[논문]모과의 추출조건에 따른 Protocatechuic Acid 함량 변화 및 활성 평가

이정호; 임소연; 이왕로

doi:10.22889/kjp.2020.51.3.199

모과의 추출조건에 따른 Protocatechuic Acid 함량 변화 및 활성 평가
Protocatechuic Acid Content and Physiological Activities of Chaenomeles sinensis Extracts Prepared with Different Methods 원문보기

생약학회지, v.51 no.3, 2020년, pp.199 - 206

이정호 ((재)순창건강장수연구소) , 임소연 ((재)순창건강장수연구소) , 이왕로 (전북대학교 혁신교육개발원)

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to investigate the potential of Chaenomeles sinensis as a content of protocatechuic acid and physiological activities. The analyzed the content of protocatechuic acid of Chaenomeles sinensis water extract (CSW) according to different extract temperature and time for extraction. It was analyzed as 0.14±0.00 mg/g in the extract at 100℃ for 3 h. Protocatechuic acid content increased as extraction time and temperature increased. The activity of the CSW at 100℃ for 3 h was measured. As a result of measuring DPPH, ABTS radical scavenging activity and SOD activity, antioxidant activity was found and α-glucosidase inhibition activities. Cell viability was shown for RAW 264.7 cells, and NO (nitric oxide) production was also inhibited. Finally, content of protocatechuic acid increased with increasing extraction time and extraction temperature, and exhibited antioxidant activity, inhibition of NO production, and anti-diabetic activity. It is believed that the Chaenomeles sinensis is likely to be developed as a functional material.

주제어

표/그림 (9)

표 Table I. Analytical conditions of HPLC
그림 Fig. 1. HPLC chromatogram of (A) protocatechuic acid standard and (B) Chaenomeles sinensis water extract.
표 Table II. Protocatechuic acid contents according to extraction temperature of Chaenomeles sinensis water extracts
표 Table III. Protocatechuic acid contents according to extraction time of Chaenomeles sinensis water extracts
표 Table IV. Antioxidant effects of Chaenomeles sinensis water extracts
표 Table V. Cell viability of Chaenomeles sinensis water extract on macrophage Raw 264.7 cells by MTT assay (unit: %)
표 Table VI. Effect of Chaenomeles sinensis water extract on nitric oxide production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated Raw 264.7 cells
표 Table VII. Effects on -glocosidase activity of Chaenomeles sinensis water extract
표 Table VIII. Proximate composition of Chaenomeles sinensis

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

1,26) 이에 본 연구에서는 물을 이용하여 모과를 온도별, 시간별로 추출한 후 protocatechuic acid 함량을 측정하였고, 항산화 활성, 세포독성, NO 생성 억제, α-glucosidase 저해 활성, 일반성분 등을 분석하여 건강기능식품 개발을 위한 기초 자료로 활용하고자 한다.

제안 방법

α-Glucosidase 저해 활성 - α-glucosidase 저해 활성은 Watanabe의 방법35)을 변형하여 측정하였다.
18) 이에 따라 protocatechuic acid의 함량과 건강기능식품 제조시 원료 제조에 적합하다고 판단된 100oC, 3시간 추출물에 대하여 DPPH radical 소거활성, ABTS radical 소거활성, SOD 유사 활성, 세포 독성, NO 생성 억제 및 α-glucosidase 저해 활성을 측정하였다.
⁴⁰⁾ 대식세포는 면역체계를 형성하는 세포로 인체가 외부 자극을 받으면 NO 등 염증매개물질을 분비하여 염증반응을 일으킨다.^22,40) 모과 물 추출물에 대한 NO 생성 억제를 측정하였다(Table VI). 모과 물 추출물의 처리농도 1 μg/mL 처리군에서 13.
Protocatechuic acid의 함량은 모과의 기능성과도 연관이 있다.²⁶⁾ HPLC를 이용하여 Table I의 분석조건에 따라 모과 물 추출물에 함유된 protocatechuic acid의 함량을 정량분석하였다. Protocatechuic acid 표준용액은 HPLC용 methanol을 이용하여 1 mg/mL로 조제하였으며, 모과 물 추출물 1g에 HPLC용 methanol 50 mL을 넣고 30분 초음파 추출 후, 0.
DMEM 배지를 이용하여 RAW 264.7 세포를 24 well plate에 1×105 cell/mL의 농도로 온도 37oC, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후, 상층액을 제거하고 lipopolysaccharide(1 μg/mL)를 농도 별로 희석하고 모과 물 추출물을 첨가하여 24시간 배양하였다.
DPPH 라디칼 소거 활성 - Yoshida의 방법³⁰⁾을 변형하여 측정하였다. DPPH에 대한 수소공여능은 96 well plate에 시료액 20 μL과 DPPH 용액 80 μL를 혼합하여 암소에서 30분 동안 실온에 방치한 후 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용하여 517 nm에서 측정하였다.
DPPH에 대한 수소공여능은 96 well plate에 시료액 20 μL과 DPPH 용액 80 μL를 혼합하여 암소에서 30분 동안 실온에 방치한 후 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용하여 517 nm에서 측정하였다. DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)를 구하였으며, 양성대조군은 L-ascorbic acid(A5960, Sigma, USA)를 사용하였다.
HPLC 분석기기는 Shiseido NANOSPACE SI2, PDA detector(Shiseido, Japan) 260 nm에서 분석하였으며, protocatechuic acid 대한 정량 분석을 위하여 Capcellpak C18 Type MG II column(4.6×250 mm ID, 5 μm, Shiseido, Japan)을 사용하였다.
Protocatechuic Acid 분석 - 모과 물 추출물 1g에 methanol(Burdick & Jackson Co., Muskegon, MI, USA) 50 mL을 넣고 30분 초음파 추출 후, 0.45 μm syringe filter (Whatman Co., Buckinghamshire, UK)로 여과시켜 분석하였다.
HPLC 분석조건은 Table I에 요약하였으며, 모든 용매는 사용 전 탈기 및 여과하여 사용하였다. Protocatechuic acid의 정량곡선은 피크 면적비와 농도 그래프를 작성하여 함량을 분석하였다.^3,27-29)
SOD 유사 활성 측정 - SOD 유사 활성은 SOD assay Kit-WST(Sigma-Aldrich, Switzerland)를 사용하여 측정하였으며, 시료 무처리군과 첨가군의 값을 비교하여 IC₅₀로 나타내었다.¹⁸⁾
1% n-ethylendiamine dihydrochloride(50 μL)를 첨가하여 상온에서 10분간 반응시키고 microplate reader system을 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. nitric oxide 농도는 표준곡선과 비교하여 산출하였으며, 배지만을 측정한 흡광도를 blank로 설정하였다.³⁴⁾
모과에 함유된 protocatechuic acid의 함량은 추출시간 및 추출온도가 증가함에 따라 protocatechuic acid 함량도 증가하였다. 모과 100^oC, 3시간 추출물에 대한 활성을 측정하였다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성과 SOD 유사 활성에 대한 IC₅₀ 농도는 각각 364.
모과 물 추출물을 DMEM(Dulbecco’s modified Essential medium)으로 희석하여 실험하였다.
모과 100^oC, 3시간 추출물에 대한 항산화 활성은 Table IV에 나타내었다. 모과 물 추출에 대한 50% 억제하는데 필요한 시료의 농도(IC₅₀)을 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 364.
1분대에서 main peak가 관찰되었다. 모과 추출물에서 protocatechuic acid 표준용액에서와 같은 시간대의 peak가 관찰하였다. Protocatechuic acid peak의 UV 스펙트럼을 확인한 결과, λ_Max값이 260 nm에서 관찰되어 UV 스펙트럼의 패턴이 일치하였다(Fig.
6×250 mm ID, 5 μm, Shiseido, Japan)을 사용하였다. 분석 조건은 1.0 mL/min, column 온도는 40^oC로 설정하여 0.1% Trifluoroacetic acid/acetonitrile(A/B, v/v)를 B; 0분: 5%, B; 10분: 10%, B; 30분: 35%, B; 40분: 90%, B; 50분: 95%의 조건으로 분석하였다. Protocatechuic acid 표준용액 검량선의 상관계수(R²)=0.
세포독성 - 모과 물 추출물에 대한 RAW 264.7 세포에 대한 독성을 측정하였다(Table V). 모과 물 추출물을 DMEM(Dulbecco’s modified Essential medium)으로 희석하여 실험하였다.
세포독성 측정 - NO 생성 억제는 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행에서 분양받아 Boligon³²⁾ 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 항생제(penicillin G sodium 10,000 unit/mL, streptomycin sulfate 10,000 μg/mL), 1 mM sodium pyruvate가 첨가된 DMEM 배지를 배양액으로 하여 37^oC, humidified 5% CO₂ incubator에서 배양하였다.
DPPH는 일반적으로 517 nm 파장에서 흡수가 일어나 보라빛을 나타내지만 항산화 물질과 반응하면 화학구조가 변하여 노란빛을 띄게 된다. 이러한 원리를 이용하여 DPPH 라디칼의 감소를 분광광도 등을 이용하여 측정한다.^24,37) ABTS는 청록색을 띄며, potassium persulfate와 반응하면 ABTS radical을 형성하는데 이때 생성된 양이온(ABTS+)은 항산화성 물질에 의해 제거되어 무색에 가까운 연녹색을 띄게 된다.
추출 - 모과는 동결건조기(IlShinBioBase LP20, Dongducheon, Korea)를 이용하여 완전 건조시켜 분쇄기로 분쇄하여 100 mesh체로 거른 후, 모과 무게의 20배 증류수를 첨가하여 추출하였다. 추출온도는 20, 60, 100℃, 추출시간은 0.
건조한 well에 100 μL DMSO를 첨가시켜 1분 동안 shaking하여 formazan을 완전히 용해시킨 후 microplate reader system을 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물을 처리하지 않은 세포의 흡광도를 대조군으로 설정하여 흡광도(%)를 환산하였다.³³⁾
7로 희석된 ABTS 용액 190 µL를 넣고 빛을 차단하여 상온에서 10분 동안 반응시킨 후, microplate reader system(Nano Quant, Infinite 200 PRO, Tecan, Austria)을 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 흡광도가 50%로 환원시키는데 필요한 추출물의 농도인 IC₅₀ 값으로 나타내었으며, 양성대조군은 L-ascorbic acid를 사용하였다.
추출온도는 20, 60, 100℃, 추출시간은 0.5, 1, 2, 3, 6, 9시간 동안 추출한 후 0.4 μm 필터로 감압여과시켰다.

대상 데이터

Protocatechuic acid(Sigma Chemical Co., USA) 표준 용액은 methanol을 이용하여 1 mg/mL로 조제한 후 0.2 μm syringe filter(Whatman Co., Buckinghamshire, UK)로 여과하여 분석 시료로 사용하였다.
실험재료 - 모과는 2018년 (주)옴니허브에서 구입하여 우석대학교 약학대학 임재윤교수에게 검증받은 후 실험에 사용하였으며, 표본은 (재)순창건강장수연구소에 보관되어 있다.
이때 생성된 p-nitrophenol은 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며, negative control은 시료 무첨가군으로 설정하였고, blank는 기질 무첨가군으로 설정하였다. 양성 대조군으로 acarbose(1.0 mg/mL)를 사용하였다.

데이터처리

통계처리 - 모든 실험은 3회 반복 측정한 후 평균±표준편차로 표기하였고, 통계분석은 ANOVA(one way analysis of variance)와 Student’s t-test를 사용하였다.

이론/모형

Nitric Oxide 생성 억제 측정 - NO의 발생량은 Griess 반응을 이용하여 배양액 내 nitrite 농도 측정을 통해 평가하였다. DMEM 배지를 이용하여 RAW 264.
일반성분 분석 - 일반 성분분석은 AOAC(association of official analyticial chemists)의 방법에 따라 식품공전의 분석방법에 준하여 실험하였다. 조단백 함량은 Kjeldahl 질소 정량법, 조회분 함량은 550^oC 직접 회화법, 조지방은 Soxhlet법으로 분석하였다.
일반성분 분석 - 일반 성분분석은 AOAC(association of official analyticial chemists)의 방법에 따라 식품공전의 분석방법에 준하여 실험하였다. 조단백 함량은 Kjeldahl 질소 정량법, 조회분 함량은 550^oC 직접 회화법, 조지방은 Soxhlet법으로 분석하였다.

성능/효과

025%보다 SOD 효소 활성이 높게 분석되었다.¹⁵⁾ 모과 물 추출물의 항산화 활성은 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 항산화 활성도 증가하였다. 이는 모과에 함유된 polyphenol성 화합물과 protocatechuic acid 등의 활성 성분의 용출에 의한 것으로 판단된다.
24) ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과 936.58±31.59 μg/mL으로 측정되었다.
α- Glucosidase 저해 활성은 혈당수치 상승억제의 지표로 사용한다.²⁴⁾ 페놀성 화합물은 다양한 화학구조와 분자량을 가지며, phenolic hydroxyl기가 단백질 등 거대분자와 결합하면 항산화, 항암, 항균 등 생리활성을 가진다.^25-27) Protocatechuic acid(3,4-dihydroxybenzoic acid)는 페놀화합물로서 항산화 및 항염증 활성을 가지고 있다.
6시간 추출물에서 0.26±0.02 mg/g(수율 48.3%), 3시간 추출물에서 0.18±0.01 mg/g(수율 47.3%)으로 추출시간이 증가함에 따라 protocatechuic acid함량도 증가하였다(Table III).
Protocatechuic acid peak의 UV 스펙트럼을 확인한 결과, λMax값이 260 nm에서 관찰되어 UV 스펙트럼의 패턴이 일치하였다(Fig. 1).
노간주나무 에탄올 추출물에서 ABTS 라디칼 소거활성이 500 μg/mL에서 79.3%으로 나타났으며, 열수추출물은 76.4%의 활성을 나타났다고 보고한 연구결과보다 낮은 활성이 나타났지만, 모과 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 활성도 증가하였다.
매자나무 열수 추출물(100oC, 60분 추출)의 SOD 유사활성 측정결과 20.27±2.025%보다 SOD 효소 활성이 높게 분석되었다.
모과 물 추출물에 대한 RAW 264.7 세포에서 10 mg/L에서 97.10±5.03%, 1 mg/L 94.29±0.70% 세포생존능이 측정되었으며, NO 생성도 억제되었다.
모과 물 추출물의 처리농도 1 μg/mL 처리군에서 13.57±0.77 μg/ mL, 10 μg/mL에서 12.21±0.69 μg/mL으로 측정되었으며, 처리 농도가 증가함에 따라 NO 생성량이 감소하였다.
모과 물 추출물의 처리농도 10 mg/L에서 97.10±5.03%, 1 mg/L에서 94.29±0.70% 세포생존능이 측정되었으며, blank군과 비교한 결과 세포 독성에 거의 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
모과 추출시간에 따른 protocatechuic acid 함량을 분석한결과, 9시간 추출물에서 0.32±0.02 mg/g(수율 52.6%)으로 분석되었다.
모과 추출온도에 따른 protocatechuic acid 함량을 분석한결과, 100oC 추출물에서 0.14±0.00 mg/g(수율 45.0%)으로 분석되었으며, 60oC에서 0.10±0.00 mg/g(수율 30.0%), 20oC에서 0.09±0.00 mg/g(수율 21.7%)으로 분석되었다.
01 mg/g으로 분석되었다. 모과에 함유된 protocatechuic acid의 함량은 추출시간 및 추출온도가 증가함에 따라 protocatechuic acid 함량도 증가하였다. 모과 100^oC, 3시간 추출물에 대한 활성을 측정하였다.
모과의 추출온도 추출시간에 따른 protocatechuic acid 함량을 정성·정량분석한 결과 추출시간 3시간, 추출온도 20, 60, 100oC에서 추출한 추출물을 분석한 결과 100oC 추출물에서 0.14±0.00 mg/g, 60oC 추출물 0.10±0.00 mg/g, 20oC추출물 0.09±0.00 mg/g으로 분석되었으며, 100oC에서 0.5, 1, 2, 3, 6, 9시간 추출한 추출물을 분석한 결과, 9시간 추출물에서 0.32±0.02 mg/g, 6시간 추출물 0.26±0.02 mg/g, 3시간 추출물 0.18±0.01 mg/g으로 분석되었다.
70% 세포생존능이 측정되었으며, NO 생성도 억제되었다. 일반 성분은 열량 372.16 kcal/100g, 탄수화물 86.43% 조단 백질 2.92%, 조지방 1.64%, 총당 251.60 mg/g, 포화지방산 0.22 g/100g으로 분석되었다. 모과는 추출시간 및 추출온도에 따라 protocatechuic acid의 함량이 증가하였고, 항산화 활성, 산화질소 생성 억제, 항당뇨 활성이 측정되어 향후 다양한 활성 기작 연구를 통하여 기능성 소재로 개발할 가능성이 있을 것으로 판단되며, 기능성 연구의 기초자료로 활용되리라 사료된다.
일반성분 분석 - 모과에 함유된 일반 성분분석은 AOAC(association of official analyticial chemists)의 방법에 따라 식품공전의 분석방법에 준하여 분석한 결과 열량은 372.16 kcal/100g, 탄수화물은 86.43% 조단백질은 2.92%, 조지방은 1.64%, 총당 251.6 mg/g, 포화지방산은 0.22 g/100 g으로 분석되었다(Table VIII).

후속연구

42) 모과 물 추출물은 비교적 높은 α-glucosidase 저해율이 나타나 기능성 소재로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
22 g/100g으로 분석되었다. 모과는 추출시간 및 추출온도에 따라 protocatechuic acid의 함량이 증가하였고, 항산화 활성, 산화질소 생성 억제, 항당뇨 활성이 측정되어 향후 다양한 활성 기작 연구를 통하여 기능성 소재로 개발할 가능성이 있을 것으로 판단되며, 기능성 연구의 기초자료로 활용되리라 사료된다.
^26,36) 이에 따라 모과에 함유된 protocatechuic acid 함량은 추출시간과 추출온도가 증가함에 따라 증가하였다. 향후 100^oC 이상의 온도와 9시간 이상의 추출조건에서 추출한 추출물에 대한 연구 수행을 진행하고자 한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	모과의 성분은 무엇인가?	1-3) 한방에서는 오래 복용하면 근육과 위장을 강화시키고, 통증을 없애주며, 근육이완, 간 기능 강화, 이뇨, 혈액 생성 등의 효능을 가지고 있어 피로회복, 자양강장, 기침, 감기, 천식, 소화불량, 복부팽만감, 관절염, 폐렴, 황달형간염, 세균성이질 등을 치료한다.3-5) 모과 성분은 protocatechuic acid, βsistosterol, oleanolic acid, ursolic acid, aspartic acid, glutamic acid, argimine, saponin, flavonoid, tannin, proanthocyanidin, catechin, leucoanthocyan, 유기산 등을 함유하고 있다.4,6,7) 모과에 관한 연구는 모과의 화학성분,3) 휘발성과 비휘발성 flavor 성분 분석,8) 근분화 및 에너지 대사 조절 발현,9) 항산화와 미백효과,10) 항비만억제,11) 항산화 및 미백효과,12) 항염증효과,13) 항응혈 억제14) 등이 연구되었다.
	모과란 무엇인가?	모과(Chaenomeles sinensis Koehne)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 모과나무의 열매로 한국, 중국, 일본 등에 분포한다. 성숙과는 황색으로 향기가 있으며, 신맛이 강하고 떫은맛이 있어 식용보다는 약용, 차 등으로 섭취한다.1-3) 한방에서는 오래 복용하면 근육과 위장을 강화시키고, 통증을 없애주며, 근육이완, 간 기능 강화, 이뇨, 혈액 생성 등의 효능을 가지고 있어 피로회복, 자양강장, 기침, 감기, 천식, 소화불량, 복부팽만감, 관절염, 폐렴, 황달형간염, 세균성이질 등을 치료한다.
	한방에서 모과는 무엇을 치료하는 것에 사용되었는가?	성숙과는 황색으로 향기가 있으며, 신맛이 강하고 떫은맛이 있어 식용보다는 약용, 차 등으로 섭취한다.1-3) 한방에서는 오래 복용하면 근육과 위장을 강화시키고, 통증을 없애주며, 근육이완, 간 기능 강화, 이뇨, 혈액 생성 등의 효능을 가지고 있어 피로회복, 자양강장, 기침, 감기, 천식, 소화불량, 복부팽만감, 관절염, 폐렴, 황달형간염, 세균성이질 등을 치료한다.3-5) 모과 성분은 protocatechuic acid, βsistosterol, oleanolic acid, ursolic acid, aspartic acid, glutamic acid, argimine, saponin, flavonoid, tannin, proanthocyanidin, catechin, leucoanthocyan, 유기산 등을 함유하고 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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