[국내논문]나노방출제어시스템을 이용한 trichloroacetic acid와 epidermal growth factor 방출이 세포골격형성 유전자 발현에 미치는 영향 분석 Analysis of the effect of trichloroacetic acid and epidermal growth factor release on cytoskeleton gene expression using the nano-controlled releasing system원문보기
목적: 본 연구에서는 나노방출제어시스템을 이용하여 trichloroacetic acid (TCA) 및 epidermal growth factor (EGF)를 인간치은섬유아세포에 적용하였을 때, 나타나는 액틴세포골격과 관련된 유전자 발현의 변화 양상을 확인하고자 하였다. 재료 및 방법: TCA와 EGF가 조절방출될 수 있도록 만들어진 나노방출제어시스템을 이용하였다. 인간치은섬유아세포에 TCA만 적용된 군(EXP1), TCA와 EGF가 적용된 군(EXP2), 대조군(CON)의 3가지 군으로 나누어 48시간 배양하였다. Real-time PCR을 이용하여 액틴 세포골격과 관련된 유전자 26개의 발현 양상을 분석하였다. 피어슨상관관계분석을 통해 유전자들의 상관관계와 영향요인을 확인하였다. 결과: 액틴 세포골격과 관련된 유전자 26개 중 23개가 EXP1과 EXP2에서 상향조절되었고, 이 중 14개는 EXP1에 비하여 EXP2에서 유의미한 발현량 증가를 보였다. LPAR1은 EXP1에서만 하향조절되었고, GNA13은 EXP2에서만 상향조절되었고, F2R은 EXP2에서만 하향조절되었다. 액틴 단백질의 유전자 발현에 대하여 Rac1관련 유전자 중 3개와 CDC42가 가장 큰 영향요인으로 확인되었다. 결론: 인간치은섬유아세포의 액틴 세포골격 관련 유전자들은 나노방출제어시스템을 통하여 조절 방출된 TCA와 EGF에 의해 대부분 상향조절되었다.
목적: 본 연구에서는 나노방출제어시스템을 이용하여 trichloroacetic acid (TCA) 및 epidermal growth factor (EGF)를 인간치은섬유아세포에 적용하였을 때, 나타나는 액틴 세포골격과 관련된 유전자 발현의 변화 양상을 확인하고자 하였다. 재료 및 방법: TCA와 EGF가 조절방출될 수 있도록 만들어진 나노방출제어시스템을 이용하였다. 인간치은섬유아세포에 TCA만 적용된 군(EXP1), TCA와 EGF가 적용된 군(EXP2), 대조군(CON)의 3가지 군으로 나누어 48시간 배양하였다. Real-time PCR을 이용하여 액틴 세포골격과 관련된 유전자 26개의 발현 양상을 분석하였다. 피어슨상관관계분석을 통해 유전자들의 상관관계와 영향요인을 확인하였다. 결과: 액틴 세포골격과 관련된 유전자 26개 중 23개가 EXP1과 EXP2에서 상향조절되었고, 이 중 14개는 EXP1에 비하여 EXP2에서 유의미한 발현량 증가를 보였다. LPAR1은 EXP1에서만 하향조절되었고, GNA13은 EXP2에서만 상향조절되었고, F2R은 EXP2에서만 하향조절되었다. 액틴 단백질의 유전자 발현에 대하여 Rac1관련 유전자 중 3개와 CDC42가 가장 큰 영향요인으로 확인되었다. 결론: 인간치은섬유아세포의 액틴 세포골격 관련 유전자들은 나노방출제어시스템을 통하여 조절 방출된 TCA와 EGF에 의해 대부분 상향조절되었다.
Purpose: Here, we verified that the actin cytoskeletal gene expression of human gingival fibroblasts was altered by the administration of trichloroacetic acid (TCA) and epidermal growth factor (EGF) using the nano-controlled releasing system. Materials and methods: The control and experimental group...
Purpose: Here, we verified that the actin cytoskeletal gene expression of human gingival fibroblasts was altered by the administration of trichloroacetic acid (TCA) and epidermal growth factor (EGF) using the nano-controlled releasing system. Materials and methods: The control and experimental groups were divided into 3 groups: the group with the TCA-only nano-controlled releasing system (EXP1), the group with the TCA- and EGF nano-controlled releasing system (EXP2), and the control group (CON) with 48-h incubation. Expression of 26 genes involved in the regulation of actin cytoskeleton were analyzed by real-time PCR followed by the determination of correlations and influential factors using the Pearson correlation analysis and multiple regression analysis. Results: Among 23 genes upregulated in EXP1 and EXP2, expression of 14 genes were significantly increased in EXP2 compared to EXP1. On the other hand, LPAR1 was downregulated only in EXP1, GNA13 was upregulated only in EXP2, and F2R was downregulated only in EXP2. Three Rac1-related genes and CDC42 were identified as the influential factors of the actin gene upregulation. Conclusion: The actin cytoskeleton genes in human gingival fibroblast were upregulated by the administration of TCA and EGF using HGC-based nano-controlled releasing system.
Purpose: Here, we verified that the actin cytoskeletal gene expression of human gingival fibroblasts was altered by the administration of trichloroacetic acid (TCA) and epidermal growth factor (EGF) using the nano-controlled releasing system. Materials and methods: The control and experimental groups were divided into 3 groups: the group with the TCA-only nano-controlled releasing system (EXP1), the group with the TCA- and EGF nano-controlled releasing system (EXP2), and the control group (CON) with 48-h incubation. Expression of 26 genes involved in the regulation of actin cytoskeleton were analyzed by real-time PCR followed by the determination of correlations and influential factors using the Pearson correlation analysis and multiple regression analysis. Results: Among 23 genes upregulated in EXP1 and EXP2, expression of 14 genes were significantly increased in EXP2 compared to EXP1. On the other hand, LPAR1 was downregulated only in EXP1, GNA13 was upregulated only in EXP2, and F2R was downregulated only in EXP2. Three Rac1-related genes and CDC42 were identified as the influential factors of the actin gene upregulation. Conclusion: The actin cytoskeleton genes in human gingival fibroblast were upregulated by the administration of TCA and EGF using HGC-based nano-controlled releasing system.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구의 목적은 TCA와 EGF를 HGC기반 나노방출제어시스템을 이용하여 인간치은섬유아세포에 조절방출 하였을 때, 액틴 세포골격과 관련된 유전자 발현의 변화양상을 규명하는데 있다.
제안 방법
2 - 3번의 세포주기 동안 배양된 인간치은섬유아세포가 이 실험에 사용되었다. TCA가 담지된 나노방출제어시스템군(EXP1), TCA와 EGF가 각각 담지된 나노방출제어시스템군(EXP2), 대조군(CON)의 3그룹으로 나누고, 그룹당 5개의 well 을 만들어 총 15개의 well에 인간치은섬유아세포를 접종하였다. 세포 밀도가 well당 1 × 104개가 유지되도록 하면서 37℃, 95% 의 O2, 5% CO2 조건에서 48시간 배양한 후 Trizol lysis solution (TRIZOL® REAGENT, GIBCO BRL, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다.
본 연구에서는 HGC기반 나노방출제어시스템을 이용한 TCA와 HGC의 조절방출이 인간치은섬유아세포의 액틴 세포골격의 발현을 유도함을 세포수준에서 확인하였다. 이를 통해 인간의 치은조직 재생효과에 대한 가능성이 확인되었다.
대상 데이터
ATCC (ATCC® PCS-201-018™, Manassas, VA, USA)에서 구입한 인간치은섬유아세포를 이용하여 세포 배양하였다. 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma-Aldrich Co.
데이터처리
Real-time PCR을 독립적으로 5번씩 반복 시행하여 평균값과 표준편차를 계산하였고, Kruskal-Wallis 검정으로 평균값을 비교하였으며, 사후검정을 위해 본페로니 검정 (Bonferroni correction)을 시행하였다. 피어슨상관관계 분석으로 실험결과 간 상관관계를 분석하였다.
Real-time PCR을 독립적으로 5번씩 반복 시행하여 평균값과 표준편차를 계산하였고, Kruskal-Wallis 검정으로 평균값을 비교하였으며, 사후검정을 위해 본페로니 검정 (Bonferroni correction)을 시행하였다. 피어슨상관관계 분석으로 실험결과 간 상관관계를 분석하였다. ACTB, ACTG1, ACTR2, ACTR3에 통계학적으로 유의한 영향을 미치는 세포골격유전자를 결정하기 위하여 stepwise method를 사용한 다중회귀분석(stepwise multiple regression analysis)을 사용하였다.
피어슨상관관계 분석으로 실험결과 간 상관관계를 분석하였다. ACTB, ACTG1, ACTR2, ACTR3에 통계학적으로 유의한 영향을 미치는 세포골격유전자를 결정하기 위하여 stepwise method를 사용한 다중회귀분석(stepwise multiple regression analysis)을 사용하였다. 모든 통계분석에는 SPSS 18.
이론/모형
Real-time PCR을 통해 분석한 유전자들은 Table 1에 정리되어 있다. iQ Supermix (Bio-Rad)를 이용하여 Chromo4 reverse transcription-polymerase chain reactions (Bio-Rad Lab-oratories, Hemel Hempstead, UK)를 시행한 후, 그 유전자 발현량을 MJ Opticon Monitor Analysis Software (Bio-Rad)를 이용하여 정량화 하였다. 측정된 값들은 GAPDH 발현량으로 보정하였고, EXP1과 EXP2의 발현수준은 CON의 상대적인 배수로 표시하였다.
성능/효과
액틴 단백질 유전자에 가장 중요한 영향을 미치는 유전자를 규명하기 위해 ACTB, ACTG1, ACTR2, ACTR3의 유전자 발현 결과들을 각각 종속변수로 사용하고, LPAR1, CXCR4, F2R, GNA12, GNA13, ARHGEF1, RHOA, ROCK1, SOS1, SOS2, KRAS, PIK3CB, PTK2, BCAR1, CRK, DOCK1, RAC1, GNB1, GNG2, FGD1, FGD3, CDC42의 유전자 발현 결과들을 독립변수로 사용하여 시행한 다중회귀분석에서는 GNA12, GNA13, ARHGEF1, RHOA, ROCK1, SOS1, SOS2, KRAS, PIK3CB, CRK, DOCK1, RAC1, CDC42, ACTR3가 영향요인으로 선정되었다. 이 중 ACTB, ACTG1, ACTR2, ACTR3의 유전자 발현에 대해 RAC1, CDC42, SOS2, KRAS이 각각 가장 큰 영향요인 으로 확인되었다 (Table 2).
GNA13은 GNA12와 같이 세포기능을 조절하는 세포 내 신호전달에 관여하는 단백질을 발현 하며15, EXP2에서만 상향조절 되었다. CXCR4와 GNA13이 보인 EXP2에서의 유의미한 증가는 TCA와 EGF가 함께 방출될 때 액틴 세포골격 유전자들의 상향조절 효과가 더 커지는 것을 의미한다. 반면, 다른 RhoA관련 유전자인 LPAR1은 EXP1에서 하향조절되었고, EXP2에서는 대조군에 비하여 유의미한 발현량 차이를 보이지 않았다.
액틴 유전자들의 가장 큰 영향요인을 분석하기 위한 피어슨상관관계 분석에서 RAC1, CDC42, SOS2, KRAS이 각각 ACTB, ACTG1, ACTR2, ACTR3 발현증가의 가장 큰 영향요인으로 확인되었다. 이 4개의 유전자들 중에서 RAC1, SOS2, KRAS는 Rac1과 관련된 유전자들이므로, 위의 피어슨상관관계 분석결과는 TCA와 EGF의 조절방출로 인해 Rac1과 관련된 유전자들이 가장 상향조절되었음을 의미하며, 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
후속연구
F2R은 응고인자의 수용기를 암호화하고 있어 응고와 염증 사이의 상호작용을 매개하는 데 중요한 역할을 하며, 억제 시 조혈분화를 촉진한다고20 알려져 있다. 따라서 TCA와 EGF의 조절방출과 F2R의 하향조절 및 조혈분화 촉진간의 관계에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 위의 유전자 발현양상의 변화는 HGC기반 나노방출제어시스템을 이용한 TCA 및 EGF의 순차적 조절방출로 인간치은섬유아세포의 운동성 증가, 세포활성 증가 및 세포분열 증가를 유도할 수 있음을 시사한다.
액틴 유전자들의 가장 큰 영향요인을 분석하기 위한 피어슨상관관계 분석에서 RAC1, CDC42, SOS2, KRAS이 각각 ACTB, ACTG1, ACTR2, ACTR3 발현증가의 가장 큰 영향요인으로 확인되었다. 이 4개의 유전자들 중에서 RAC1, SOS2, KRAS는 Rac1과 관련된 유전자들이므로, 위의 피어슨상관관계 분석결과는 TCA와 EGF의 조절방출로 인해 Rac1과 관련된 유전자들이 가장 상향조절되었음을 의미하며, 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이를 통해 인간의 치은조직 재생효과에 대한 가능성이 확인되었다. 향후 동물모델과 전 임상규명을 통한 생체 내 연구를 통해 TCA와 EGF의 구내 적용 가능성을 확인할 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
chemical regeneration of skin scars는 어떤 치료법인가?
피부과에서 흔히 사용되는 피부재생치료 중 하나인 chemical regeneration of skin scars (CROSS)는 넓어진 모공 혹은 흉터에 고농도 trichloroacetic acid (TCA)를 단독으로 도포하거나 다른 물질과 혼합하여 도포하는 치료방법이다.7 피부과학에서와 달리, 치의학에서는 강산인 TCA의 구내 적용이 제한적일 수밖에 없다.
세포골격를 굵기에 따라 분류하면 어떤 종류로 나뉘는가?
세포골격은 섬유로 이루어진 그물형태의 세포 지지구조이다. 세포골격은 굵기에 따라 미세섬유(액틴 섬유, microfilament), 미세소관(microtubule) 및 중간섬유(intermediate filament)로 구성되어 있다. 이 중 가장 얇은 미세섬유는 액틴(actin) 단백질로 구성되어 있어 액틴 섬유라고도 불린다.
Rho 단백질군과 GTP의 결합에 의한 하위 인자들의 활성화가 세포형태에 영향을 미치는 예시에는 어떤 것들이 있는가?
Rho 단백질군이 GTP (guanosine triphosphate)와 결합하여 활성화 상태가 되면, 하위 인자들(downstream effectors)이 활성화되고, 활성화되는 인자들에 따라 세포형태가 변하게 된다.4 예를 들어, RhoA가 활성화되면 액틴과 미오신 다발이 형성되고, 이 섬유다발은 세포의 국소접착(focal adhesion)에 관여한다. Rac1이 활성화되면 피막돌기(lamellipodia)같은, 액틴으로 이루어진 주름 모양의 돌출부가 형성된다. CDC42가 활성화되면 사상위족(filopodia)같은, 뾰족한 세포 돌출부가 형성된다.4 이외에도 Rho 단백질군은 세포내 함입, 유전자의 전사조절, 세포증식과 형질전환에 연관되어 있다.
참고문헌 (33)
Hardin J, Bertoni G, Kleinsmith LJ. Becker's World of the cell. 8th ed. New York: Pearson; 2015. p. 422-46.
Fishkind DJ, Wang YL. New horizons for cytokinesis. Curr Opin Cell Biol 1995;7:23-31.
Lamarche N, Tapon N, Stowers L, Burbelo PD, Aspenstrom P, Bridges T, Chant J, Hall A. Rac and Cdc42 induce actin polymerization and G1 cell cycle progression independently of p65PAK and the JNK/SAPK MAP kinase cascade. Cell 1996;87:519-29.
Lee JB, Chung WG, Kwahck H, Lee KH. Focal treatment of acne scars with trichloroacetic acid: chemical reconstruction of skin scars method. Dermatol Surg 2002;28:1017-21.
Yasar S, Mansur AT, Serdar ZA, Goktay F, Aslan C. Treatment of focal epithelial hyperplasia with topical imiquimod: report of three cases. Pediatr Dermatol 2009;26:465-8.
Heithersay GS, Wilson DF. Tissue responses in the rat to trichloracetic acid-an agent used in the treatment of invasive cervical resorption. Aust Dent J 1988;33:451-61.
Park KM. A study based on sequential tissue coagulationproliferation nano controlled release system for oral soft tissue regeneration. Master's thesis. Department of Dentistry, Graduate School, Kyung Hee University. 2019.
Lee K. Evaluation of the effect on oral soft tissue regeneration of the trichloroacetic acid in cellular models-a gene expression profiling study, Master's thesis. Department of Dentistry, Graduate School, Kyung Hee University. 2018.
Ridley AJ, Paterson HF, Johnston CL, Diekmann D, Hall A. The small GTP-binding protein rac regulates growth factorinduced membrane ruffling. Cell 1992;70:401-10.
Yamamoto M, Marui N, Sakai T, Morii N, Kozaki S, Ikai K, Imamura S, Narumiya S. ADP-ribosylation of the rhoA gene product by botulinum C3 exoenzyme causes Swiss 3T3 cells to accumulate in the G1 phase of the cell cycle. Oncogene 1993;8:1449-55.
Caruz A, Samsom M, Alonso JM, Alcami J, Baleux F, Virelizier JL, Parmentier M, Arenzana-Seisdedos F. Genomic organization and promoter characterization of human CXCR4 gene. FEBS Lett 1998;426:271-8.
Kiss C, Li J, Szeles A, Gizatullin RZ, Kashuba VI, Lushnikova T, Protopopov AI, Kelve M, Kiss H, Kholodnyuk ID, Imreh S, Klein G, Zabarovsky ER. Assignment of the ARHA and GPX1 genes to human chromosome bands 3p21.3 by in situ hybridization and with somatic cell hybrids. Cytogenet Cell Genet 1997;79:228-30.
Choi JW, Herr DR, Noguchi K, Yung YC, Lee CW, Mutoh T, Lin ME, Teo ST, Park KE, Mosley AN, Chun J. LPA receptors: subtypes and biological actions. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2010;50:157-86.
Yue R, Li H, Liu H, Li Y, Wei B, Gao G, Jin Y, Liu T, Wei L, Du J, Pei G. Thrombin receptor regulates hematopoiesis and endothelial-to-hematopoietic transition. Dev Cell 2012;22:1092-100.
Webb GC, Jenkins NA, Largaespada DA, Copeland NG, Fernandez CS, Bowtell DD. Mammalian homologues of the Drosophila Son of sevenless gene map to murine chromosomes 17 and 12 and to human chromosomes 2 and 14, respectively. Genomics 1993;18:14-9.
Tsuchida N, Ryder T, Ohtsubo E. Nucleotide sequence of the oncogene encoding the p21 transforming protein of Kirsten murine sarcoma virus. Science 1982;217:937-9.
Hu P, Mondino A, Skolnik EY, Schlessinger J. Cloning of a novel, ubiquitously expressed human phosphatidylinositol 3-kinase and identification of its binding site on p85. Mol Cell Biol 1993;13:7677-88.
Chan KT, Cortesio CL, Huttenlocher A. FAK alters invadopodia and focal adhesion composition and dynamics to regulate breast cancer invasion. J Cell Biol 2009;185:357-70.
Mayer BJ, Hanafusa H. Association of the v-crk oncogene product with phosphotyrosine-containing proteins and protein kinase activity. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:2638-42.
Zhou C, Licciulli S, Avila JL, Cho M, Troutman S, Jiang P, Kossenkov AV, Showe LC, Liu Q, Vachani A, Albelda SM, Kissil JL. The Rac1 splice form Rac1b promotes K-rasinduced lung tumorigenesis. Oncogene 2013;32:903-9.
Ogorodnikov A, Levin M, Tattikota S, Tokalov S, Hoque M, Scherzinger D, Marini F, Poetsch A, Binder H, Macher- Goppinger S, Probst HC, Tian B, Schaefer M, Lackner KJ, Westermann F, Danckwardt S. Transcriptome 3'end organization by PCF11 links alternative polyadenylation to formation and neuronal differentiation of neuroblastoma. Nat Commun 2018;9:5331.
Egorov MV, Capestrano M, Vorontsova OA, Di Pentima A, Egorova AV, Mariggio S, Ayala MI, Tete S, Gorski JL, Luini A, Buccione R, Polishchuk RS. Faciogenital dysplasia protein (FGD1) regulates export of cargo proteins from the golgi complex via Cdc42 activation. Mol Biol Cell 2009;20:2413-27.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.