[논문]화학 물질의 안자극 시험용 세포 기반 미세유체 칩의 제작 및 응용

조수진; 이석우

doi:10.5806/ast.2021.34.6.275

[국내논문] 화학 물질의 안자극 시험용 세포 기반 미세유체 칩의 제작 및 응용
Fabrication and application of cell-based microfluidic chip for eye-irritation test of chemicals 원문보기

분석과학 = Analytical science & technology, v.34 no.6, 2021년, pp.275 - 283

초록
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본 연구에서는 화학 물질의 급성 안자극 시험을 수행하기 위한 세포 기반 미세유체 칩의 개발과 응용에 관한 연구를 수행하였다. 포토리소그래피와 소프트리소그래피 공정을 이용하여 미세유체 칩을 제작하였으며, 칩은 배양 면적이 다른 3개의 세포 배양 구획으로 이루어져 있다. 세포 기반 안자극 시험은 토끼 각막 상피 세포를 사용하여 수행하였다. 미세유체 칩에 배양된 세포에 화학 물질 수용액을 처리한 후 일정한 간격으로 세포를 관찰하고, 생존율 곡선을 기반으로 세포 사멸에 대한 속도 상수를 계산하였다. 세포-세포 사이의 연접, 세포-기판 사이의 부착, 초기 세포 수 변화가 세포 사멸 속도에 미치는 영향을 조사하여 미세유체 칩의 성능을 검증하였다. 안자극 시험의 표준물질인 sodium dodecylsulfate (SDS) 수용액의 다양한 농도 조건에서 안자극 시험을 수행하였다. 화학 물질의 수용액에 300초 동안 노출시킨 세포의 생존율을 이용하여 안자극을 시험하였다. 최종적으로 미세유체 칩의 각 구획에 대한 가중치를 기반으로 독성 점수(toxicity score, TS) 산출식을 얻었다. 본 연구에서 개발한 세포 기반 미세유체 칩은 화장품과 제약에 사용되는 화학 물질의 안자극 시험에 활용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study presents the development of cell-based microfluidic chips for the performance of acute eye irritation tests due to chemicals and examined some of their applications. Microfluidic chips were fabricated by photolithography and soft lithography, and they had three compartments with different areas for cell culture. Rabbit corneal epithelial cells were used for the eye irritation test. The death of cells cultured inside the chip was monitored at regular time intervals after treatment with an aqueous solution of chemicals, and the cell death rate constants were calculated based on the viability curve. The performance of the microfluidic chip was verified by examining the effects of cell-cell junctions, cell-substrate adhesion, and initial cell numbers compared to cell death rates. Eye irritation tests were performed at various concentrations of an aqueous solution of sodium dodecyl sulfate (SDS), a standard substance for the eye irritant test. The cells were exposed to the SDS aqueous solution for 300 s, and the resulting eye irritation was assessed by cell viability. Finally, the equation for calculating the toxicity score (TS) was derived based on the weighting factor for each compartment in the chip. The cell-based microfluidic chip developed in this study may be used for eye irritation tests from chemicals used in cosmetics and pharmaceuticals.

Keyword

표/그림 (9)

그림 Fig. 1. Designs of microfluidic chips. (a) Design 1 : chip consisting of 3 cell culture compartments R1, R2, R3 of different areas. A : chemical solution inlet, B : solution outlet, C : cell injection port. In the other three designs, only the area of the cell culture compartment is different from that of design 1. (b) Design 2 : chip consisting of three R1 compartments. (c) Design 3 : chip consisting of three R2 compartments. (d) Design 3 : chip consisting of three R3 compartments.
그림 Fig. 3. Cell viability over time in R1 of the chip fabricated using design 1. Three experiments were performed in each cell line and cell viability (mean±SD) was plotted as a function of time. (a) BALB/3T3 fibroblasts. 1061±58 cells were analyzed in each experiment, (b) SIRC rabbit corneal cells. 1051±34 cells were analyzed in each experiment.
그림 Fig. 2. (a) Photograph of the microfluidic chip filled with trypan blue solution, (b) photograph of the microfluidic chip mounted on the microscope stage. (c)~(e) Timelapse images obtained after injecting an aqueous chemical solution into the chip fabricated using design 1.
표 Table 1. The time taken for the aqueous chemical solution to reach each compartment of the microfluidic chip fabricated using design 1~4
표 Table 2. Rate law data on the cell death of two types of cells cultured inside microfluidic chips. Cells were treated with SDS aqueous solution at various concentrations
표 Table 3. Rate constants for the cell death obtained by varying the initial number of SIRC cells. Cells were treated with 1.0 mM SDS aqueous solution
표 Table 4. Rate law data on the cell death of SIRC cells cultured inside different compartments of microfluidic chips. Cells were treated with 1.0 mM SDS aqueous solution
표 Table 5. Cell viability and TS values at different SDS concentrations
그림 Fig. 4. TS and IS values at different SDS concentrations.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 포토리소그래피와 소프트리소그래피공정을 이용하여 미세유체 칩을 개발하고, 미세 유체 칩에 배양된 세포에 화학 물질의 수용액을 노출시킨후 세포의 거동을 분석하여 화학 물질에 대한 급성 안 자극을 평가할 수 있는 시험 방법을 개발하고자 하였다. 대상 세포로는 공인 시험법인 STE test에 사용하는 토끼 각막 상피 세포 SIRC (Statens Seruminstitut Rabbit Cornea) 세포를 사용하였고, 대상 화학 물질로는 안 자극 시험의 표준물질인 sodium dodecylsulfate (SDS) 를사용하였다.
본 연구에서는 안자극 평가를 위한 세포 기반 미세 유체 칩을 개발하고 칩의 성능을 검증하였다. 미세 유체 칩은 세포 배양 면적이 다른 3개의 세포 배양 구획과 세포 주입구/배출구, 약물 주입구/배출구로 구성되어 있어 배양되는 세포 개수의 상댓값이 서로 다르다.

제안 방법

대상 세포로는 공인 시험법인 STE test에 사용하는 토끼 각막 상피 세포 SIRC (Statens Seruminstitut Rabbit Cornea) 세포를 사용하였고, 대상 화학 물질로는 안 자극 시험의 표준물질인 sodium dodecylsulfate (SDS) 를사용하였다. 최종적으로 배양된 세포를 다양한 농도의 화학 물질 수용액에 노출시켜 생존율을 측정한 후, 실험 결과를 기반으로 가중치 부여 규칙을 정립하고, 정량적인 독성 점수 (toxicity score, TS) 계산식을 도출하여 공인 시험법인 HET-CAM 시험법의 IS 결과와 비교하여 상관성을 정립함으로써 미세유체 칩 기반 급성 안자극 시헙법을 개발하고자 하였다.
미세유체 칩을 이용한 화학 물질의 안자극을 평가하기 위하여 자극 지표인 독성 점수(Toxicity Score, TS) 계산식을 개발하였다.
미세 유체 칩은 세포 배양 면적이 다른 3개의 세포 배양 구획과 세포 주입구/배출구, 약물 주입구/배출구로 구성되어 있어 배양되는 세포 개수의 상댓값이 서로 다르다. 개발된 세포 기반 미세유체 칩을 이용하여 안 자극을 유발하는 주요 물질인 계면활성제 SDS의 안 자극시험을 수행하였다. SDS에 의한 세포의 사멸은 1차 속도 법칙을 따르며, 세포막과 막단백질 용해, 세포-세포 연접 파괴, 세포-기판 부착 파괴 등이 세포 사멸에 영향을 미치는 인자로 밝혀졌다.
SDS에 의한 세포의 사멸은 1차 속도 법칙을 따르며, 세포막과 막단백질 용해, 세포-세포 연접 파괴, 세포-기판 부착 파괴 등이 세포 사멸에 영향을 미치는 인자로 밝혀졌다. 정해진 300초의 반응시간 동안 표준물질로 처리한 후 각 구획에서의 세포 생존율, 반응 속도 상수, 초기 세포 개수에 가중치를 둔 안자극 평가 지표인 TS를 얻을 수 있는 계산식을 개발하였고, HET-CAM의 IS와 비교하여 본 연구에서 개발한 칩을 검증하였다. 본 연구에서 개발한 안 자극시험용 세포 기반 미세유체 칩은 화학 물질의 안 자극시험의 초기 단계 시험에서 동물 대체 시험법으로 활용될 수 있을 것이다.

대상 데이터

SU-8 50 (Microchem), propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA, Sigma Aldrich Co.) trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl)silane (97%, Sigma Aldrich Co.), polydimethylsiloxane (PDMS, Dow Corning), Dulbcco's modified eagle medium (DMEM, Invitrogen Gibco) Eagle's minimum essential medium (EMEM, Corning), 0.25% trypsin/EDTA (Invitrogen Gibco), fetal bovine serum (FBS, Invitrogen Gibco), penicillin/strep- tomycin (P/S, Invitrogen Gibco), phosphate buffer silane (PBS, Invitrogen Gibco), calcein AM (CA, Thermo Fisher), sodium dodecyl sulfate (SDS, Sigma Aldrich Co.)는 제조회사로부터 시약급으로 구입하여 정제 없이 사용하였다
본 연구에서는 포토리소그래피와 소프트리소그래피공정을 이용하여 미세유체 칩을 개발하고, 미세 유체 칩에 배양된 세포에 화학 물질의 수용액을 노출시킨후 세포의 거동을 분석하여 화학 물질에 대한 급성 안 자극을 평가할 수 있는 시험 방법을 개발하고자 하였다. 대상 세포로는 공인 시험법인 STE test에 사용하는 토끼 각막 상피 세포 SIRC (Statens Seruminstitut Rabbit Cornea) 세포를 사용하였고, 대상 화학 물질로는 안 자극 시험의 표준물질인 sodium dodecylsulfate (SDS) 를사용하였다. 최종적으로 배양된 세포를 다양한 농도의 화학 물질 수용액에 노출시켜 생존율을 측정한 후, 실험 결과를 기반으로 가중치 부여 규칙을 정립하고, 정량적인 독성 점수 (toxicity score, TS) 계산식을 도출하여 공인 시험법인 HET-CAM 시험법의 IS 결과와 비교하여 상관성을 정립함으로써 미세유체 칩 기반 급성 안자극 시헙법을 개발하고자 하였다.
생쥐에서 추출한 BALB/3T3 섬유아세포(fibroblast) 는 한국생명과학연구원의 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에서 분양받아 계대 배양을 통해 본연구에 사용하였다. 성장 배지는 DMEM 배지에 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 사용하였다.
성장 배지는 DMEM 배지에 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 사용하였다. 토끼(rabbit)에서 추출한 SIRC(Statens Seruminstitut Rabbit Cornea, CCL-60) 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양받아 계대 배양을 통해 본연구에서 사용하였다. 성장 배지는 L-glutamine을 포함하는 EMEM 배지에 10% FBS, 1% penicillin/strep- tomycin를 첨가하여 사용하였다.

성능/효과

개발된 세포 기반 미세유체 칩을 이용하여 안 자극을 유발하는 주요 물질인 계면활성제 SDS의 안 자극시험을 수행하였다. SDS에 의한 세포의 사멸은 1차 속도 법칙을 따르며, 세포막과 막단백질 용해, 세포-세포 연접 파괴, 세포-기판 부착 파괴 등이 세포 사멸에 영향을 미치는 인자로 밝혀졌다. 정해진 300초의 반응시간 동안 표준물질로 처리한 후 각 구획에서의 세포 생존율, 반응 속도 상수, 초기 세포 개수에 가중치를 둔 안자극 평가 지표인 TS를 얻을 수 있는 계산식을 개발하였고, HET-CAM의 IS와 비교하여 본 연구에서 개발한 칩을 검증하였다.

후속연구

정해진 300초의 반응시간 동안 표준물질로 처리한 후 각 구획에서의 세포 생존율, 반응 속도 상수, 초기 세포 개수에 가중치를 둔 안자극 평가 지표인 TS를 얻을 수 있는 계산식을 개발하였고, HET-CAM의 IS와 비교하여 본 연구에서 개발한 칩을 검증하였다. 본 연구에서 개발한 안 자극시험용 세포 기반 미세유체 칩은 화학 물질의 안 자극시험의 초기 단계 시험에서 동물 대체 시험법으로 활용될 수 있을 것이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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