐빈저를 개발하기 위해 분자 진화(molecular evolution)와 단백질 공학 기술(protein engineering techniques)이 사용되어 왔다[21]. 우리는 여기서 촉매성 바이오스캐빈저의 후보 단백질들과, 그 단백질들의 활동 및 독성물질 가수분해 기능을 높이기 위해 개발하고 있는 단백질 효소에 대해서 논의하고자 한다.
사람, 박테리아, 해조류 등으로부터 발견된 천연 유기인산 가수분해효소들은 인공 제노바이오틱(xenobiotic) 독성물질에 대해서는 높은 촉매 효율을 나타내지 않을 것이라는 인식이 확대된 가운데, 유도 진화(directed evolution) 및 전산 설계 방법(computational design)의 진보는 이러한 천연 효소들을 재설계함으로써 그 촉매 효율을 상당히 향상시키는 데 많은 기여를 해오고 있다. 이번 장에서는 천연 효소들을 어떻게 재설계하였고, 또 그로 인해 어느 정도의 촉매 효율 향상이 이루어졌는지에 대하여 다뤄보겠다.

제안 방법

cuprina로부터 추출한 E3 CaE의 G137D 돌연변이체로부터 아이디어를 얻어[28] hCE1의 활성부위에서 2개의 아미노산을 치환함으로써 얻은 돌연변이체이고, 두 번째는 Bacillus subtilis로부터 얻은 p-nitrobenzylesterase (pNBE)의 돌연변이체를 hCE1로 치환하여 재활성화 속도를 높이려고 노력했다. 먼저, hCE1의 2개의 활성 아미노산 부위를 치환하는데 있어 물 분자를 유기인 화합물이 결합하는 Ser221 잔기 주변에 위치시킴으로써 활성 부위의 재활성화 촉진을 시도했다. V146H/L363E hCE1 돌연변이체의 경우 활성 부위 포켓의 반대편에 있는 2개의 소수성 잔기가 하전된 상태로 대체됨으로써 독성물질에 대한 친화성을 감소시키지 않으면서 효소의 재활성화 속도를 증가시킬 수 있었다[29].
사후 치료제로서의 효용성을 확인하기 위해 파라티온(parathion)과 파라옥손 살충제를 효율적으로 가수분해하는 rePON1 변이체를 사용해 실험하였다. 이 연구에서는 2 mg/kg 용량에서 중독된 지 1 min이지난 쥐의 경우에도 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미나제(glutamate-oxaloacetate transaminase, GOT) 효소가 개선된 rePON1 변이체와 함께 투여될 경우 1.
BChE의 자발적 재활성화 속도를 증가시키기 위해 여러 돌연변이체를 설계했는데, 그중 하나인 BChE-G117H는 wt BChE보다 사린 및 VX에 대해 각각 1,000배 및 7,900배 정도 저항력이 강했고, 탈인산화 속도(dephosphorylation rates)는 각각 100 및 2,000배 더 높았다[32]. 이 연구에서는 BChE의 재활성화 속도를 높이기 위해 노화에 주역할을 하는 Glu197을 돌연변이 시킴으로써 전하를 제거했다. 실제로, 단일 G117H 돌연변이체와는 달리, 2중 돌연변이체 BChE-G117H/E197Q는 소만에 의한 억제 후 촉매 활성을 자발적으로 재생시킬 수 있었다.
이러한 한계를 극복하기 위해 두 가지의 방식으로 돌연변이체(mutatns)를 설계하였는데, 첫 번째는 L. cuprina로부터 추출한 E3 CaE의 G137D 돌연변이체로부터 아이디어를 얻어[28] hCE1의 활성부위에서 2개의 아미노산을 치환함으로써 얻은 돌연변이체이고, 두 번째는 Bacillus subtilis로부터 얻은 p-nitrobenzylesterase (pNBE)의 돌연변이체를 hCE1로 치환하여 재활성화 속도를 높이려고 노력했다. 먼저, hCE1의 2개의 활성 아미노산 부위를 치환하는데 있어 물 분자를 유기인 화합물이 결합하는 Ser221 잔기 주변에 위치시킴으로써 활성 부위의 재활성화 촉진을 시도했다.
두 번째로는 Bacillus subtilis의 hCE1의 구조적 동족체(structural homolog)인 pNBE를 사용하여 돌연변이체를 생성하였는데, pNBE는 박테리아 세포에서 조작 및 발현하기 쉬운 박테리아 효소라는 점에서 HuAChE, HuBChE, hCE1와는 차별화된다[30]. 자발적으로 재활성화를 촉진하도록 설계된 돌연변이(A107H)에 pNBE의 활성 세린 인근 5개의 잔기를 표적화 및 치환함으로써 다수의 pNBE 돌연변이체를 생성하였다[31]. 소만에 대해 재활성화 속도를 4,000배가량 개선시킨 pNBE 돌연변이체(A107H/A190C)를 식별했으나, hCE1로 해당 돌연변이체를 치환하였을 때에는 동일한 효과를 얻지 못했다.
따라서 최근 10여 년간, 적은 양의 단백질만으로 많은 양의 유기인산 독성물질을 효과적으로 예방할 수 있는 촉매성 바이오스캐빈저가 차세대 대책으로서 제시되어 왔다[4]. 촉매성 바이오스캐빈저의 후보로는 크게 B-에스테라제 계열의 화학량론적 바이오스캐빈저(stoichiometric bioscavengers)를 촉매성으로 전환한 형태의 단백질들과 천연 유기인산 가수분해 효소들이 있으며, 각각의 후보군의 특성과 촉매성 바이오스캐빈저로서의 효율성을 논의해보고자 한다(Figure 3).
화학량론적 바이오스캐빈저 중에서도 B-에스테라제는 유기인 계열 독성물질과의 결합력이 우수하고 가수분해 효율이 높으면서도 활성 능력을 잘 유지한다. 카르복실 에스테라제(CaE), 아세틸콜린 에스테라제(AChE), 부티릴콜린 에스테라제(BChE)가 B-에스테라제의 대표 효소들이며, 각각의 변이체 생산 및 단백질 공학 기술을 적용하여 촉매성 바이오스캐빈저로의 전환을 시도하였다.

이론/모형

OPAA의 VX에 대한 가수분해 효율을 높이기 위한 방법으로 부위 특이적 돌연변이 방법이 사용되었다. 개선된 OPAA 3중 돌연변이체는 VX의 저독성 이성질체에 대해 촉매 효율이 36배까지 개선되었다(Table 3)[111].
이에 향상된 유기인 화합물 가수분해 능력을 갖추고 동시에 인체 내 효과적으로 발현될 수 있는 HuPON1을 얻기 위해 유도 진화 및 전산 설계 방법이 사용되었다. 유도 진화 및 전산 설계 방법은 유전자 조작(유전자 돌연변이 유발과 같은), 단백질 변이체(variants)의 발현 및 변이체들의 촉매 효율에 대한 검사의 단계로 진행된다.

성능/효과

1.2 ×LC50의 사린 또는 소만에 중독 시킨 기니피그에 사람 및 토끼의 PON1, 또는 기타 포유동물의 PON1를 재조합한 효소를 정제하여 투여하였을 때 기니피그의 생존 및 회복율이 크게 향상되는 것이 실험을 통해 확인되었다(Table 2)[61,62].
2 × LD50 용량의 사이클로 사린 유사(Sp-CMP-coumarin) 독성물질로 쥐를 중독 시키기 1 h 전, 저용량(1.1 mg/kg)의 정제된 4E9를 예방 차원에서 투여했을 때, 증상이 최소화되고 생존율을 50%까지 증진시킬 수 있었다.
PTE보다 20개의 아미노산을 더 보유하면서 아미노산 서열에 있어 는 PTE와 90%의 동일성을 갖는 OpdA (organophosphate-degrading enzyme from Agrobacterium)는 호주의 Agrobacterium radiobacter P230 이라는 토양 박테리아 균주로부터 분리되었다(Table 1)[93]. PTE와 유사하게 OpdA도 소만과 사이클로 사린의 독성 이성질체에 대해서는 적당한 효율로 가수분해가 가능했으나, V계열 유기인 독성물질에 대해서는 덜 효율적이었다. OpdA (0.
OPAA의 VX에 대한 가수분해 효율을 높이기 위한 방법으로 부위 특이적 돌연변이 방법이 사용되었다. 개선된 OPAA 3중 돌연변이체는 VX의 저독성 이성질체에 대해 촉매 효율이 36배까지 개선되었다(Table 3)[111]. 독성이 더 높은 VX의 이성질체를 가수분해할 수 있도록 추가적인 돌연변이 설계를 통해 만들어진 OPAA 4중 돌연변이체는 그 촉매 효율이 16배 정도밖에 개선되지 못했지만, 두 가지 이성질체를 모두 가수분해할 수 있다는 데 의의가 크다.
결과적으로 다수의 효소(PON1, PTE, DFPase)가 V계열 유기인 독성물질을 고효율(kcat/KM > 1 × 107M-1min-1)로 가수분해할 수 있도록 개선하는 데 성공하였다.
V146H/L363E hCE1 돌연변이체의 경우 활성 부위 포켓의 반대편에 있는 2개의 소수성 잔기가 하전된 상태로 대체됨으로써 독성물질에 대한 친화성을 감소시키지 않으면서 효소의 재활성화 속도를 증가시킬 수 있었다[29]. 결과적으로, V146H/L363E hCE1는 wild type (wt) hCE1에 비해 사린, 소만, 사이클로 사린에 노출 후 재활성화 속도가 각각 5, 20, 33,000배까지 증가하였고, 반감기 시간(half-time)은 각각 9.5, 11.5 및 1.2 h로 감소하였다[29]. 하지만, 효과적인 촉매성 바이오스캐빈저로 활용되기 위해서는 재활성화 속도를 약 1,000배 이상 높여야 했기 때문에 여전히 한계에 부딪쳤다.
결론적으로 OPAA는 유기인산 독성물질(소만, GP)을 가수분해할 때 촉매 효율이 매우 높을 수 있지만 저독성 이성질체에 대한 선호도 또한 높을 수 있다. OPAA의 촉매 효율을 개선하기 위한 앞으로의 연구방향은 독성물질의 이성질체를 선호하고 가수분해 할 수 있는 개선 변이체를 선별하는 것이 될 것이다.
결론적으로, 앞서 언급된 에스테라제들은 독성물질과의 결합력이 우수하며, 독성물질을 1차적으로 방어하는 이상적인 생리학적 위치를 갖는 내인성(endogenous) 단백질이다. 단백질 공학 기술 및 부위-지정 돌연변이 유발 방법을 통해 반감기를 늘리는 데에는 어느 정도 성과를 거두었으나, 이들 단백질의 변이체를 자체적으로 또는 화학적 재활성화제와 조합하여 높은 촉매 효율 속도(k_cat/K_M ≥ 1 × 10⁷M^-1min^-1)로 독성물질을 가수분해시키는 데는 아직 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.
15 mg/kg)는 3 × LD₅₀ 용량의 다이클로로보스(dichlorovos), 에틸파라티온(ethyl parathion), 메틸파라티온(methyl parathion)과 같은 살충제와의 실험에서 살충제 가수분해에 높은 촉매 효율을 보였다[94]. 다이클로로보스에 중독 시킨 쥐의 경우 중독 직후 OpdA를 투여 시 24 h가 경과한 시점에서도 100%의 생존율을 보였고, 에틸파라티온의 경우에는 중독 직후나 10 min 후 OpdA를 투여해도 생존에 큰 영향을 미치지 않았다. 하지만 중독 후 45, 90min이 지났을 때 반복하여 OpdA를 투여한 결과, 24 h가 경과한 시점에서 62.
유도 진화 및 전산 설계 방법을 통해 보다 효율이 개선된 PTE 변이체(10-1-D11, Table 3)를 얻을 수 있었고, 사후치료제로 활용 시 에도 생존 및 회복을 촉진하는데 이 변이체가 성공적으로 사용되었다. 또한, PTE 변이체를 유기인산 독성물질에 중독된 기니피그에 투여하기 위해 골내 주사(intradermal injection)의 방식을 채택한 결과, VX에 의한 사망 및 전신 독성을 예방하고 혈액에서 VX의 농도를 급격히 감소시키며 뇌의 AChE 활성을 부분적으로 보존할 수 있음이 확인되었다. 이는 독성물질에 중독 시 가장 안전하고 신속하게 혈액 내로 치료물질의 투여가 가능하게 함으로써, PTE 변이체의 사후 치료제로서의 활용성에 대한 기대감을 높여주었다[92].
또한, 고용량의 BChE의 사용은 비용 면에서 부담이 크기 때문에 BChE의 대량 생산에 초점을 두고 재조합 BChE를 생산했지만, 이는 wt BChE와 비교했을 때 혈장 반감기가 훨씬 짧았다. 반감기 연장을 위한 노력으로 재조합 BChE를 AChE와 마찬가지로 PEGylated 하였더니 기니피그에 2 × LD50의 소만을 주사한 후 2 h가 지난 뒤에 72mg/kg의 PEGylated 재조합 BChE를 투여한 경우 최소한의 중독 징후 및 생존율 100%의 효과를 거둘 수 있었다.
반감기 연장을 위한 노력으로 재조합 BChE를 AChE와 마찬가지로 PEGylated 하였더니 기니피그에 2 × LD50의 소만을 주사한 후 2 h가 지난 뒤에 72mg/kg의 PEGylated 재조합 BChE를 투여한 경우 최소한의 중독 징후 및 생존율 100%의 효과를 거둘 수 있었다.
3 × LD₅₀ 용량의 파라옥손이나 5 × LD₅₀의 용량의 사린, 소만, 사이클로 사린 또는 타분을 4회 반복 투여한 경우에도 완벽하게 보호되었다[76]. 발현된 rePON1 변이체는 wt PON1과 같이 감염된 동물의 혈액에서 HDL과 관련이 있는 것으로 밝혀졌으며, 혈장에서 6~7 day 동안 고농도(최대 4.1 mg/mL)로 유지되었다.
이 모든 과정을 거쳐 만들어진 PEGylated DFPase 변이체를 3 × LD₅₀ 용량의 소만에 노출시키기 5 min 전 쥐에 투여한 결과, 무처리의 대조군은 중독 후 15 min 내에 사망한 반면 PEGylated DFPase 변이체를 주사한 쥐는 중독 후 24 h가 경과한 이후에도 생존하였다(Table 2)[103]. 본연구에서 실험된 DFPase 돌연변이체는 사린 및 사이클로 사린의 독성 이성질체에 대해 높은 촉매 효율을 보이며 촉매성 바이오스캐빈저로서 잠재력이 충분함을 입증했다.
아데노바이러스 발현 벡터를 활용하여 reHuProlidase가 DFP 또는 유기인산 독성물질에 의한 중독으로부터 쥐를 어느 정도 보호할 수 있는지 확인하는 실험에서, 이 유전자는 쥐의 체내에서 높은 수준으로 발현되고 프롤리다아제의 혈액 내 양도 100~150배 증가되었음에도, 1 × LD50 용량의 DFP에 두 번 누적 노출된 쥐의 경우 사망시간이 겨우 4~8 h 정도 지연되었을 뿐이었다.
아데노바이러스(adenovirus)를 통한 HuPON1의 발현은 클로르피리포스 옥손 및 다이아족손에 의한 중독을 예방하고[71,73-75] 뇌 전체의 AChE 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 유도 진화된 rePON1 변이체 (VII-D11, I-F11)를 아데노바이러스 벡터로 클로닝(cloning) 한 후 쥐에 투여하였을 때, 해당 쥐는 6.
유도 진화 및 전산 설계 방법은 유전자 조작(유전자 돌연변이 유발과 같은), 단백질 변이체(variants)의 발현 및 변이체들의 촉매 효율에 대한 검사의 단계로 진행된다. 위의 방법을 통해 네 종류의 포유동물 PON1 유전자의 유전자 셔플링(gene-shuffling)후 재조합 PON1 변이체를 선별함으로써 HuPON1의 수율을 높일 수 있었다. 이렇게 생성된 단백질(rePON1)은 대장균에서 높은 수율로 발현되었고 HuPON1과는 유사한 촉매 특성을 나타냈다[64,65].
이렇게 생성된 단백질(rePON1)은 대장균에서 높은 수율로 발현되었고 HuPON1과는 유사한 촉매 특성을 나타냈다[64,65]. 유도 진화 및 전산 설계 방법으로 여러 차례의 돌연변이 및 스크리닝 작업을 거쳐, rePON1에 비해 사이클로 사린 가수분해 능력이 135배 개선된 rePON1 변이체(4E9)를 얻을 수 있었다(Table 3)[66]. 2 × LD₅₀ 용량의 사이클로 사린 유사(Sp-CMP-coumarin) 독성물질로 쥐를 중독 시키기 1 h 전, 저용량(1.
PTE가 현재까지 발견된 가장 효율적이고 자연적인 유기인산 가수분해 효소이긴 하지만 효과적인 촉매성 바이오스캐빈저 역할을 수행하기 위해서는 유기인산 독성물질과의 가수분해 활성을 증가시켜야 했다. 유도 진화 및 전산 설계 방법을 통해 보다 효율이 개선된 PTE 변이체(10-1-D11, Table 3)를 얻을 수 있었고, 사후치료제로 활용 시 에도 생존 및 회복을 촉진하는데 이 변이체가 성공적으로 사용되었다. 또한, PTE 변이체를 유기인산 독성물질에 중독된 기니피그에 투여하기 위해 골내 주사(intradermal injection)의 방식을 채택한 결과, VX에 의한 사망 및 전신 독성을 예방하고 혈액에서 VX의 농도를 급격히 감소시키며 뇌의 AChE 활성을 부분적으로 보존할 수 있음이 확인되었다.
이 연구에서는 2 mg/kg 용량에서 중독된 지 1 min이지난 쥐의 경우에도 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미나제(glutamate-oxaloacetate transaminase, GOT) 효소가 개선된 rePON1 변이체와 함께 투여될 경우 1.4 × LD50 용량의 파라옥손에서도 생존할 수 있음을 확인하였다[69].
동일하게 아데노바이러스 발현 벡터로 감염시킨 쥐에서 mouse BChE를 발현시킨 경우는 대조군에 비해 500~1,500배가량 높은 수준으로 BChE가 발현되었으며, 해당 쥐는 사린, 소만 및 사이클로 사린과의 동일한 실험에서 24 h 동안 생존할 수 있었다[117]. 이는 아데노바이러스 발현 벡터로 감염시킨 쥐의 혈중 reHuProlidase의 농도가 대조군에 비해 30배 정도밖에 높지 않았다는 점에 비추어보았을 때, 발현된 reHuProlidase의 혈중 농도가 독성물질로부터 쥐를 보호하기에는 역부족이었을 것이라는 결론을 내렸다. 또한 prolidase는 유기인 화합물에 대한 촉매 효율이 낮기 때문에 쥐의 생존 결과에서 BChE의 경우와 차이가 있었던 것으로 보인다.
결과적으로 다수의 효소(PON1, PTE, DFPase)가 V계열 유기인 독성물질을 고효율(k_cat/K_M > 1 × 10⁷M^-1min^-1)로 가수분해할 수 있도록 개선하는 데 성공하였다. 이론으로만 제시되었던 촉매성 바이오스캐빈저의 활용모델을 다양한 효소, 유기인산화합물 및 동물에 적용하여 그 일반성을 입증하였으며, 독성물질에 대한 예방 대책으로서 필요한 촉매성 바이오스캐빈저의 용량 또한 신뢰성을 가지게 되었다.
2 ×LC₅₀의 사린 또는 소만에 중독 시킨 기니피그에 사람 및 토끼의 PON1, 또는 기타 포유동물의 PON1를 재조합한 효소를 정제하여 투여하였을 때 기니피그의 생존 및 회복율이 크게 향상되는 것이 실험을 통해 확인되었다(Table 2)[61,62]. 정제된 PON1을 독성물질 중독 이전에 투여 시 생존율이 20%에서 75%까지 향상되었으며 중독 이후에도 혈액 및 뇌에서의 AChE 활동을 보호할 수 있었다. 그러나 더 높은 용량(2× LD₅₀)의 사린, 소만, 사이클로 사린 또는 타분에 노출된 기니피그의 경우에는 재조합 PON1의 양을 늘려도 예방적인 치료의 효과가 없었다.
PTE는 유기인산 화합물과 대체로 높은 촉매 효율을 가짐에도 불구하고, 유기인산 계열의 작용제에 대해서는 그 효율이 낮다는 조사가 있다. 정제된 PTE는 소만 및 사이클로 사린 가수분해의 경우 중간 정도의 효율을 보였지만[84] VX에 대해서는 효율이 훨씬 낮았으며[85], 파라옥손에 대한 가수분해 효율과 비교했을 때에도 작용제에 대한 가수분해 효율은 현저히 낮은 수준이었다(Table 3)[83]. 따라서 PTE를 기반으로 한 효율적이고 넓은 스펙트럼을 갖는 촉매성 바이오스캐빈저를 개발하기 위해 유도 진화 및 전산 설계 방법의 적용이 필요했다.
다이클로로보스에 중독 시킨 쥐의 경우 중독 직후 OpdA를 투여 시 24 h가 경과한 시점에서도 100%의 생존율을 보였고, 에틸파라티온의 경우에는 중독 직후나 10 min 후 OpdA를 투여해도 생존에 큰 영향을 미치지 않았다. 하지만 중독 후 45, 90min이 지났을 때 반복하여 OpdA를 투여한 결과, 24 h가 경과한 시점에서 62.5%의 생존율을 보였다.

후속연구

결론적으로 OPAA는 유기인산 독성물질(소만, GP)을 가수분해할 때 촉매 효율이 매우 높을 수 있지만 저독성 이성질체에 대한 선호도 또한 높을 수 있다. OPAA의 촉매 효율을 개선하기 위한 앞으로의 연구방향은 독성물질의 이성질체를 선호하고 가수분해 할 수 있는 개선 변이체를 선별하는 것이 될 것이다.
높은 촉매 효율, 생체 내 적절한 농도, 유기인산 독성물질에 노출된 후의 생존율 등 효과적인 바이오스캐빈저로서 갖추어야 할 구비조건들에 있어, HuPON1 자체로서는 충분히 그 조건들을 충족시키지 못했다[18,63,77,78]. 그러나 유도 진화 및 전산 설계 방법을 거쳐 얻어진 rePON1의 변이체는 HuPON1의 한계를 극복하고 G계열 유기인 독성물질에 대한 촉매성 바이오스캐빈저로서 좋은 후보가 될 수 있을 것이다.
단백질 공학 기술 및 부위-지정 돌연변이 유발 방법을 통해 반감기를 늘리는 데에는 어느 정도 성과를 거두었으나, 이들 단백질의 변이체를 자체적으로 또는 화학적 재활성화제와 조합하여 높은 촉매 효율 속도(kcat/KM ≥ 1 × 107M-1min-1)로 독성물질을 가수분해시키는 데는 아직 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.
이렇게 옥심과 결합된 AChE는 일부 독성물질에 최적화된 촉매성바이오스캐빈저로서 치료물질을 추가적으로 개발하는 데 발판을 마련해주었다. 그러나 이러한 종류의 치료는 여전히 고용량의 바이오스캐빈저를 사용해야 한다는 점과 특정 옥심-AChE 돌연변이체 조합에 의존한다는 점에서 한계가 있다.
SMP30은 사린, 소만, 타분, DFP 순으로 가수분해가 효율적이며, 소만의 경우에는 4가지 이성질체를 동일한 속도(~2 × 10⁴M^-1min^-1)로 가수분해하는 것으로 보고되었다[105,106]. 재조합 HuSMP30을 대장균에서 발현시키는 데 성공함으로써[107], SMP30를 활용하여 보다 효율적인 촉매성 바이오스캐빈저를 개발하기 위한 유도 진화 및 전산 설계에 박차를 가할 수 있을 것이라 전망된다.
단백질 기반 약물의 여러 가지 제약에도 불구하고, 지난 40여 년 동안 PEG와 같은 중합체를 통한 단백질의 화학적 변형, 단백질 공학 기술 적용 등의 노력을 통하여 단백질 약물을 다양한 질병 치료제로서 활용해 왔다[122]. 촉매성 바이오스캐빈저 또한, 이러한 전략을 바탕으로 충분히 차기 치료물질로 발전시킬 수 있을 것이라 전망된다.
하지만, 아직 촉매성 바이오스캐빈저가 상용화되기 위해 해결해야 할 많은 과제들이 남아 있다. 촉매성 바이오스캐빈저를 진정한 치료물질로 채택하기 위해서는, 앞서 언급한 바와 같이 단백질 약물이 가질 수 있는 면역원성, 약동학 및 약력학적 특성, 교차 반응성, 안정성, 생산, 저장 및 전달 등 다양한 미결과제들을 하나씩 풀어나가야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	OPs란 무엇인가?	최근 영국의 노비촉(Novichok) 및 말레이시아 공항의 VX 테러 사건에서 보았듯이 독성물질 피독 시 초기 처치는 매우 중요한 과정이다. 두 사건에서 쓰인 독성물질은 유기인 화합물(organophosphorus coumpounds, OPs)이라는 큰 범주에 포함되는데, OPs는 인과 탄소가 결합되어 있는 화합물로 농약, 비료, 화학작용제 등 그 쓰임이 다양하다. 최초 살충제나 제초제로 널리 사용되던 OPs는 그 강한 독성으로 인해 화학작용제로 합성 및 무기화되었으며, 사린(sarin, GB), 소만(soman, GD), 사이클로 사린(cyclosarin, GF), 타분(tabun, GA), VX, 노비촉 등이 이에 포함된다(Figure 1).
	기존에 사용되었던 유기인산 독성물질 중독 치료제의 한계는 무엇인가?	이를 초기에 또한 적시에 적용한다면, 치사율을 줄일 수 있고 중독 증상을 완화할 수 있다. 하지만 앞서 언급한 치료물질들은 사후 조치에 해당하는 치료제이기 때문에 회복 이후에도 의식손실이나 영구적인 뇌의 손상을 야기하는 콜린성 위기(cholinergic crisis)를 예방하는 데는 한계가 있다[2]. 또한 현재까지 개발된 치료법들은 유기인산 독성물질 중독 이전에 적용할 경우에 중추신경계 손상, 혈압 및 심박수 증가 등과 같은 심각한 부작용을 야기하기 때문에 중독되기 전 예방 대책으로는 적합하지 않다[3].
	AChE의 특징은 무엇인가?	통상적으로 촉매성 세린으로부터 억제제가 자발적으로 분리되는 속도는 효소 및 유기인 화합물의 유형에 따라 다르지만, 유기인산 독성물질과 상호작용하는 B-에스테라제의 경우는 일반적으로 그 속도가 매우 느리기 때문에 외부 친핵체(옥심 재활성화제)가 필요한 것이다[10,11]. 유사촉매 바이오스캐빈저의 경우, 그 구성성분이 통상 혈액 내에 존재하며(인간혈청의 BChE 및 적혈구의 AChE), AChE는 모든 유형의 유기인산 독성물질을 신속하게 유리시킨다는 장점을 갖고 있다[12]. 뿐만 아니라, 옥심이 말초 신경 조직 및 일부의 경우 중추신경계에까지 도달하여 억제된 AChE을 다시 활성화 할 수 있다는 점 또한 큰 장점이다[13-15].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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