[논문]EMS 유도 내염성 증진 사료용 옥수수 돌연변이체 선발 및 특성 분석

조철오; 김경화; 서미숙; 최만수; 전재범; 진민아; 김둘이

doi:10.7740/kjcs.2020.65.4.406

EMS 유도 내염성 증진 사료용 옥수수 돌연변이체 선발 및 특성 분석
Development and Characterization of EMS-induced Mutants with Enhanced Salt Tolerance in Silage Maize 원문보기

Korean journal of crop science = 韓國作物學會誌, v.65 no.4, 2020년, pp.406 - 415

조철오 (농촌진흥청 국립식량과학원 작물기초기반과) , 김경화 (농촌진흥청 국립식량과학원 작물기초기반과) , 서미숙 (농촌진흥청 국립식량과학원 작물기초기반과) , 최만수 (농촌진흥청 국립식량과학원 작물기초기반과) , 전재범 (농촌진흥청 국립식량과학원 작물기초기반과) , 진민아 (농촌진흥청 국립식량과학원 작물기초기반과) , 김둘이 (농촌진흥청 국립식량과학원 작물기초기반과)

초록
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본 연구는 간척지 내 재배 가능한 내염성 사료용 옥수수를 선발하기 위해 EMS를 이용하여 돌연변이 집단을 구축하고 기내 선발 방법을 통해 내염성 증진 계통을 선발하였고, 연구결과는 다음과 같다. 1. 사료용 옥수수 모본인 KS140에 다양한 조건으로 EMS를 처리하여 발아율 및 식물의 생육 상태를 조사하였고, 발아율에는 영향을 미치지 않으면서 생육에 큰 영향을 주지않는 0.5% EMS를 돌연변이 유도 적정 농도로 선정하였다. 2. 기내 선발 방법을 통해 선발된 내염성 증진 계통 140ES91 계통을 이용하여 0.5% 염분 스트레스 처리 후 표현형을 조사한 결과, 대조군인 KS140 대비 식물의 초장 및 근장의 생육이 양호하였으며, 높은 proline 함량과 기공전도도를 보였다. 따라서 염분 스트레스 시 높은 proline 함량과 기공전도도가 140ES91 계통의 증가된 내염성과 관련이 있을 것으로 판단된다. 3. 내염성 증진 140ES91 계통의 유전변이 분석을 통해 유전자 기능에 영향을 미칠 수 있는 아미노산 변이를 유발하는 39개의 변이 유전자를 확인하였고, 변이 유전자와 내염성의 관계를 증명하기 위한 유전자 기능 분석이 요구된다. 4. 기 보고된 내염성 관련 유전자들의 발현 양상을 조사한 결과 ABP9과 CIPK31 유전자는 대조군 대비 염분 스트레스 처리 전후 140ES91 계통에서 높은 발현율을 보였으며, CIPK21 유전자는 염분 스트레스 처리 후 대조군에는 발현이 감소하나 140ES91 계통에서는 발현이 유지됨을 확인하였다. 따라서 140ES91 계통에서 보이는 내염성 관련 유전자들의 높은 발현율이 140ES91 계통의 내염성에 관여할 것으로 판단된다. 5. 이상의 결과 기내 선발 방법을 통해 선발한 내염성 증진 계통은 간척지와 같은 염류집적 토양에서 작물의 안정적인 재배와 생산이 가능한 내염성 증진 품종 개발의 육종소재로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Maize (Zea mays L.) is one of the most valuable agricultural crops and is grown under a wide spectrum of environmental conditions. However, maize is moderately sensitive to salt stress, and soil salinity is a serious threat to its production worldwide. In this study, we used ethyl methane sulfonate (EMS) to generate salt-tolerant silage maize mutants. We screened salt-tolerant lines from 203 M3 mutant populations by evaluating the morphological phenotype after salt stress treatment and selected the 140ES91 line. The 140ES91 mutant showed improved plant growth as well as higher proline content and leaf photosynthetic capacity compared with those of wild-type plants under salt stress conditions. Using whole-genome re-sequencing analysis, 1,103 single nucleotide polymorphisms and 71 insertions or deletions were identified as common variants between KS140 and 140ES91 in comparison with the reference genome B73. Furthermore, the expression patterns of three genes, which are involved in salt stress responses, were increased in the 140ES91 mutant under salt stress. Taken together, the mutant line identified in our study could be used as an improved breeding material for transferring salt tolerance traits in maize varieties.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Optimizaiton for EMS treatment of KS140. (A) Seed germination rate. Plant were grown for 7 days on magenta box containing 0, 0.5, or 0.7% EMS. (B) Shoot length. Error bars represent the standard deviation of three replicates.
그림 Fig. 2. Development of the mutagenized maize population. Schematic diagram of the experimental procedures for selecting an EMS-mutagenized salt-tolerant lines.
그림 Fig. 3. Phenotype analysis of KS140 and 140ES91 after salt stress. (A) Morphological phenotype of KS140 and 140ES91 after 0.5% NaCl treatment. Stem length (B) and root length (C) of KS140 and 140ES91 after in response to salt stress. Data are means ±SD determined from three independent biological replicates. Asterisks denote statistical significance at p < 0.01 (**) by Student’s t-test. Scale bar: 1 cm.
그림 Fig. 4. Effect of salt stress on proline contents and stomatal conductance of KS140 and 140ES91. Proline contents (A) and stomatal conductance (B) of KS140 and 140ES91. Data are means ±SD determined from three independent biological replicates. Different letters indicate a significant difference determined by one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test (p < 0.05).
그림 Fig. 5. Annotation of SNPs and InDels identified between KS140 and 140ES91. SNPs and InDels were classified as genic and intergenic based on the annotations of B73 reference genome (http://plants.ensembl.org/Zea_mays/Info/Index, AGPv4, RefGen_v4). The numbers and proportions of mutations are shown on the graph.
표 Table 1. List of non-synonymous variants identified through re-sequencing in 140ES91 salt-tolerant line.
그림 Fig. 6. qRT-PCR analysis of salt stress responsive genes in KS140 and 140ES91. For salt stress treatment, each seeds were sown in medium with or without 0.5% NaCl. Data are means ±SD determined from three independent biological replicates. Different letters indicate a significant difference determined by one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test (p < 0.05). ABP, ABA-responsiveelement- binding protein 9; CIPK21, CBL-interacting protein kinase 21; CIPK31, CBL-interacting protein kinase 31.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 간척지 내 재배 가능한 내염성 사료용 옥수수를 선발하기 위해 EMS를 이용하여 돌연변이 집단을 구축하고 기내 선발 방법을 통해 내염성 증진 계통을 선발하였고, 연구결과는 다음과 같다.
본 연구에서는 우리나라 우량 옥수수 자식계통인 KS140에 EMS를 처리하여 내염성 증진 옥수수 돌연변이 계통을 선발하고, 염분 스트레스에 대한 내염성 옥수수의 형태학적, 생물학적 반응 및 유전 변이를 분석하여 옥수수의 염분 스트레스 관련 기작을 규명하고자 하였다.

제안 방법

Genome Analysis Toolkit (GATK, version 3.5)의 HaplotypeCaller module을 이용하여 변이를 선발하고 VCF 파일을 작성하였다.
KS140과 140ES91 돌연변이 식물체를 0.5% NaCl이 첨가된 배지에 파종하여 기내배양실에서 일주일간 배양하였다.
1. 사료용 옥수수 모본인 KS140에 다양한 조건으로 EMS를 처리하여 발아율 및 식물의 생육 상태를 조사하였고, 발아율에는 영향을 미치지 않으면서 생육에 큰 영향을 주지않는 0.5% EMS를 돌연변이 유도 적정 농도로 선정하였다.
, 2005; Ashraf & Foolad, 2007). 140ES91 돌연변이체의 내염성을 조사하기 위해 염분 스트레스 처리 후 proline 함량을 조사하였다(Fig. 4A). KS140과 140ES91을 0.
식물은 염분 스트레스에 반응하여 특정 유전자 산물의 증가나 감소를 조절하는 다양한 메커니즘을 통해 내염성을 부여한다(Gupta & Huang, 2014). 140ES91에서 내염성 반응 유전자들의 발현 양상을 조사하기 위해 염분 스트레스 처리 후 qRT-PCR 분석을 수행하였다(Fig. 6). 무처리구에서 ABP9와 CIPK31은 KS140 대비 140ES91에서 높은 발현양을 보였으며, 염분 스트레스 처리 후에도 높은 발현양을 유지하였다.
EMS 독성으로 인한 종자의 손실없이 높은 돌연변이율을 달성하는데 필요한 EMS 적정 농도를 결정하기 위해 다양한 농도와 시간 조건에서 생육 상태를 조사하였다. EMS 적정 농도를 결정하기 위해 KS140 종자에 0, 0.
, 2015). EMS 유도 내염성 증진 돌연변이체 140ES91의 유전변이 탐색을 위해 전체 게놈 염기서열배분석(Whole genome re-sequencing)을 수행하였다. 염기서열재분석 결과를 통해 140ES91에서 유전자간(intergenic) 영역에서 1,024개와 유전자(genic) 영역에서 150개의 SNPs 및 InDels을 포함하는 유전변이가 확인되었다(Fig.
EMS 적정 농도를 결정하기 위해 KS140 종자에 0, 0.5 및 0.7%의 EMS를 각각 8시간과 12시간 처리하여 발아율 및 초장을 조사하였다(Fig. 1).
이 후 멸균수로 2번 세척하여 반응을 중지하였고, 종자의 중화 반응을 위해 12시간 동안 흐르는 물로 세척하였다. EMS 처리 후 종자 발아율과 초장을 조사하여 돌연변이 유발을 위한 적정 농도를 선정하였다. 발아율 조사를 위해 종자 소독 후 agar 배지에 치상하여 기내 배양실 25°C, 광주기 16/8시간(광/암) 조건에서 7일간 배양하였고, 초장을 조사하기 위해 50공 포트에 파종하여 온실에서 3주간 생육 후 일주일 간격으로 생육 상태를 조사하여 적정 농도를 선정하였다.
5% EMS를 12시간 처리하였다. EMS 처리 후 포장에 파종하여 발아 및 생육 상태가 불량한 개체를 제외하고 자가 교배 후 1,471 계통의 M₁ 종자를 수확하였다. 후세대 종자 상태가 양호한 계통들을 파종하여 2~3개월 후 자가 교배를 통해 997 계통의 M₂ 종자를 확보하였고, inbred 계통을 육성하기 위해 M₂ 계통을 자가 교배하여 203개의 M₃ 계통을 확보하였다.
EMS 처리에 의해 유발되는 유전 변이를 탐색하기 위해 전체 게놈 염기서열 재분석(Whole-genome re-sequencing)을 수행하였다. 대조군 KS140과 140ES91을 기내 배양실에서 일주일간 배양한 후 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, DE)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
9 parameter를 적용하여 선발하였다. KS140과 140 ES91을 표준 유전체 B73과 맵핑하여 발굴한 유전형 결과를 최종 비교하여 KS140으로부터 발생한 140ES91의 유전변이를 탐색하였다.
4A). KS140과 140ES91을 0.5% NaCl이 첨가된 배지에 파종하여 10일간 기내 배양실에서 배양 후 isatin 분석법으로 proline 함량을 조사하였다. 무처리구에서 KS140과 140ES91의 proline 함량은 유사한 수준을 보였으나, 염분 스트레스 처리 후 140ES91은 대조군(0.
(A) Seed germination rate. Plant were grown for 7 days on magenta box containing 0, 0.5, or 0.7% EMS. (B) Shoot length.
Quantitative RT-PCR은 TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Takara, Moriyama, JP)를 사용하여 수행하였다.
, 2010). 그러나 EMS 처리 돌연변이 유도 사료용 옥수수 돌연변이체들 중 내염성이 증진된 계통이 선발되어 이에 대한 내염성 증진 실험을 수행하였다. 선발된 내염성 140ES91 계통을 이용하여 기내 배양실 조건에서 염분 스트레스 처리 후 식물의 초장 및 근장을 조사하였다(Fig.
5% NaCl을 일주일 간격으로 3주간 처리 한 후 6~8엽을 이용하여 기공전도도를 측정하였다. 기공전도도는 휴대용 장치 SC-1 Leaf Porometer (ICT, New South Wales, AU)를 사용하여 잎의 뒷면에서 확산되는 수분을 측정하였다(Cho et al., 2019).
기내 선발된 내염성 계통 140ES91 돌연변이체에서 염분 스트레스 처리에 따른 생육 상태를 조사하기 위해 대조군인 KS140과 140ES91 종자를 하루 동안 물에 불린 후 0.5% NaCl이 첨가된 배지에 파종하였다. 초장 및 근장은 기내 파종 10일 후 조사하였다.
M₁ 집단을 자가 교배 후 세대를 진전하여 최종 203 계통의 M₃ 집단을 확보하였고, 자가 교배를 통해 후세대 종자를 확보하였다. 내염성 증진 계통 선발을 위해 각 계통의 종자를 50공 포트에 파종 후 0.7% NaCl을 처리하여 온실에서 3주간 재배하였다. 염 처리 3주후 대조군과 비교하여 양호한 생육상태를 보이는 내염성 계통을 선발하였다.
5% EMS를 12시간 처리하여 돌연변이를 유발하였다. 내염성 증진 계통 선발을 위해 종자를 파종 후 자가 교배를 통해 세대를 진전하여 1,471 계통의 M₁ 집단을 확보하였다. M₁ 집단을 자가 교배 후 세대를 진전하여 최종 203 계통의 M₃ 집단을 확보하였고, 자가 교배를 통해 후세대 종자를 확보하였다.
내염성 증진 계통 집단을 확보하기 위해 약 3,000립의 KS140 종자에 0.5% EMS를 12시간 처리하여 돌연변이를 유발하였다. 내염성 증진 계통 선발을 위해 종자를 파종 후 자가 교배를 통해 세대를 진전하여 1,471 계통의 M₁ 집단을 확보하였다.
본 연구에서는 국립식량과학원에서 육성한 사료용 옥수수 자식계통인 KS140 (우량 교잡계 품종 ‘강다옥’의 모본)을 사용하였다. 내염성 증진 돌연변이 집단을 육성하기 위한 EMS 적정 처리 농도를 결정하기 위해 KS140 종자 20개를 12시간 물에 불린 후 0, 0.5, 0.7% 농도의 EMS (Sigma, S t. Louis, MO)로 실온, 암상태에서 0, 8 및 12시간 처리한 후 EMS 반응 정지를 위해 10% sodium thiosulfate solution을 15분간 처리하였다. 이 후 멸균수로 2번 세척하여 반응을 중지하였고, 종자의 중화 반응을 위해 12시간 동안 흐르는 물로 세척하였다.
내염성 증진 옥수수 돌연변이체 집단을 육성하기 위해 KS140 종자 3,000립에 0.5% EMS를 12시간 처리하였다. EMS 처리 후 포장에 파종하여 발아 및 생육 상태가 불량한 개체를 제외하고 자가 교배 후 1,471 계통의 M₁ 종자를 수확하였다.
EMS 처리에 의해 유발되는 유전 변이를 탐색하기 위해 전체 게놈 염기서열 재분석(Whole-genome re-sequencing)을 수행하였다. 대조군 KS140과 140ES91을 기내 배양실에서 일주일간 배양한 후 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, DE)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 Illumina HiSeq X 장비를 사용하여 염기서열을 분석하였고, 생산된 염기서열 정보로부터 low quality 서열과 중복된 서열을 Trimmomatic (version 0.
01 mm)의 초장이 감소함을 확인하였다. 따라서 발아율에 영향을 미치지 않으면서 생육에 큰 지장을 초래하지 않는 0.5% EMS 농도와 처리 시간 12시간을 돌연변이 유발 조건으로 선정하였다.
발아율 조사를 위해 종자 소독 후 agar 배지에 치상하여 기내 배양실 25°C, 광주기 16/8시간(광/암) 조건에서 7일간 배양하였고, 초장을 조사하기 위해 50공 포트에 파종하여 온실에서 3주간 생육 후 일주일 간격으로 생육 상태를 조사하여 적정 농도를 선정하였다.
그러나 EMS 처리 돌연변이 유도 사료용 옥수수 돌연변이체들 중 내염성이 증진된 계통이 선발되어 이에 대한 내염성 증진 실험을 수행하였다. 선발된 내염성 140ES91 계통을 이용하여 기내 배양실 조건에서 염분 스트레스 처리 후 식물의 초장 및 근장을 조사하였다(Fig. 3). 염분 스트레스가 없는 조건에서 140ES91은 초장과 뿌리 발달 모두 KS140과 유사한 생육상태를 보였다.
염 처리 3주후 대조군과 비교하여 양호한 생육상태를 보이는 내염성 계통을 선발하였다. 선발된 내염성 계통을 이용하여 기내 생육 특성 검정 및 재염기서열분석을 수행하였다.
(2009)는 다양한 환경 스트레스에 의한 기공의 폐쇄는 광합성 저하를 야기하여 식물의 생육을 저해한다고 보고하였다. 염분 스트레스 상에서 140ES91의 광합성 능력을 확인하기 위해 기공전도도를 조사하였다(Fig. 4B). 온실에서 한달 간 배양한 식물체에 0.
염분 스트레스 시 식물체 내 축적되는 proline 함량을 조사하기 위해 대조군 KS140과 140ES91을 0.5% NaCl이 첨가된 배지에 파종 후 기내 배양실에서 10일간 배양하였다. 염분 스트레스 처리 후 식물 전체를 액체질소를 이용해 분쇄하였고 20% 에탄올 1 ml 첨가하여 잘 섞어준 후 14,000×g로 5분간 원심분리 하였다.
염분 스트레스 처리에 따른 기공전도도를 조사하기 위해 대조군인 KS140과 140ES91을 온실에서 한 달간 배양하여 0.5% NaCl을 일주일 간격으로 3주간 처리 한 후 6~8엽을 이용하여 기공전도도를 측정하였다. 기공전도도는 휴대용 장치 SC-1 Leaf Porometer (ICT, New South Wales, AU)를 사용하여 잎의 뒷면에서 확산되는 수분을 측정하였다(Cho et al.
염분 스트레스 처리에 의한 140ES91 식물체에서 내염성 관련 유전자의 발현 양상을 조사하기 위해 Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) 분석을 수행하였다. KS140과 140ES91 돌연변이 식물체를 0.
염색의 정도를 확인하기 위해 L-Proline (Sigma, St. Louis, MO)을 이용하여 표준 곡선을 작성하였고, ImageJ (NIH, Maryland, US A) 프로그램을 이용하여 염색의 강도를 정량하였다(Ábrahám et al., 2010).
4B). 온실에서 한달 간 배양한 식물체에 0.5% NaCl을 처리한 후 일주일 간격으로 기공전도도를 측정하였다. 무처리구에서는 KS140과 140ES91의 기공전도도는 차이를 보이지 않았으나, 염분 스트레스 처리 일주일부터 3주 후까지 두 식물체 모두에서 기공전도도가 비슷한 비율로 감소하였다.
유전자 증폭을 위한 프라이머로 ABP9-F: 5′-ATGTGGTCTCAGATACCCGGCACC-3′, ABP9-R: 5′-GTTCCTCCTCTCAATCCTCTTCTTCTTAAC-3′, CIPK21-F: 5′-GCACTTGAAATCACTTGGATATATTGTTGGA-3′, CIPK21-R: 5′-CATTGGAGGCCCCATCAACTCTATTTAA-3′, CIPK31-F: 5′-ATGTATCGGGCTAAGAGGGCTGCATTGT-3′, CIPK31-R: 5′-GATAGCAACAGGTTCCCCGTTTTCAGTGTT-3′, ACTIN-F: 5′-TGTGTTGGACTCTGGTGATGGTGT-3′, ACTIN-R: 5′-TGATGTCCCGTACGATTTCCCGTT-3′를 사용하였다.
이 파일로부터 유의미한 SNP를 min coverage, 5; max coverage, 250; min quality, 20; SNP ratio, >=0.8-0.9 parameter를 적용하여 선발하였다.
이 후 90°C 오븐에서 20분간 isatin과 proline을 반응시킨 후 발색 정도를 확인하였다.
17)을 이용하여 맵핑하였다. 이후 맵핑 결과를 SAMtools (version 1.9)을 이용하여 BAM 형식으로 변환하고, Picard package (version 1.112, http://broadinstitute.github.io/picard/)를 이용하여 중복된 서열들을 제거하였다. Genome Analysis Toolkit (GATK, version 3.
5% NaCl이 첨가된 배지에 파종하여 기내배양실에서 일주일간 배양하였다. 이후 식물 전체를 이용하여 액체 질소로 분쇄하였고, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, DE)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 NanoVue^TM Plus (GE healthcare, Illinois, USA)를 이용하여 정량하였으며, DNA to cDNA EcoDry^TM Premix (Oligo dT) kit (Takara, Moriyama, JP)를 이용하여 cDNA 합성을 수행하였다.
5% NaCl이 첨가된 배지에 파종하였다. 초장 및 근장은 기내 파종 10일 후 조사하였다.
대조군 KS140과 140ES91을 기내 배양실에서 일주일간 배양한 후 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, DE)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 Illumina HiSeq X 장비를 사용하여 염기서열을 분석하였고, 생산된 염기서열 정보로부터 low quality 서열과 중복된 서열을 Trimmomatic (version 0.38)을 이용하여 제거하였다. 선발된 염기서열들은 옥수수 inbred line B73의 표준 유전체 서열(http://plants.
추출한 RNA는 NanoVueTM Plus (GE healthcare, Illinois, USA)를 이용하여 정량하였으며, DNA to cDNA EcoDryTM Premix (Oligo dT) kit (Takara, Moriyama, JP)를 이용하여 cDNA 합성을 수행하였다.
후세대 종자 상태가 양호한 계통들을 파종하여 2~3개월 후 자가 교배를 통해 997 계통의 M₂ 종자를 확보하였고, inbred 계통을 육성하기 위해 M₂ 계통을 자가 교배하여 203개의 M₃ 계통을 확보하였다. 확보된 M₃ 종자에서 내염성 증진 계통을 선발하기 위해 온실 내 50공 포트에 종자 파종 후 0.7% NaCl을 3주간 처리하였다. 염 처리 후 대조군 대비 생육이 양호한 계통들을 선발하였고, 그 중에서 가장 양호한 생육 상태를 보이는 140ES91 계통을 최종 선발하여 M₇ 세대까지 진전하였다(Fig.

대상 데이터

M1 집단을 자가 교배 후 세대를 진전하여 최종 203 계통의 M3 집단을 확보하였고, 자가 교배를 통해 후세대 종자를 확보하였다.
본 연구에서는 국립식량과학원에서 육성한 사료용 옥수수 자식계통인 KS140 (우량 교잡계 품종 ‘강다옥’의 모본)을 사용하였다.
7% NaCl을 3주간 처리하였다. 염 처리 후 대조군 대비 생육이 양호한 계통들을 선발하였고, 그 중에서 가장 양호한 생육 상태를 보이는 140ES91 계통을 최종 선발하여 M₇ 세대까지 진전하였다(Fig. 2).
EMS 처리 후 포장에 파종하여 발아 및 생육 상태가 불량한 개체를 제외하고 자가 교배 후 1,471 계통의 M₁ 종자를 수확하였다. 후세대 종자 상태가 양호한 계통들을 파종하여 2~3개월 후 자가 교배를 통해 997 계통의 M₂ 종자를 확보하였고, inbred 계통을 육성하기 위해 M₂ 계통을 자가 교배하여 203개의 M₃ 계통을 확보하였다. 확보된 M₃ 종자에서 내염성 증진 계통을 선발하기 위해 온실 내 50공 포트에 종자 파종 후 0.

데이터처리

Asterisks denote statistical significance at p < 0.01 (**) by Student’s t-test.
Different letters indicate a significant difference determined by one-way ANOVA followed by Tukey’s post hoc test (p < 0.05).
모든 시험은 3반복 수행하여 결과를 획득하였으며, 각각의 결과에 대한 통계 분석은 SPSS 통계 패키지 23 (SPSS Inc., Illinois, USA)를 이용하였다. 통계적 검증은 Student t-test와 분산 분석을 수행하였으며, 사후 검정은 터키 검증(Tukey’s HSD)을 사용하여 p 값이 0.
통계적 검증은 Student t-test와 분산 분석을 수행하였으며, 사후 검정은 터키 검증(Tukey’s HSD)을 사용하여 p 값이 0.05 이하인 경우를 유의한 차이가 있는 것으로 판단하였다.

이론/모형

38)을 이용하여 제거하였다. 선발된 염기서열들은 옥수수 inbred line B73의 표준 유전체 서열(http://plants.ensembl.org/ Zea_mays/Info/Index, B73_RefGen_v4, database version 90.7)에 Burrows-Wheeler Aligner (BWA, version 0.7.17)을 이용하여 맵핑하였다. 이후 맵핑 결과를 SAMtools (version 1.
추출한 RNA는 NanoVue^TM Plus (GE healthcare, Illinois, USA)를 이용하여 정량하였으며, DNA to cDNA EcoDry^TM Premix (Oligo dT) kit (Takara, Moriyama, JP)를 이용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 유전자 발현 분석에 사용한 프라이머는 NCBI Primer-BLAST를 이용하여 제작하였다. 유전자 증폭을 위한 프라이머로 ABP9-F: 5′-ATGTGGTCTCAGATACCCGGCACC-3′, ABP9-R: 5′-GTTCCTCCTCTCAATCCTCTTCTTCTTAAC-3′, CIPK21-F: 5′-GCACTTGAAATCACTTGGATATATTGTTGGA-3′, CIPK21-R: 5′-CATTGGAGGCCCCATCAACTCTATTTAA-3′, CIPK31-F: 5′-ATGTATCGGGCTAAGAGGGCTGCATTGT-3′, CIPK31-R: 5′-GATAGCAACAGGTTCCCCGTTTTCAGTGTT-3′, ACTIN-F: 5′-TGTGTTGGACTCTGGTGATGGTGT-3′, ACTIN-R: 5′-TGATGTCCCGTACGATTTCCCGTT-3′를 사용하였다.

성능/효과

2. 기내 선발 방법을 통해 선발된 내염성 증진 계통 140ES91 계통을 이용하여 0.5% 염분 스트레스 처리 후 표현형을 조사한 결과, 대조군인 KS140 대비 식물의 초장 및 근장의 생육이 양호하였으며, 높은 proline 함량과 기공전도도를 보였다. 따라서 염분 스트레스 시 높은 proline 함량과 기공전도도가 140ES91 계통의 증가된 내염성과 관련이 있을 것으로 판단된다.
두 농도 조건 모두에서 발아 후 일주일부터 생육에 차이를 보였으며 생육 3주 이후까지 생육 지연을 보였다. 3주 후 생육 상태는 EMS 8시간 처리 조건에서 0.5% 농도에서는 대조군(43.82 mm) 대비 약 13% (37.81 mm), 0.7% 농도에서는 약 23% (33.71 mm)의 생육 지연율을 보였으며, 12시간 처리한 조건에서는 대조군(39.93 mm) 대비 0.5% 농도에서 약 20% (32.21 mm) 그리고 0.7% 농도에서는 약 40% (25.01 mm)의 초장이 감소함을 확인하였다. 따라서 발아율에 영향을 미치지 않으면서 생육에 큰 지장을 초래하지 않는 0.
4. 기 보고된 내염성 관련 유전자들의 발현 양상을 조사한 결과 ABP9과 CIPK31 유전자는 대조군 대비 염분 스트레스 처리 전후 140ES91 계통에서 높은 발현율을 보였으며, CIPK21 유전자는 염분 스트레스 처리 후 대조군에는 발현이 감소하나 140ES91 계통에서는 발현이 유지됨을 확인하였다. 따라서 140ES91 계통에서 보이는 내염성 관련 유전자들의 높은 발현율이 140ES91 계통의 내염성에 관여할 것으로 판단된다.
유전자 영역 유전변이 중 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 exon 영역에서 55개, intron 영역에서 71개, 그리고 비번역 영역(UTR)에서 24개의 변이가 확인되었다. 그 중 exon 영역에서 아미노산 서열의 변화를 유발하는 non-synonymous 변이는 39개로 1번 염색체에서 9개, 2번 염색체에서 5개, 3번 염색체에서 2개, 4번 염색체에서 1개, 5번 염색체에서 4개, 6번 염색체에서 8개, 7번 염색체에서 7개, 8번 염색체에서 2개, 10번 염색체에서 1개가 확인되었다(Table 1). 유전변이 분석을 통해 아미노산 변이를 유발하는 다양한 유전자들이 확인되었으나 옥수수에서 염분 스트레스 내성을 증가시키기 위한 내염성 관련 유전자는 명확히 밝혀져 있지 않다.
염분 스트레스가 없는 조건에서 140ES91은 초장과 뿌리 발달 모두 KS140과 유사한 생육상태를 보였다. 그러나 0.5% 염 처리 후 KS140의 초장은 정상 조건(8.3 cm) 대비 약 45% 감소한 4.8 cm를 보였으며, 이는 무처리구(7.5 cm) 대비 약 22% (5.8 cm) 감소한 140ES91에 비해 현저한 생육 저해를 보였다. 근장 또한 무처리구와 비교하여 KS140은 약 42% 감소한 4.
7% 농도 조건 모두에서 지연되는 것을 확인하였다. 두 농도 조건 모두에서 발아 후 일주일부터 생육에 차이를 보였으며 생육 3주 이후까지 생육 지연을 보였다. 3주 후 생육 상태는 EMS 8시간 처리 조건에서 0.
기 보고된 내염성 관련 유전자들의 발현 양상을 조사한 결과 ABP9과 CIPK31 유전자는 대조군 대비 염분 스트레스 처리 전후 140ES91 계통에서 높은 발현율을 보였으며, CIPK21 유전자는 염분 스트레스 처리 후 대조군에는 발현이 감소하나 140ES91 계통에서는 발현이 유지됨을 확인하였다. 따라서 140ES91 계통에서 보이는 내염성 관련 유전자들의 높은 발현율이 140ES91 계통의 내염성에 관여할 것으로 판단된다.
5% 염분 스트레스 처리 후 표현형을 조사한 결과, 대조군인 KS140 대비 식물의 초장 및 근장의 생육이 양호하였으며, 높은 proline 함량과 기공전도도를 보였다. 따라서 염분 스트레스 시 높은 proline 함량과 기공전도도가 140ES91 계통의 증가된 내염성과 관련이 있을 것으로 판단된다.
또한 2일간 회복한 식물체에서 기공전도도를 측정한 결과, KS140의 0.15 mol/m2·s 기공전도도와 비교하여 140ES91은 0.21 mol/m2·s의 높은 기공전도도를 보였다.
6). 무처리구에서 ABP9와 CIPK31은 KS140 대비 140ES91에서 높은 발현양을 보였으며, 염분 스트레스 처리 후에도 높은 발현양을 유지하였다. CIPK21은 무처리구에서 KS140과 140ES91 간 큰 차이를 보이지 않았으나, 염분 스트레스 처리 후 KS140에서는 발현이 감소한 반면 140ES91에서는 무처리구와 유사한 발현양을 유지하였다.
무처리구에서 KS140과 140ES91의 proline 함량은 유사한 수준을 보였으나, 염분 스트레스 처리 후 140ES91은 대조군(0.9 μg/mg) 대비 약 36% 증가한 1.12 μg/mg의 proline 함량을 보였다.
7% 농도 조건에서 처리 시간에 상관없이 대조군과 유사한 양상을 보였다. 반면 생육 상태는 EMS 처리 시간과 생육 기간에 따라 0.5와 0.7% 농도 조건 모두에서 지연되는 것을 확인하였다. 두 농도 조건 모두에서 발아 후 일주일부터 생육에 차이를 보였으며 생육 3주 이후까지 생육 지연을 보였다.
EMS 유도 내염성 증진 돌연변이체 140ES91의 유전변이 탐색을 위해 전체 게놈 염기서열배분석(Whole genome re-sequencing)을 수행하였다. 염기서열재분석 결과를 통해 140ES91에서 유전자간(intergenic) 영역에서 1,024개와 유전자(genic) 영역에서 150개의 SNPs 및 InDels을 포함하는 유전변이가 확인되었다(Fig. 5). 유전자 영역 유전변이 중 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 exon 영역에서 55개, intron 영역에서 71개, 그리고 비번역 영역(UTR)에서 24개의 변이가 확인되었다.
5). 유전자 영역 유전변이 중 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 exon 영역에서 55개, intron 영역에서 71개, 그리고 비번역 영역(UTR)에서 24개의 변이가 확인되었다. 그 중 exon 영역에서 아미노산 서열의 변화를 유발하는 non-synonymous 변이는 39개로 1번 염색체에서 9개, 2번 염색체에서 5개, 3번 염색체에서 2개, 4번 염색체에서 1개, 5번 염색체에서 4개, 6번 염색체에서 8개, 7번 염색체에서 7개, 8번 염색체에서 2개, 10번 염색체에서 1개가 확인되었다(Table 1).

후속연구

3. 내염성 증진 140ES91 계통의 유전변이 분석을 통해 유전자 기능에 영향을 미칠 수 있는 아미노산 변이를 유발하는 39개의 변이 유전자를 확인하였고, 변이 유전자와 내염성의 관계를 증명하기 위한 유전자 기능 분석이 요구된다.
5. 이상의 결과 기내 선발 방법을 통해 선발한 내염성 증진 계통은 간척지와 같은 염류집적 토양에서 작물의 안정적인 재배와 생산이 가능한 내염성 증진 품종 개발의 육종소재로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
유전변이 분석을 통해 아미노산 변이를 유발하는 다양한 유전자들이 확인되었으나 옥수수에서 염분 스트레스 내성을 증가시키기 위한 내염성 관련 유전자는 명확히 밝혀져 있지 않다. 따라서 본 연구에서 확인된 유전자의 변이와 내염성 관련 메커니즘 규명을 위한 유전자 기능 탐색 등의 연구가 필요할 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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