[논문]Fenbendazole의 항암활성에서 활성산소종의 관련성

한용; 주홍구

doi:10.14405/kjvr.2020.60.2.79

[국내논문] Fenbendazole의 항암활성에서 활성산소종의 관련성
Involvement of reactive oxygen species in the anti-cancer activity of fenbendazole, a benzimidazole anthelmintic 원문보기

Korean journal of veterinary research = 대한수의학회지, v.60 no.2, 2020년, pp.79 - 83

한용 (제주대학교 수의과대학 수의약리학실) , 주홍구 (제주대학교 수의과대학 수의약리학실)

Abstract ▼ AI-Helper

Fenbendazole (FBZ) is a benzimidazole anthelmintic that has been widely used in treatments for gastrointestinal parasites including pinworms and roundworms in animals. Recently, some studies demonstrated that FBZ has anti-cancer effects related to disruption of microtubule polymerization. In this study, we investigated whether FBZ has anti-cancer activity in HL-60 cells, a human leukemia cell line, and assessed its relationship with the production of reactive oxygen species (ROS). FBZ treatment at 0.25-1 μM significantly decreased the metabolic activity of HL-60 cells. The mitochondrial membrane potential of FBZ-treated HL-60 cells decreased in a concentration-dependent manner. Apoptosis analysis using annexin V-FITC/propidium iodide staining demonstrated that 1 μM FBZ increased the percentages of cells in apoptosis and necrosis. In addition, Hoechst 33342 staining showed the presence of broken nuclei in HL-60 cells treated with 0.5 and 1 μM FBZ. To investigate the anti-cancer mechanism of FBZ, HL-60 cells were treated with FBZ in the absence or presence of N-acetyl cysteine (NAC), an inhibitor of ROS production. NAC significantly recovered the decreased metabolic activity of HL-60 induced by 0.5 and 1 μM FBZ treatments. This study provides evidence that FBZ has anti-cancer activity in HL-60 cells provided, in part, via ROS production.

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표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Fenbendazole decreases the metabolic activity of HL-60 cells.
그림 Fig. 2. FBZ decreases the MMP of HL-60. Cells were treated with FBZ for 2 d and stained with rhodamine 123 solution to determine the MMP.
그림 Fig. 3. FBZ increases cell death of HL-60 cells. Cells were treated with FBZ for 3 d and stained with annexin V-FITC and PI solution to determine cell death.
그림 Fig. 4. FBZ damages the nuclei of HL-60 cells.
그림 Fig. 5. NAC recovers the metabolic activity of HL-60 cells decreased by FBZ.

AI 본문요약
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문제 정의

FBZ는 현재 알려진 anti-tubulin effect 이외에 다른 기전을 통하여 항암작용을 갖는 지에 대해서는 연구가 미흡하다. 이에 본 연구에서는 사람 백혈병 세포의 일종인 HL-60세포에 FBZ를 처리하여 ROS와 연관된 항암효과가 유발되는 지 알아보았다.
본 연구에서는 동물용 항기생충제이며, 최근 항암효과가 있는 것으로 알려진 FBZ의 항암효과 여부와 ROS 관련 작용기전을 알아보기 위해 연구를 진행하였다. 사람의 백혈병암 세포주(cell line)인 HL-60 세포에 FBZ를 처리한 결과 0.

제안 방법

세 가지 분석에서 HL-60세포를 24-well culture plate에 1 × 105 cells/mL의 농도로 넣고 FBZ를 농도 별로 처리하였다.
유세포분석을 위해 염색한 모든 세포는 CytoFLEX® flow cytometer와 CytEx pert® software를 이용하여 분석하였다.
ROS분석을 위해 인산완충액으로 세척한 HL-60세포에 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFDA, Sigma) 용액을 10 mM 농도로 30분간 처리하였다.
MMP를 측정하기 위해 FACS staining solution으로 세척한 뒤 rhodamine 123(Sigma) 용액을 1 μg/mL의 농도로 처리하여 상온, 암실의 조건에서 30분간 반응시킨 후 분석하였다.
cells/mL의 농도로 넣은 후, FBZ를 처리하였다. 5% CO₂와 37℃의 조건에서 배양한 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT, Sigma) assay를 실시하였다[13]. MTT 시약을 well당 0.
이후 microplate reader (Thermo Fisher scientific, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 FBZ가 처리된 HL-60세포에서 ROS에 대한 영향을 확인하기 위해, ROS inhibitor인 N-acetyl-L-cysteine (NAC, Sigma)을 3 mM 농도로 처리한 후 MTT assay로 분석하였다.
세포의 미토콘드리아 막전위(mitochondrial membrane potential, MMP)와 세포사(cell death), ROS를 측정하기 위해 유세포분석을 실시하였다. 세 가지 분석에서 HL-60세포를 24-well culture plate에 1 × 10⁵ cells/mL의 농도로 넣고 FBZ를 농도 별로 처리하였다.
MMP를 측정하기 위해 FACS staining solution으로 세척한 뒤 rhodamine 123(Sigma) 용액을 1 μg/mL의 농도로 처리하여 상온, 암실의 조건에서 30분간 반응시킨 후 분석하였다. 세포사를 측정하기 위해 annexin V-FITC/propidium iodide (PI) 염색을 실시하였다[14]. Annexin V binding buffer (Thermo Fisher scientific)로 세척한 뒤 annex in V-FITC (BD Bioscience)를1 μg/mL의 농도로 처리한 후 상온, 암실의 조건에서 30분간 반응시켰다.
25μg/mL 농도로 처리하여 37℃에서 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 형광현미경(ZOE^TM Fluorescent Cell Imager; BIORAD, USA)을 이용해 관찰하고 사진촬영을 했다.
FBZ가 처리된 HL-60 세포의 미토콘드리아 막전위 변화를 알아보기 위해 rhodamine 123 염색을 실시한 후 유세포분석을 실시했다. FBZ의 농도 별로 처리된 HL-60 세포를 분석한 결과 처리농도가 증가함에 따라 MMP 측정값은 감소하는 사실을 확인하였다(Fig.
MMP는 미토콘드리아의 integrity를 반영하는 지표이며, 감소할 경우 세포의 죽음과 관련이 깊다. 따라서 FBZ에 의해 HL-60세포의 세포사(cell death)가 유도되는 지 알아보기 위해 annexin V-FITC/PI 염색을 한 후 유세포분석을 하였다. FBZ 0.
FBZ 0.25 μM 처리군은 대조군과 비교하여 눈에 띄는 차이가 없었으나 0.5 μM, 1 μM 처리군은 세포의 핵이 깨진 세포들을 확인하였다(Fig. 4).
FBZ에 의한 HL-60 세포의 생존율 변화를 시각적으로 확인하기 위하여 세포 핵을 관찰하였다. FBZ가 처리된 세포를 Hoechst 33342 용액으로 염색을 실시한 후 현미경으로 관찰하였다.
FBZ에 의한 HL-60 세포의 생존율 변화를 시각적으로 확인하기 위하여 세포 핵을 관찰하였다. FBZ가 처리된 세포를 Hoechst 33342 용액으로 염색을 실시한 후 현미경으로 관찰하였다. FBZ 0.
FBZ의 HL-60세포에 대한 항암효과가 ROS생산과 연관이 있는 지 알아보기 위해 세포 내에서 ROS를 감지할 수 있는 시약인 DCFDA를 HL-60세포에 처리한 후 유세포분석을 하였다. 하지만 반복된 실험에도 FBZ에 의한 ROS 생산은 감지할 수 없었다(data not shown).
ROS에 의한 영향을 확인하기 위해 ROS inhibitor의 일종인 NAC를 사용하였다[21]. FBZ와 NAC를 세포에 처리한 뒤 세포활성도를 측정하였다. 측정 결과 FBZ 0.

대상 데이터

실험에서 사용한 HL-60 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Korea)에서 구입하였으며, 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin/ streptomycin이 포함된 RPMI 1640 세포배지를 이용해 배양하였다. FBZ (Sigma, USA)는 dimethyl sulfoxide (Sigma)로 녹인 후 적정농도로 희석하여 사용하였다.
ROS에 의한 영향을 확인하기 위해 ROS inhibitor의 일종인 NAC를 사용하였다[21]. FBZ와 NAC를 세포에 처리한 뒤 세포활성도를 측정하였다.

데이터처리

Fig. 1과 5는샘플 당 4개 well의 평균 ± 표준편차를 표기하였으며, ANOVA 분석 후 Tukey-Kramer multiple comparison test로 유의성을 확인하였다.

성능/효과

HL-60세포에 FBZ를 0-1 μM의 농도로 처리한 결과 0.25-1 μM 처리군에서 세포의 대사활성도가 유의하게 감소하였다(Fig. 1).
FBZ가 처리된 HL-60 세포의 미토콘드리아 막전위 변화를 알아보기 위해 rhodamine 123 염색을 실시한 후 유세포분석을 실시했다. FBZ의 농도 별로 처리된 HL-60 세포를 분석한 결과 처리농도가 증가함에 따라 MMP 측정값은 감소하는 사실을 확인하였다(Fig. 2). MMP는 미토콘드리아의 integrity를 반영하는 지표이며, 감소할 경우 세포의 죽음과 관련이 깊다.
반면 ROS inhibitor인 NAC를 FBZ와 함께 HL-60세포에 처리하였을 때 FBZ 0.5 μM과 1 μM 농도에서 세포활성도가 유의하게 증가한 것을 확인하였다(Fig. 5).
FBZ 0.25 μM 처리군은 대조군과 비교하여 차이가 없었지만 FBZ 0.5 μM 처리군에서는 살아있는 세포의 비율이 7%감소하였고, 1 μM 처리군에서는 살아있는 세포의 비율이 30% 이상 감소한 것을 확인했다.
5 μM 처리군에서는 살아있는 세포의 비율이 7%감소하였고, 1 μM 처리군에서는 살아있는 세포의 비율이 30% 이상 감소한 것을 확인했다. 또한 late apoptosis 와 necrosis된 세포의 비율이 대조군에 비해 각각 17%, 18% 증가하였다(Fig. 3).
사람의 백혈병암 세포주(cell line)인 HL-60 세포에 FBZ를 처리한 결과 0.5 μM 이상 처리군에서 미토콘드리아 막전위와 세포활성도가 감소하는 것을 확인하여 FBZ의 항암효과를 확인하였다.
측정 결과 FBZ 0.5 μM 농도부터 NAC 처리군의 세포활성도가 유의하게 증가하였다.
또한 annexin V-FITC/PI 염색을 통해 cell death를 측정한 결과에서도 1 μM 처리군에서 살아있는 세포의 비율이 대조군에 비해 30% 이상 감소하여 FBZ의 항암효과를 재차 확인하였다.
5 μM 농도부터 NAC 처리군의 세포활성도가 유의하게 증가하였다. 이러한 결과를 통해 FBZ에 의한 항암효과가 일정부분 ROS에 의한 것임을 알 수 있었다. 특히 FBZ의 0.
본 연구를 통해 항기생충제의 일종인 fenbendazole이 항암 효과를 가지고 있으며, ROS가 작용기전의 일부인 것을 확인했다. Fenbendazole이 현재 항기생충제로 사용되고 있어 항암제로서의 용도를 추가하는 것은 신약개발에 비해 상대적으로 용이할 것으로 판단된다.

후속연구

하지만 DCFDA를 이용한 직접적인 세포 내 ROS를 측정하지 못했는데, 이는 FBZ를 세포에 처리한 후 ROS의 생산이 급격하게 증가했다가 소멸하는 것이 아닌가 추측한다. 따라서 후속실험을 통해 ROS가 생성되는 시간대를 다르게 하여 추가 실험을 하거나, ROS에 의한 단백질 또는 지질의 손상 정도를 측정하는 분석을 시도할 필요가 있다.
1). FBZ은 다른 항암제에 비해 약한 항암효과를 보여 주고 있지만, 상대적으로 부작용이 적은 것을 감안하면 단독 투여 또는 기존의 항암제와의 병용투여에 대한 심화된 연구가 필요하다.
Fenbendazole이 현재 항기생충제로 사용되고 있어 항암제로서의 용도를 추가하는 것은 신약개발에 비해 상대적으로 용이할 것으로 판단된다. 이번 연구를 통해 얻은 fenbendazole에 대한 정보는 기초과학 또는 임상 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Fenbendazole란?	Fenbendazole (FBZ)은 시중에 유통되고 있는 동물용 항기생충제이며, 요충증을 포함한 다양한 기생충 감염의 치료에 사용되고 있는 약물이다[1-4]. 최근 FBZ의 항암효과가 발견되어 항암제로서의 사용가능성이 연구되고 있다[5-8].
	Fenbendazole의 항암작용기전은?	최근 FBZ의 항암효과가 발견되어 항암제로서의 사용가능성이 연구되고 있다[5-8]. 현재 알려진 FBZ의 항암작용기전은 암세포의 microtubule 중합을 억제하는 anti-tubulin effect를 통해 세포분열을 억제하여 항암효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다.
	세포 내 ROS가 증가하면 무엇이 발생하는가?	산소는 체내에 존재하며 반응성이 매우 높은 기체로서, 산화적 대사 (oxidative metabolism)에 의해 생성되는 자유 전자(free electron)와 쉽게 반응하며, 세포 내에서 superoxide anion (O2−) hydroxyl radical (·O), H2O2와같은 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 생성한다[9]. ROS의 생산과 항산화물질 작용의 불균형으로 인해 세포 내 ROS가 증가하게 되면 oxidative stress가 발생하며, ROS는 DNA, 단백질 등과 반응하여 손상시키고 cell death를 유발한다[10]. 반면 항암제에 의한 ROS 생산으로 암세포의 사멸을 유도할 수 있다[11,12].

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