[논문]아미노 말단 절반 라이보플라빈 신테이스 변이 단백질의 분광학적 분석

오동현; 김류련; 김재성; 이찬용

doi:10.5012/jkcs.2021.65.6.489

[국내논문] 아미노 말단 절반 라이보플라빈 신테이스 변이 단백질의 분광학적 분석
Spectroscopic Analysis of Amino-Terminal Half of Riboflavin Synthase Variant Proteins 원문보기

대한화학회지 = Journal of the Korean Chemical Society, v.65 no.6, 2021년, pp.489 - 494

오동현 (충남대학교 생화학과) , 김류련 (충남대학교 생화학과) , 김재성 (충남대학교 생화학과) , 이찬용 (충남대학교 생화학과)

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표/그림 (9)

그림 Figure 1. Reaction mechanism of riboflavin synthase. The first step of the reaction mechanism proposed by Plaut et al.,⁵ where XH and YH are hydrogen bond donors on the protein, Z: is a nucleophile and A: is a proton acceptor. Riboflavin synthase binds two molecules of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine (2) as substrate and yields one molecule of 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidinedione (1) and one molecule of riboflavin (3) as products.
그림 Figure 2. (A) Purification of the N-RS C48S protein. 1. supernatant of cell extract, 2. after Sepharose, 3. after sephadex, 4. after ultrafiltration, 5. protein size marker. (B) Purified proteins. 1, N-RS Wt; 2, N-RS A43L, 3, N-RS C48S; 4, protein size marker 14, 21, 30, 46, 66, 97, and 200 kDa, respectively. Expressed and purified proteins of wild type and mutant N-RS proteins are shown at 13 kDa size position on SDS-PAGE in Fig. 2A and B.
그림 Figure 3. (A) Absorbance spectra of purified N-RS Wt and N-RS Wt reconstituted with 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine. (B) Absorbance spectra of free 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine and N-RS Wt with 6,7 dimethyl-8-ribityllumazine. The concentration of proteins is 17 μM, respectively.
그림 Scheme 1. The structure of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine under acidic and basic condition. R is represented for ribityl group.
그림 Figure 4. (A) Titration of free 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine; pK_a = 7.85 ± 0.05. (B) pH titration of N-RS Wt reconstituted with 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine; pKa = 8.00 ± 0.05. (C) pH titration of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine with NRS-C48S; pK_a = 9.15±0.12.
그림 Figrure 6. Absorbance spectra of purified N-RS Wt, N-RS A43L, and N-RS C48S after reconstitution with riboflavin.
그림 Figure 5. (A) Fluorescence emission spectra of free 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine and its protein complex with purified N-RS Wt, N-RS A43L, and N-RS C48S by reconstitution of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine. (B) Enlargement of the box area in Figure A.
그림 Figure 7. (A) Fluorescence emission spectra of free riboflavin as well as purified N-RS Wt, N-RS A43L, and N-RS C48S with reconstitution of riboflavin. Excited at 280 nm. (B) Excited at 370 nm. (C) Excited at 445 nm.
그림 Figure 8. 3-D model of wild type and mutant N-terminal domain of riboflavin synthase bound to 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine.

AI 본문요약
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제안 방법

1에서 보는 바와 같이 라이보플라빈 신테이스 효소의 기질과 생성물은 각각 루마진과 라이보플라빈이다. 분리, 정제된 이들 단백질에는 이 효소의 여러 아미노산과 수소결합으로 루마진과 라이보플라빈이 결합되어 있으므로 순수 단백질과 이들 리간드와의 결합 특성을 조사하기 위하여 ligand exchange 로써 리간드 분자들이 없는 순수한 N-RS 단백질들만을 얻고자 분리, 정제된 단백질에 결합되어 있는 루마진 혹은 라이보플라빈을 urea 처리를 한 후 투석 과정을 통하여 제거하였다.
UltraSpec 2000 분광광도계(Spectrophotometer)를 사용하여 250 nm에서 550 nm까지 파장 주사(wavelength scanning)을 수행하여 흡광 스펙트라(absorbance spectra)를 측정하였다. A 완충용액에 녹아 있는 단백질들을 17 μM의 동일한 농도로 준비하고, 동일한 농도의 루마진 혹은 라이보플라빈을 결합시키고 이들 결합된 단백질과 유리된 루마진 혹은 라이보플라빈의 형광 세기를 형광분광광도계(Fluorescence spectrophotometer FS-2000)를 사용하여 280 nm, 370 nm, 410 nm, 445 nm에서 여기 파장을 고정시키고, 방출스펙트라를 주사하였다.
Chembiooffic(Cambridge Soft, USA)의 하위 프로그램인 Chemfinder, Chemdraw 그리고 chem3D와 Bioclipse 프로그램을 별도로 이용하였다. PDB(protein databank)에서 얻은 데이터 베이스를 이용하여 용액 상태의 대장균 아미노-말단 라이보플라빈 신테이스의 3D 구조를Bioclipse 프로그램으로 확인 후, 야생형 라이보플라빈 신테이스(N-RS Wt) 핵심 부분인 리간드와 반응하는 부분을 확대하여 이를 기초하여 3차 구조를 그렸다. Chemfinder로 루마진과 라이보플라빈을 데이터 베이스로부터 받고 Chem 3D 파일로 옮긴 후 3D 상태의 이미지를 구축하였다.

후속연구

이와 같은 결과들을 고려할 때 라이보플라빈 생성 효소와 형광성 리간드 사이의 상호작용을 예측할 수 있으며, N-RS C48S 돌연변이 단백질의 형광성을 활용하여 효과적으로 효소 저해제를 발굴할 수 있는 고속다중 스크리닝 법(high-throughput screening system) 으로써 활용될 수 있을 것이다. 또한 이들 3-D 구조와 형광의 세기 변화, 형광 세기의 이동 등의 특성은, 형광 탐침자(fluorescence probe) 를 이용한 형광 공명 에너지 전환(FRET: fluorescence resonance energy transfer)의 방법으로 단백질의 구조 및 리간드와의 결합 거리 및 배향에 관한 정보를 제공할 수 있어, 신약개발에 유용하게 활용될 것으로 사료된다.
이와 같은 결과들을 고려할 때 라이보플라빈 생성 효소와 형광성 리간드 사이의 상호작용을 예측할 수 있으며, N-RS C48S 돌연변이 단백질의 형광성을 활용하여 효과적으로 효소 저해제를 발굴할 수 있는 고속다중 스크리닝 법(high-throughput screening system) 으로써 활용될 수 있을 것이다. 또한 이들 3-D 구조와 형광의 세기 변화, 형광 세기의 이동 등의 특성은, 형광 탐침자(fluorescence probe) 를 이용한 형광 공명 에너지 전환(FRET: fluorescence resonance energy transfer)의 방법으로 단백질의 구조 및 리간드와의 결합 거리 및 배향에 관한 정보를 제공할 수 있어, 신약개발에 유용하게 활용될 것으로 사료된다.

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