[논문]미생물을 이용한 L-트립토판 유래 방향족 화합물 생산 최근 연구

이지영; 이진호

doi:10.5352/jls.2020.30.10.919

미생물을 이용한 L-트립토판 유래 방향족 화합물 생산 최근 연구
Recent Research Progress in the Microbial Production of Aromatic Compounds Derived from L-Tryptophan 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.10, 2020년, pp.919 - 929

이지영 (경성대학교 식품응용공학부 식품생명공학전공) , 이진호 (경성대학교 식품응용공학부 식품생명공학전공)

초록
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방향족 화합물은 화학, 식품, 고분자, 화장품, 의약 산업 등에 이용되는 중요한 물질로, 현재까지 대부분 화학 합성법 또는 식물 추출법으로 만들어진다. 그러나, 화석 연료의 고갈, 지구 온난화, 환경규제의 강화, 식물자원의 과다한 채취 등의 많은 위협요인에 직면하면서 재생 가능한 생물자원을 이용한 미생물을 이용한 생물공학적 방법으로 방향족 화합물을 생산하는 것은 매우 유망한 대안이다. 대사공학이 합성생물학과 접목되면서, L-트립토판 생합성 경로 유래의 인공 생합성 경로가 재 구축되어 5-히드록시트립토판, 세로토닌, 멜라토닌, 7-염화-L-트립토판, 7-브로모-L-트립토판, 인디고, 인디루빈, 인돌-3-초산, 바이오라세인, 데옥시바이오라세인과 같은 다양한 고부가 화합물을 생산할 수 있게 되었다. 본 총설은 이러한 방향족 화합물의 특성, 용도, 생합성 경로를 요약하였다. 또한 방향족 화합물을 미생물을 이용하여 생산하기 위한 최신의 대사공학 전략과 생산 농도를 올리는데 제기되는 문제들을 극복하기 위한 해결방안 등을 정리하여 보고한다. 시스템 대사 공학에 기반한 균주 개발과 재생 가능한 생물자원을 사용한 배지 및 생물공정의 최적화가 이루어지면 방향족 화합물의 미생물 생산을 위한 상업적으로 실행 가능한 기술 개발을 가능하게 할 것으로 예상된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Aromatic compounds are widely used in the chemical, food, polymer, cosmetic, and pharmaceutical industries and are produced by mainly chemical synthesis using benzene, toluene, and xylene or by plant extraction methods. Due to many rising threats, including the depletion of fossil fuels, global warming, the strengthening of international environmental regulations, and the excessive harvesting of plant resources, the microbial production of aromatic compounds using renewable biomass is regarded as a promising alternative. By integrating metabolic engineering with synthetic and systems biology, artificial biosynthetic pathways have been reconstituted from L-tryptophan biosynthetic pathway in relevant microorganisms, such as Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum, enabling the production of a variety of value-added aromatic compounds, such as 5-hydroxytryptophan, serotonin, melatonin, 7-chloro-L-tryptophan, 7-bromo-L-tryptophan, indigo, indirubin, indole-3-acetic acid, violacein, and dexoyviolacein. In this review, we summarize the characteristics, usage, and biosynthetic pathways of these aromatic compounds and highlight the latest metabolic engineering strategies for the microbial production of aromatic compounds and suitable solution strategies to overcome problems in increasing production titers. It is expected that strain development based on systems metabolic engineering and the optimization of media and bioprocesses using renewable biomass will enable the development of commercially viable technologies for the microbial production of many aromatic compounds.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Schematic representation of artificial biosynthetic routes in microorganisms for production of aromatic compounds derived from L-tryptophan. PEP and E4P mean phosphoenolpyruvate and erythrose-4-phosphate, respectively. Linear and dashed lines mean a single-step and multi-steps, respectively.
표 Table 1. Microbial production of aromatic compounds derived from L-tryptophan
그림 Fig. 2. Artificial biosynthetic pathways for the synthesis of 5-hydroxytryptophan, serotonin, and melatonin. Linear and dashed lines mean a single-step and multi-steps, respectively. TPH, TDC, AAAD, T5H, SNAT, ASMT, COMT, BH4, and MH4 are tryptophan 5-hydroxylase, tryptophan decarboxylase, aromatic amino acid decarboxylase, tryptamine 5-hydroxylase, serotonin N-acetyltransferase, N-acetylserotonin O-methyltransferase, caffeic acid O-methyltransferase, tetrahydrobiopterin, and tetrahydromonapterin, respectively.
그림 Fig. 3. Artificial biosynthetic pathway for the synthesis of 7-chloro-L-tryptophan and 7-bromo-L-tryptophan. PrnA and RebH are FAD-dependent halogenases. RebF and Fre are NADH-dependent flavin reductases.
그림 Fig. 4. Artificial biosynthetic pathways for the synthesis of indigo and indirubin. TnaA, FMO, UGT1, Bgl are tryptophanase, flavin-containing monooxygenase, glucosyltransferase, and β-glucosidase, respectively.
그림 Fig. 5. Artificial biosynthetic pathways for the synthesis of indole-3-acetic acid. AspC, IpdC, Iad1, IaaM, and IaaH are aminotransferase, indole-3-pyruvate decarboxylase, indole-3-acetaldehyde dehydrogenase, tryptophan-2-monooxygenase, and indole-3-acetamide hydrolase, respectively.
그림 Fig. 6. Artificial biosynthetic pathways for the synthesis of violacein and deoxyviolacein. VioA, VioB, VioE, VioD, and VioC are tryptophan oxidase, iminophenyl-pyruvate dimer synthase, violacein biosynthesis enzyme, protodeoxyviolaceinate monooxygenase, and violacein synthase, respectively.

AI 본문요약
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문제 정의

1). 따라서, 본 논문은 L-트립토판에서 유래되는 다양한 기능성 방향족 화합물을 미생물을 이용하여 개발 및 생산하는 연구에 관한 최신의 대사공학 전략과 생산농도를 올리는데 제기되는 현안을 해결하기 위한 전략 등을 정리하여 보고한다(Table 1).

제안 방법

coli를 대사공학적으로 개발하였다[10]. 7개의 aldehyde reductase 유전자가 결손된 RARE 균주에 trpR을 추가적으로 결손한 후, 플라스미드에 Saccharomyces cerevisiae 유래의 aminotransferase를 암호화하는 aro8 유전자와 decarboxylase를 암호화하는 kdc 유전자, E. coli 유래의 aldehyde dehydrogenase를 암호화하는 aldH, trpABCD 유전자, 되먹임-내성 aroG, trpE, serA 유전자를 각각 발현하였다(Table 1). 최종적으로 개발된 균을 사용하여 변형된 M9 배지에서 플라스크 발효한 결과, 20 g/l의 포도당을 소비하여 744 mg/l IAA가 생산되었다.
glutamicum을 이용하여 Ch. violaceum 유래의 vioBAECD operon 형태로 발현을 최적화 및 유도 발현하여, 3-L 생물배양기에서 유가식 배양하여 현재까지 가장 높은 수준인 5.436 g/l violacetin을 생산하는 기술을 개발하였다[34].
coli와 배양 공정을 개발하였다[27]. 기질 특이성이 변화된 Cupriavidus taiwanensis 유래의 변이 aromatic amino acid hydroxylase (W192F/F197L/E219C) 유전자와 사람유래의 BH4 재생경로를 tnaA가 결손된 E. coli에 도입하여 유가식 배양을 통해 962 mg/l 5-HTP를 생산하였다. 그런데 5-HTP로부터 세로토닌을 합성하는 TDC 효소가 L-트립토판을 기질로 사용하여 tryptamine이 먼저 만들어질 수 있기 때문에, 이를 방지하기 위해 5-HTP를 함유한 배양액을 분리한 후에 Catharanthus roseus 유래의 TDC를 암호화하는 유전자를 발현하여 52시간 배양하는 2단계 배양 공정을 통해 154 mg/l 세로토닌을 생산하는 기술을 개발하였다[27](Table 1).
coli에서 발현할 때 N-말단 일부를 제거한 형태로 도입하여 단백질의 안정적인 생산과 효소활성을 향상시켰으며, 조효소인 BH4를 공급하기 위해 사람 유래의 BH4 생합성(GTP cyclohydrolase, 6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase 및 sepiapterin reductase 효소촉매) 및 재생경로(pterin4a-carbinolamine dehydratase 및 dihydropteridine reductase 효소촉매) 관련 유전자들을 동시에 도입하였다[38]. 또한 트립토판 오페론을 플라스미드에서 발현하고 염색체 내 trytopha-nase 유전자인 tnaA를 결손한 E. coli를 제작하였다. 그 결과, 플라스크에서 1.
glutamicum에 도입하여 생물공학적 방법으로 7-Cl-Trp과 7-Br-Trp을 생산하는 기술을 개발하였다[36, 37]. 먼저 전구체인 L-트립토판의 공급을 강화하기 위해 염색체에 되먹임-내성(feedback-resistant) anthranilate synthase를 암호화하는 변이 trpE의 도입, chorismate mutase를 암호화하는 csm 결손, E. coli 유래의 되먹임-내성 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase를 암호화하는 변이 aroG 도입을 통해 TP679를 개발하였다[37]. 이 균주에 플라스미드 형태로 E.
coli 염색체에 도입하여 arabinose 유도조건에서 발현되는 dVio-1 균주를 제작하여 평가한 결과 176 mg/l deoxyviolacein이 생산되는 것을 확인하였다[30]. 여기에 전구물질인 트립토판의 공급을 원활히 하기 위해 염색체내 trpR 결손, tnaA 결손, sdaA 결손, aroFBL 과발현, trpL 결손, 되먹임-내성 trpE 도입, tktA 과발현, 되먹임-내성 serA가 도입된 dVio-6균주를 제작하였으며, 이를 생물배양기에서 배양하여 324 mg/l deoxyviolacein이 생산되었다(Table 1). 또한 violacein을 생산하는 균을 제작하기 위해 Janthinobacterium lividum 유래의 vioD를 추가적으로 염색체에 도입된 Vio-4균주를 개발하여 생물배양기에서 유가식 배양한 결과 710 mg/l violacein이 축적되는 결과를 얻었다.
coli 유래의 되먹임-내성 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase를 암호화하는 변이 aroG 도입을 통해 TP679를 개발하였다[37]. 이 균주에 플라스미드 형태로 E. coli 유래의 trpD를 발현하여 L-트립토판 생산균주를 개발하였다(Table 1). 탄소 공급원으로 포도당을, 염소 공급원으로 CaCl₂를 첨가한 조건에서 플라스크 발효한 결과, 108 mg/l 7-Cl-Trp이 축적되었다.

성능/효과

coli를 제작하였다. 그 결과, 플라스크에서 1.3 g/l 5-HTP가 생산되었으며, 10-L 생물배양기에서 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 유가식(fed-bacth)배양을 통해 5.1 g/l 5-HTP가 배양액에 축적되었다(Table 1). 한편 E.
여기에 전구물질인 트립토판의 공급을 원활히 하기 위해 염색체내 trpR 결손, tnaA 결손, sdaA 결손, aroFBL 과발현, trpL 결손, 되먹임-내성 trpE 도입, tktA 과발현, 되먹임-내성 serA가 도입된 dVio-6균주를 제작하였으며, 이를 생물배양기에서 배양하여 324 mg/l deoxyviolacein이 생산되었다(Table 1). 또한 violacein을 생산하는 균을 제작하기 위해 Janthinobacterium lividum 유래의 vioD를 추가적으로 염색체에 도입된 Vio-4균주를 개발하여 생물배양기에서 유가식 배양한 결과 710 mg/l violacein이 축적되는 결과를 얻었다. Zhou 등은 E.
coli에서 발현이 잘 안되거나 활성이 매우 낮은 문제점이 있다[3]. 이를 해결하기 위해 다양한 출처의 유전자를 발현하여 평가한 결과, 양 유래의 SNAT 유전자와 벼 유래의 COMT유전자를 E. coli에서 동시에 발현한 결과 1.46 mg/l 멜라토닌이 생성되었다(Table 1).
coli 유래의 aldehyde dehydrogenase를 암호화하는 aldH, trpABCD 유전자, 되먹임-내성 aroG, trpE, serA 유전자를 각각 발현하였다(Table 1). 최종적으로 개발된 균을 사용하여 변형된 M9 배지에서 플라스크 발효한 결과, 20 g/l의 포도당을 소비하여 744 mg/l IAA가 생산되었다.
coli 유래의 trpD를 발현하여 L-트립토판 생산균주를 개발하였다(Table 1). 탄소 공급원으로 포도당을, 염소 공급원으로 CaCl₂를 첨가한 조건에서 플라스크 발효한 결과, 108 mg/l 7-Cl-Trp이 축적되었다. FADH-dependent halogenase는 염소뿐만 아니라 브롬을 기질로 이용할 수 있다(Fig.

후속연구

glutamicum과 같은 미생물에 도입하여 생물공학적으로 이들 화합물들을 생산할 수 미생물이 개발되었으며, 상세한 유전적인 특징을 정리하였다. 향후 관련 대사경로의 추가적인 유전자 조작과 재생 가능한 자원을 탄소원으로 이용할 수 있는 균을 개발하면, 기존의 생산공정과 비교하여 보다 더 경제적으로 효율적으로 생산할 수 있는 미생물과 생산공정을 개발할 수 있을 것으로 기대한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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