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문제 정의
- Physostigmine과 procyclidine을 신경작용제 soman을 투여하기 전 피하투여하여 랫과 기니픽에서 효능을 확인하였고[10], physostigmine과 procyclidine 을 포함하는 osmotic minipump를 이용하여 랫에서 신경작용제 soman에 대한 효능이 있는 것을 확인하였으며[11] physostigmine과 procyclidine을 포함하는 예방패치가 개에서 신경작용제 soman 중독을 예방하는 효능이있는 것을 확인하였다[12]. 본 연구에서는 procyclidine 과 physostigmine을 주성분으로 하는 복합제 패치인신경작용제 예방패치의 예방방어효능을 기니픽을 이용하여 평가하였다. 연구를 진행하기 위하여 Probit 법을 이용해 기니픽에서 sarin과 soman에 대한 반수치사량을 산정하였다.
- 또한 72시간까지도 20-30 % 억제율이 관찰되어 6~72시간 사이에는 모두 20 % 이상의 효소억제율이 관찰되었다. 신경작용제 투여 후 가장 심하게 손상을 받을 것으로 예상되는 뇌의 cerebral cortex, hippocampus, thalamus, cortical amygdala 및 pyriform cortex에서 신경작용제 예방패치 처치 유무에 따른 뇌 손상 정도를 평가하기 위해 수행되었다. 본 시험 여건 하에서, 양성대조군 대비 예방패치군의뇌손상 정도가 통계학적 유의성을 보이며 감소하는 것으로 확인되었다.
제안 방법
- 실시하였다. Sarin과 soman에 대한 반수치사량산정시험을 실시하기 위하여 참고문헌에서의 sarin과 soman의 반수치사량(sarin: 42 μg/kg, soman: 28 μg/kg) 을 참고하여 각각 20~60 μg/kg, 7.5~30 μg/kg 용량을기니픽에 피하투여하였다[7]. 작용제 투여 24 h 후 폐사를 확인하였고 probit analysis법을 이용하여 반수치사량을 산정하였다.
- Sarin과 soman에 대한 신경작용제 예방패치와 KMARK-1의 병용투여에 대한 효과를 확인하기 위하여 총 6개의 그룹을 구성하여 시험을 수행하였다. 각 그룹은 5-7마리의 기니픽이 무작위로 배치되었다.
- 시험은 총 4그룹으로 그룹별 5마리의 기니픽을 무작위로 배치하였다. 그룹 1-2는 4×5 cm2 크기의 예방패치를 24 h 부착 후 sarin 및 soman을 1.5 LD50 용량으로 공격하였고, 그룹 3-4는 대조군으로 패치를 부착하지 않고 sarin 및 soman을 1.5 LD50 용량으로 공격하였으며 임상 증상 및 24 h 후 폐사율을 확인하였다.
- 각 그룹은 5-7마리의 기니픽이 무작위로 배치되었다. 그룹 1과 그룹 4는 예방패치를 부착하고 24시간 뒤 sarin과 soman 5.0 LD50을 각각 투여하고 1분 후 KMARK-1을투여하였다. 그룹 2와 그룹 5는 pyridostigmine을 근육 투여하고 30분 후 sarin과 soman 5.
- 각 그룹은 5마리의 기니픽이 무작위로 배치되었다. 그룹 1은 정상 기니픽 군으로 전 처치, 후 처치, 작용제 투여가 없는 그룹이고 그룹 2는 대조군으로 sarin 1.5-2.0 LD50만 투여해야 하지만 sarin을 투여한 그룹은 24시간까지 생존할 수 없기 때문에 생존을 위하여 atropine 과 2-PAM을 투여하였다. 그럼에도 불구하고 폐사하는 경우가 많아서 생존 개체가 5마리 이상이 될 때까지 반복 실험하였다.
- 0 LD50을 각각 투여하고 1분 후 KMARK-1을투여하였다. 그룹 2와 그룹 5는 pyridostigmine을 근육 투여하고 30분 후 sarin과 soman 5.0 LD50을 각각 투여하고 1분 후 KMARK-1을 근육 투여하였다. 또한 그룹 3과 그룹 6은 대조군으로 전처치 없이 sarin과 soman 5.
- 그럼에도 불구하고 폐사하는 경우가 많아서 생존 개체가 5마리 이상이 될 때까지 반복 실험하였다. 그룹 3은 예방패치를 부착하고 24 h 뒤 sarin 2.0 LD50을 투여하였다. 그룹 4는 전 처치 없이 soman 1.
- 0 LD50을 투여하였다. 그룹 4는 전 처치 없이 soman 1.5 LD50을 투여하고 그룹 2와 마찬가지로 atropine과 2-PAM을 투여하였고 생존 개체가 5마리 이상이 될 때까지 추가 실험하였다. 그룹 5는 예방 패치를 24 h 부착한 후 soman 2.
- 5 LD50을 투여하고 그룹 2와 마찬가지로 atropine과 2-PAM을 투여하였고 생존 개체가 5마리 이상이 될 때까지 추가 실험하였다. 그룹 5는 예방 패치를 24 h 부착한 후 soman 2.0 LD50을 투여하였다. 그룹 6은 pyridostigmine을 전처치하고 soman 1.
- 0 LD50을 투여하였다. 그룹 6은 pyridostigmine을 전처치하고 soman 1.5 LD50을투여한 후 atropine과 2PAM을 투여하였다. 작용제 투여 5 h~1주일 후 관류 고정하였고 뇌 조직 슬라이드를 제작하여 뇌 보호 효과를 확인하였다.
- 방어 효능을 수행하였다. 기니픽의 등 부위를 제모하고 예방패치를 부착한 후 테이핑을 하여 패치가 손상되지 않도록 하였다. 시험은 총 4그룹으로 그룹별 5마리의 기니픽을 무작위로 배치하였다.
- 뇌보호 효과는 신경작용제 중독 후 가장 심하게 손상을 받는 (1) cerebral cortex, (2) hippocampus, (3) thalamus, (4) cortical amygdala, (5) pyriform cortex에서의 신경작용제 예방패치 처치 유무에 따른 뇌세포 괴사 및 주위 뇌조직의 변성 정도를 지표로 평가하였다 [4]. 통계학적 분석은 상용으로 사용되는 SPSS statistics 프로그램을 이용하였고 유의수준은 P<0.
- 0 LD50을 각각 투여하고 1분 후 KMARK-1을 근육 투여하였다. 또한 그룹 3과 그룹 6은 대조군으로 전처치 없이 sarin과 soman 5.0 LD50을 각각 투여하고 1분 후 KMARK-1을 투여하여 생존율을 확인하였다.
- 반수치사량 산정시험 결과를 바탕으로 예방 패치의 예방 방어 효능을 수행하였다. 기니픽의 등 부위를 제모하고 예방패치를 부착한 후 테이핑을 하여 패치가 손상되지 않도록 하였다.
- 이러한 연구결과들을 바탕으로신경작용제에 대한 NMDA 길항 및 항콜린효과를 지닌 procyclidine과 physostigmine을 주성분으로 하는 복합제 패치를 개발하였다. 본 연구에서는 기니픽을 이용하여 신경작용제 예방패치의 예방방어, 해독촉진, 뇌 보호 효과를 평가하였다.
- 본 연구에서는 예방패치의 예방방어, 해독촉진, 뇌보호 평가를 위해 기니픽을 이용하여 반수치사량 산정시험을 실시하였다. Sarin과 soman에 대한 반수치사량산정시험을 실시하기 위하여 참고문헌에서의 sarin과 soman의 반수치사량(sarin: 42 μg/kg, soman: 28 μg/kg) 을 참고하여 각각 20~60 μg/kg, 7.
- 신경작용제 예방패치의 뇌 보호 효과를 확인하기 위하여 5개의 그룹을 구성하여 시험을 수행하였다. 각 그룹은 5마리의 기니픽이 무작위로 배치되었다.
- 아세틸콜린에스터라제 활성을 분석하여 약물에 의한 억제율을 평가하였다. 패치 부착 전 채혈한 혈액과 작용제 투여 후 채혈한 혈액을 이용하여 기존에 보고된 시험법[8]을 참고하여 분석하였다.
- 중추신경계에 대한 약효를 기대할 수없는 pyridostigmine의 대체약물로 지목된 physostigmine 은 혈액 속에서 반감기가 짧고 유효 약물농도 범위가좁지만 항콜린성 약물을 복합 투여하면 독성은 서로상쇄되고 약효는 상승되는 매우 이상적인 연구들이다수 보고되어있다[8, 9]. 이러한 연구결과들을 바탕으로신경작용제에 대한 NMDA 길항 및 항콜린효과를 지닌 procyclidine과 physostigmine을 주성분으로 하는 복합제 패치를 개발하였다. 본 연구에서는 기니픽을 이용하여 신경작용제 예방패치의 예방방어, 해독촉진, 뇌 보호 효과를 평가하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 국방과학연구소에서 직접 합성하여 순도 97 %로 확인된 sarin 및 soman을 사용하였다.
- 본 연구에서는 삼양화학기술연구소로부터 제공받은신경작용제 예방패치를 4×5 cm2 크기로 절단하여 사용하였으며 4×5 cm2 크기 기준 예방패치의 성분은 physostigmine 3.6 mg과 procyclidine 14.2 mg이다.
- 본 연구에서는 현재 미국에서 전처치제로 사용되고 있는 pyridostigmine을 예방패치와 비교하기 위하여 pyridostigmine(Sigma Aldrich, MO, USA) 0.026 μg/kg 용량으로 사용하였고, 현재 군에서 보유하고 있는 해독제인 KMARK-1과 의 병용투여 효과를 확인하기 위하여 atropine sulfate(Sigma Aldrich, MO, USA)와 2-PAM (Sigma Aldrich, MO, USA)을 각각 2 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏ 용량으로 사용하였다.
- 기니픽의 등 부위를 제모하고 예방패치를 부착한 후 테이핑을 하여 패치가 손상되지 않도록 하였다. 시험은 총 4그룹으로 그룹별 5마리의 기니픽을 무작위로 배치하였다. 그룹 1-2는 4×5 cm2 크기의 예방패치를 24 h 부착 후 sarin 및 soman을 1.
- 일본으로부터 수입한 5주령 수컷 기니픽(Guinea Pig; Hartley, SPF)을 사용하였다. 동물 실험은 국방과학연구소 동물실험윤리위원회의 승인을 받고 수행하였다 (ADD-IACUC-15-20, ADD-IACUC-16-18, ADD-IACUC- 16-19).
데이터처리
- 통계학적 분석은 상용으로 사용되는 SPSS statistics 프로그램을 이용하였고 유의수준은 P<0.05로 설정하였으며 Mann-Whitney U-test를 통해 대조군과의 유의성을 확인하였다(Table 1).
이론/모형
- 본 연구에서는 procyclidine 과 physostigmine을 주성분으로 하는 복합제 패치인신경작용제 예방패치의 예방방어효능을 기니픽을 이용하여 평가하였다. 연구를 진행하기 위하여 Probit 법을 이용해 기니픽에서 sarin과 soman에 대한 반수치사량을 산정하였다. 신경작용제 sarin의 반수치사량은 33.
- 5~30 μg/kg 용량을기니픽에 피하투여하였다[7]. 작용제 투여 24 h 후 폐사를 확인하였고 probit analysis법을 이용하여 반수치사량을 산정하였다.
- 억제율을 평가하였다. 패치 부착 전 채혈한 혈액과 작용제 투여 후 채혈한 혈액을 이용하여 기존에 보고된 시험법[8]을 참고하여 분석하였다.
성능/효과
- 값은 Table 4와 같았다. 군간 총합(sum)에 대한 비교평가 시 예방패치를 부착한 G3의 뇌 손상(brain damage) 점수(0.8±0.4)는 KMARK-1을 투여한 대조군 G2군의 뇌손상 점수(11.4±0.9)보다 통계학적으로 유의적으로 낮았다(P<0.05). 신경작용제 soman를 처치한 G4, G5, G6군의 뇌의 각 관찰부위별 뇌 손상 정도를 평가한 결과 평균값±표준오차 값은 Table 4와 같았다.
- 기니픽에게 4×5 cm2 크기의 예방패치 부착 시 최대효소 억제율은 평균 69.6 %로 6 h 후에 나타났고, 72 h 에서의 효소억제율은 평균 26.9 %로 확인되어 패치 부착 군에서 6~72 h에서 모두 20 % 이상의 효소 억제율을 보였다. 예방패치를 24 h 동안 부착한 후 soman (GD)을 피하 투여하였을 때 1 h 후에는 효소 억제율이 평균 80.
- 40-50 %을 억제율을 보였다. 또한 72시간까지도 20-30 % 억제율이 관찰되어 6~72시간 사이에는 모두 20 % 이상의 효소억제율이 관찰되었다. 신경작용제 투여 후 가장 심하게 손상을 받을 것으로 예상되는 뇌의 cerebral cortex, hippocampus, thalamus, cortical amygdala 및 pyriform cortex에서 신경작용제 예방패치 처치 유무에 따른 뇌 손상 정도를 평가하기 위해 수행되었다.
- 또한, soman 5.0LD50에 대해 패치와 atropine + 2-PAM을 함께 처치한 그룹은 80 %(4/5) 생존하였고, pyridostigmine과 atropine + 2-PAM을 함께 처치한 그룹은 20 %(1/5)의 생존율을 보였으며 atropine + 2-PAM 만 투여한 대조군은 모두 폐사하여 0 %(0/5)의 생존율을 보였다(Fig. 3).
- 05). 병리조직 검경 시 패치를 부착한 군에서는 세포 손상이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 6, 7).
- 신경작용제 투여 후 가장 심하게 손상을 받을 것으로 예상되는 뇌의 cerebral cortex, hippocampus, thalamus, cortical amygdala 및 pyriform cortex에서 신경작용제 예방패치 처치 유무에 따른 뇌 손상 정도를 평가하기 위해 수행되었다. 본 시험 여건 하에서, 양성대조군 대비 예방패치군의뇌손상 정도가 통계학적 유의성을 보이며 감소하는 것으로 확인되었다. 따라서 physostigmine과 procyclidine 을 포함하는 예방패치는 기존연구에서 수행한 beagle dog에서의 효능평가 결과와 마찬가지로 신경작용제 sarin과 soman 중독에 대한 예방, 해독 및 뇌 보호 효능이 있는 것으로 판단된다[12].
- 9 %로 확인되어 패치 부착 군에서 6~72 h에서 모두 20 % 이상의 효소 억제율을 보였다. 예방패치를 24 h 동안 부착한 후 soman (GD)을 피하 투여하였을 때 1 h 후에는 효소 억제율이 평균 80.9 %까지 급증하였고 2시간 후 평균 83.9 %까지 효소억제율이 올라갔다가 이후 패치 부착기준 48 h까지 75.5 % 효소가 억제된 상태를 유지하였다(Fig. 4, 5).
- 신경작용제 soman를 처치한 G4, G5, G6군의 뇌의 각 관찰부위별 뇌 손상 정도를 평가한 결과 평균값±표준오차 값은 Table 4와 같았다. 예방패치를 부착한 시험군(G5)에서 뇌손상 정도가 가장 적었으며, 그 다음으로 atropine + 2-PAM을 후처 치한 시험군(G4)이, pyridostigmine을 전처치하고 atropine + 2PAM을 후처치한 시험군(G6)보다 뇌손상 정도가 미약하게 상대적으로 적었다. 군간 총합(sum)에 대한 비교평가 시 G5의 등급(0.
- 예방패치의 해독촉진 효과 평가결과 sarin 5.0 LD50 에 대해 패치와 atropine + 2-PAM을 함께 처치한 그룹은 100 %(5/5) 생존하였고, pyridostigmine과 atropine + 2-PAM을 함께 처치한 그룹은 60 %(3/5)의 생존율을 보였으며 atropine + 2-PAM만 투여한 대조군은 14.7 %(1/7) 생존하였다(Fig. 2).
- 5 LD50을투여한 후 atropine과 2PAM을 투여하였다. 작용제 투여 5 h~1주일 후 관류 고정하였고 뇌 조직 슬라이드를 제작하여 뇌 보호 효과를 확인하였다.
- 패치 부착 후 아세틸콜린에스터라제 억제율을 평가한 결과 6시간째 최고 억제율을 보이고 24시간 째에는평균 40-50 %을 억제율을 보였다. 또한 72시간까지도 20-30 % 억제율이 관찰되어 6~72시간 사이에는 모두 20 % 이상의 효소억제율이 관찰되었다.
- 패치에 대한 예방방어율을 평가한 결과 sarin 1.5 LD50에 대해 100 % 방어하였고 soman 1.5 LD50에 대해 100 % 방어하였다. 해독 촉진 효과에서는 KMARK-1 단독으로 투여했을 때보다 패치와 KMARK-1을 병용으로 사용 시 방어능이 유의적으로 상승하는 결과를 확인할 수 있었다.
- 5 LD50에 대해 100 % 방어하였다. 해독 촉진 효과에서는 KMARK-1 단독으로 투여했을 때보다 패치와 KMARK-1을 병용으로 사용 시 방어능이 유의적으로 상승하는 결과를 확인할 수 있었다.
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