Park, Heechul
(Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Sciences, Catholic University of Pusan)
,
Park, Sung-Bae
(Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Sciences, Catholic University of Pusan)
,
Kim, Junseong
(Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Sciences, Catholic University of Pusan)
,
Jeon, Hyeonjeong
(Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Sciences, Catholic University of Pusan)
,
Choi, Sein
(Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Sciences, Catholic University of Pusan)
,
Lee, Seungyeon
(Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Sciences, Catholic University of Pusan)
,
Oh, Eunchong
(Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Sciences, Catholic University of Pusan)
,
Hwang, Soenghwi
(Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Sciences, Catholic University of Pusan)
,
Kim, Hyunjung
(QuantaMatrix Inc., Seoul National University Hospital CMI)
,
Kim, Jungho
(Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Sciences, Catholic University of Pusan)
,
Kim, Sunghyun
(Department of Clinical)
Staphylococcus aureus (S. aureus) is known as a bacterium that can cause skin infections, respiratory system infections, and sinusitis; however, it can exist as a normal flora rather than a pathogen. Recently, methicillin-resistant S. aureus (MRSA) infections have emerged in the community as a new v...
Staphylococcus aureus (S. aureus) is known as a bacterium that can cause skin infections, respiratory system infections, and sinusitis; however, it can exist as a normal flora rather than a pathogen. Recently, methicillin-resistant S. aureus (MRSA) infections have emerged in the community as a new variant of community-associated (CA)-MRSA. In the present study, S. aureus and MRSA were isolated and cultured by collecting samples from facilities and environments where students and educational personnel have multiple contacts on university campuses; specifically, the nostrils and hands of college students were tested from July to September of 2019. The molecular properties of the isolated MRSA were analyzed, and the one MRSA strain was isolated from the university campuses. One MRSA that was isolated and cultured on campus was the mec complex group A and staphylococcal cassette chromosome (SCC) mec type II, which is a characteristic of healthcare-associated (HA)-MRSA, and SCCmec type V, which is a characteristic of CA-MRSA. This result was similar to other studies wherein the SCCmec type II was detected in SCCmec typing analysis in CA-MRSA. To confirm whether there is a new variant of CA-MRSA in the Republic of Korea, additional follow-up studies on the analysis of virulence factors of MRSA are needed by additionally separating CA-MRSA from the body parts of university students and educational personnel.
Staphylococcus aureus (S. aureus) is known as a bacterium that can cause skin infections, respiratory system infections, and sinusitis; however, it can exist as a normal flora rather than a pathogen. Recently, methicillin-resistant S. aureus (MRSA) infections have emerged in the community as a new variant of community-associated (CA)-MRSA. In the present study, S. aureus and MRSA were isolated and cultured by collecting samples from facilities and environments where students and educational personnel have multiple contacts on university campuses; specifically, the nostrils and hands of college students were tested from July to September of 2019. The molecular properties of the isolated MRSA were analyzed, and the one MRSA strain was isolated from the university campuses. One MRSA that was isolated and cultured on campus was the mec complex group A and staphylococcal cassette chromosome (SCC) mec type II, which is a characteristic of healthcare-associated (HA)-MRSA, and SCCmec type V, which is a characteristic of CA-MRSA. This result was similar to other studies wherein the SCCmec type II was detected in SCCmec typing analysis in CA-MRSA. To confirm whether there is a new variant of CA-MRSA in the Republic of Korea, additional follow-up studies on the analysis of virulence factors of MRSA are needed by additionally separating CA-MRSA from the body parts of university students and educational personnel.
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문제 정의
이러한 MRSA의 중요성에도 불구하고 국내에서의 환경 유래 MRSA의 연구가 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 대학 캠퍼스 내 학생 및 교직원이 접촉이 많은 시설 및 환경 그리고 대학생의 특정 신체 부위(콧구멍, 손)로부터 표본을 수집하여 S. aureus를 분리 배양하고 그 분포를 조사하여, MRSA의 감별 및 분리된 MRSA의 분자유전학적 특성을 분석하고자 하였다.
제안 방법
1차 배양 후, 배지에서 자란 모든 집락 수를 세고, 형성된 세균의 집락 모양, 색을 관찰하여 여러 종의 미생물이 복합적으로 집락을 형성한 경우, 단일 집락으로 분리하기 위해 Nutrient agar에 2차 계대 배양하였다. 1차 또는 2차 계대 배양을 통하여 얻어진 단일 집락을 세균 동정 검사와 내성 유전자 검사에 이용하였다.
단일 집락으로 분리된 세균의 동정을 위하여 Gram 염색을 실시하였다. Gram 염색의 염색상을 바탕으로 Gram 양성 알균을 일차적으로 구분하였다. 확인된 Gram 양성 알균은 S.
aureus-specific PCR의 조건은 94℃에서 5분간 pre-denaturation 과정 후 denaturation 과정 94℃에서 30초, primer annealing 과정 60℃에서 30초, extension 과정 72℃에서 30초 과정으로 30 cycle 반복하고 final extension 과정 72℃ 5분 반응하였다. MRSA (mecA)-specific PCR의 조건은 94℃에서 5분간 pre-denaturation 과정 후 denaturation 과정 94℃에서 30초, primer annealing 과정 50℃에서 30초, extension 과정 72℃에서 30초 과정으로 40 cycle 반복하고 final extension 과정 72℃ 10분 반응하였다. 증폭 반응이 끝난 PCR 산물은 2% agarose/TBE gel DNA 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다.
aureus 분리를 위한 선택배지인 Mannitol Salt Agar (MSA) 평판배지(KisanBio, Seoul, Korea)에 접종하여 37℃ 세균 배양기에서 16~24시간 배양하였다. MSA 배지에서 mannitol 분해능 양성을 나타내는 균은 S. aureus로 동정한 후, S. aureus-specific PCR로 확인동정 하였다. 한편, Mannitol 분해능 음성을 나타내는 Gram 양성 알균의 종 확인 동정은 세균 16S rRNA 염기서열분석법을 이용하였다.
단일 집락으로 분리된 세균의 동정을 위하여 Gram 염색을 실시하였다. Gram 염색의 염색상을 바탕으로 Gram 양성 알균을 일차적으로 구분하였다.
aureus-specific PCR과 MRSA (mecA)-specific PCR을 수행하기 위해 Prime Taq PCR Premix (GeNet Bio, Daejeon, Korea) 10 μL와 Forward 및 Reverse primer를 각각 10 pmol, 추출한 gDNA를 주형 DNA로 3 μL, 멸균증류수 5 μL를 첨가하여 총 20 μL의 혼합액을 만들어 PCR을 수행하였다. 본 연구에 사용된 primer의 염기서열은 기존 연구자료를 바탕으로 시행하였다(Table 1). S.
분리 배양된 MRSA의 분자유전학적 특성 비교를 위해 SCCmec과 mec complex typing을 수행하였고, Prime Taq PCR Premix 10 μL와 Forward 및 Reverse primer를 각각 10 pmol, 추출한 gDNA를 주형 DNA로 3 μL, 멸균증류수5 μL를 첨가하여 총 20 μL의 혼합액을 만들어 분석하였다. 본 연구에 사용된 primer의 염기서열은 기존 연구자료를 자료를 바탕으로 시행하였다(Table 1).
분리 배양된 MRSA의 분자유전학적 특성 비교를 위해 SCCmec과 mec complex typing을 수행하였고, Prime Taq PCR Premix 10 μL와 Forward 및 Reverse primer를 각각 10 pmol, 추출한 gDNA를 주형 DNA로 3 μL, 멸균증류수5 μL를 첨가하여 총 20 μL의 혼합액을 만들어 분석하였다.
선택배지인 MSA에서 양성을 나타낸 균들의 단일 집락을 이용하여 S. aureus-specific PCR과 MRSA (mecA)-specific PCR을 수행하기 위해 Prime Taq PCR Premix (GeNet Bio, Daejeon, Korea) 10 μL와 Forward 및 Reverse primer를 각각 10 pmol, 추출한 gDNA를 주형 DNA로 3 μL, 멸균증류수 5 μL를 첨가하여 총 20 μL의 혼합액을 만들어 PCR을 수행하였다.
종(Species) 수준까지의 세균 동정을 위한 염기서열분석법 및 MRSA의 분자유전학적 특성 분석을 위하여 분리된 단일 집락으로부터 Genomic DNA (gDNA) 추출하였다. 배지에서 배양된 세균의 단일 집락을 백금이로 취한 후5% Chelex® Resin (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)/TBE 용액 500 μL에 혼탁 시킨 후 90~95℃에서 10분간 끓인 후 3,000 x g로 10분간 원심분리한 상층액을 멸균 튜브에 옮긴 후 분석 시까지 -20℃에서 냉동 보관하였다.
MRSA (mecA)-specific PCR의 조건은 94℃에서 5분간 pre-denaturation 과정 후 denaturation 과정 94℃에서 30초, primer annealing 과정 50℃에서 30초, extension 과정 72℃에서 30초 과정으로 40 cycle 반복하고 final extension 과정 72℃ 10분 반응하였다. 증폭 반응이 끝난 PCR 산물은 2% agarose/TBE gel DNA 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다. 추가적으로 MSA 배양 결과 양성을 나타냈지만, S.
증폭 반응이 끝난 PCR 산물은 2% agarose/TBE gel DNA 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다. 추가적으로 MSA 배양 결과 양성을 나타냈지만, S. aureus-specific PCR 결과 음성으로 나타난 단일 집락을 대상으로 Bacterial 16S rRNA sequencing 분석을 진행하였다.
Gram 염색의 염색상을 바탕으로 Gram 양성 알균을 일차적으로 구분하였다. 확인된 Gram 양성 알균은 S. aureus 분리를 위한 선택배지인 Mannitol Salt Agar (MSA) 평판배지(KisanBio, Seoul, Korea)에 접종하여 37℃ 세균 배양기에서 16~24시간 배양하였다. MSA 배지에서 mannitol 분해능 양성을 나타내는 균은 S.
대상 데이터
2019년 7월부터 9월까지 부산가톨릭대학교 캠퍼스 내 학생 및 교직원들의 출입이 많은 3개의 건물(건물 A, B, C)에서 사람들의 접촉이 많은 환경(출입문 손잡이, 창문, 책상, 키보드, 에어컨, 정수기, 엘리베이터 버튼 등)과 대학생의 손, 비강으로부터 멸균 면봉을 이용해 가검물을 수집하였다.
이론/모형
aureus-specific PCR로 확인동정 하였다. 한편, Mannitol 분해능 음성을 나타내는 Gram 양성 알균의 종 확인 동정은 세균 16S rRNA 염기서열분석법을 이용하였다.
성능/효과
Gram 염색에서 Gram 양성 알균으로 확인된 총 226개의 단일 집락을 대상으로 S. aureus의 선택배지인 MSA에서 배양한 결과 Gram 양성 알균 중 89개(39.4%)의 단일집락에서 MSA 배양 양성이 확인되었다(Table 2). MSA 배양 결과 양성을 나타낸 총 89개의 단일 집락에 대하여 S.
2%)으로 확인되었다(Table 2). Gram-양성 알균을 제외한 Gram-양성 막대균, Gram-음성 알균, Gram-음성 막대균은 일반적인 환경 내 오염균으로 추정이 되며, fungi 13건(3.2%)는 사상형 진균으로 환경 내 존재하는 진균이였다.
MRSA (mecA)-specific PCR 결과 양성을 나타낸 1건을 이용하여 SCCmec typing과 mec complex typing을 수행한 결과 캠퍼스 환경에서 분리된 MRSA 균주는 SCCmec type II와 V임을 확인하였으며, mec complex type A임을 확인하였다(Fig. 1, Table 5).
4%)의 단일집락에서 MSA 배양 양성이 확인되었다(Table 2). MSA 배양 결과 양성을 나타낸 총 89개의 단일 집락에 대하여 S. aureus-specific PCR을 수행한 결과 4개의 단일 집락에서 S. aureus으로 동정되었다. 한편, MSA 배양 결과 양성을 나타냈지만, S.
MSA 배양 양성을 나타내며 S. aureus로 동정된 4개의 단일 집락에 대해 Methicillin 내성 관련 유전자인 mecA 유전자를 검출하기 위하여 MRSA (mecA)-specific PCR을 수행한 결과 1개의 단일 집락에서 mecA 유전자를 가지고 있음을 확인하였다(Table 4).
aureus가 아닌 Staphylococcus species가 66건, Micrococcus species가 5건, 기타 6건, 동정되지 않은 균이 7건임을 확인하였다. Staphylococcus species 중 가장 많이 분리된 균은 Staphylococcus capare(22건, 25.9%)이었으며, 모두 coagulase negative staphylococci (CONS)이었다(Table 3).
1%)으로 확인되었다. 본 연구에서 검출된 MRSA는 비록 1건이지만 유동인구가 많은 캠퍼스 환경에서 분리되었다는 점은 최근 CA-MRSA의 감염 문제가 대두되고 있는 상황에서 간과할 수 없는 결과라고 사료된다.
본 연구에서는 일차적으로, 대학 캠퍼스 내 생활 중인 대학생 및 교직원의 직접적인 접촉이 많은 다양한 시설 및 환경과, S. aureus 분리 비율이 가장 높은 대학생의 특정 신체 부위로부터 수집한 가검물을 대상으로 S. aureus와 MRSA의 분리 빈도를 검사한 결과, MSA에서 분리 배양된 89개의 단일 집락 중 S. aureus가 4건(4.5%), 그 중 MRSA가 1건(1.1%)으로 확인되었다. 본 연구에서 검출된 MRSA는 비록 1건이지만 유동인구가 많은 캠퍼스 환경에서 분리되었다는 점은 최근 CA-MRSA의 감염 문제가 대두되고 있는 상황에서 간과할 수 없는 결과라고 사료된다.
수집한 총 150개의 가검물 모두에서 균집락이 관찰되었으며 단일 집락 407개를 분리하였다. 분리된 균의 결과는, Gram-양성 세균 중에서 Gram-양성 알균이 226건(55.5%), Gram-양성 막대균이 58건(14.3%), Gram-음성 알균이 40건(9.8%), Gram-음성 막대균이 70건(17.2%), 사상형진균이 13건(3.2%)으로 확인되었다(Table 2). Gram-양성 알균을 제외한 Gram-양성 막대균, Gram-음성 알균, Gram-음성 막대균은 일반적인 환경 내 오염균으로 추정이 되며, fungi 13건(3.
수집한 총 150개의 가검물 모두에서 균집락이 관찰되었으며 단일 집락 407개를 분리하였다. 분리된 균의 결과는, Gram-양성 세균 중에서 Gram-양성 알균이 226건(55.
캠퍼스에서 분리 배양된 1주의 MRSA는 mec complex group A이면서 HA-MRSA에서 주로 나타나는 SCCmec type II와 CA-MRSA의 특징인 SCCmec type V가 동시에 나타나는 것을 확인하였다. 이 결과는 CA-MRSA에서도 SCCmec type II가 나타날 수 있으며(Hisata et al.
aureus으로 동정되었다. 한편, MSA 배양 결과 양성을 나타냈지만, S. aureus-specific PCR 결과 음성으로 나타난 85개의 단일 집락을 대상으로 16S rRNA 염기서열분석법을 통한 동정 결과, S. aureus가 아닌 Staphylococcus species가 66건, Micrococcus species가 5건, 기타 6건, 동정되지 않은 균이 7건임을 확인하였다. Staphylococcus species 중 가장 많이 분리된 균은 Staphylococcus capare(22건, 25.
후속연구
epidermidis의 분리 비율이 가장 높다는 이전 연구 결과와는 차이가 있지만(Shin and Park, 2007), 검체 대상 및 연구 목적의 차이로 생각이 된다. 균종 분리 비율이 다르긴 하지만, 전체 85개의 분리균 중에서 66 (77.6%)개의 분리균이 Coagulase negative staphylcossus (CoNS)으로 매우 높은 비율을 차지했다는 것은 다른 국내 및 해외의 보고들과 유사한 결과로 확인이 되었으며, 이전에는 오염균으로 간주되었으나, 최근 중요한 기회 감염균으로 대두되고 있다는 점에서 후속연구를 통한 지속적인 조사가 필요할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 단기간에 대학 캠퍼스로부터 분리 배양된 한 개의 CA-MRSA 균주로만 연구가 진행되었다는 한계점이 있었기 때문에 전체 CA-MRSA의 분자유전학적 특성을 분석하기에는 통계적 유의성이 낮을 수 있다. 하지만, 본 연구에서는 HA-MRSA에서 주로 나타나는 것으로 알려진 SCCmec type II가 CA-MRSA에서 확인되었기 때문에 최근 CA-MRSA의 새로운 변종이 있을 수 있다는 가능성을 확인할 수 있었으며, 지역과 인종에 따라 CAMRSA의 SCCmec type이 다를 수 있기 때문에 그 기준에 따른 MRSA 감염 예방을 위한 소독제 및 살균제 개발을 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것이라고 사료된다.
aureus 및 MRSA가 검출된 것으로 봤을 때 유동인구가 많은 곳에서의 MRSA의 분리 배양과 감염을 예방할 수 있는 방법을 강구하는 것이 매우 중요할 것으로 판단된다. 추가적으로 대학 캠퍼스 환경 외에 대학생과 교직원의 신체 부위로부터 장기간에 걸쳐 S. aureus와 CA-MRSA를 추가적으로 확보하여 본 연구를 통해 분리된 4개의 S. aureus와 1개의 MRSA, 그리고 다른 지역에서 분리된 CAMRSA의 병원성 인자 분석에 관한 후속연구를 진행한다면, CA-MRSA의 새로운 변종의 발견과 효과적인 MRSA 감염 예방과 치료를 할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 단기간에 대학 캠퍼스로부터 분리 배양된 한 개의 CA-MRSA 균주로만 연구가 진행되었다는 한계점이 있었기 때문에 전체 CA-MRSA의 분자유전학적 특성을 분석하기에는 통계적 유의성이 낮을 수 있다. 하지만, 본 연구에서는 HA-MRSA에서 주로 나타나는 것으로 알려진 SCCmec type II가 CA-MRSA에서 확인되었기 때문에 최근 CA-MRSA의 새로운 변종이 있을 수 있다는 가능성을 확인할 수 있었으며, 지역과 인종에 따라 CAMRSA의 SCCmec type이 다를 수 있기 때문에 그 기준에 따른 MRSA 감염 예방을 위한 소독제 및 살균제 개발을 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것이라고 사료된다.
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