트랜스 신남알데하이드(TCA)는 계피의 활성성분 중 하나로 알려져 있으며, 항바이러스, 항균, 항진균 뿐 아니라 일부 암세포주에서 항암 작용이 있다고 보고된 바 있다. 하지만, 위암세포주에서의 보고는 미비하며 그 작용기전에 대해서는 밝혀진 바가 없다. 본 연구에서는 위암 AGS 세포주에 대한 증식 억제작용 및 그 기전을 살펴보았다. TCA는 농도의존적으로 AGS 세포의 생존율을 억제하였다. AGS 세포 형태로 보아 TCA에 의한 세포사멸을 확인할 수 있었다. 그 기전을 확인하기 위하여, 세포사멸 관련 단백질의 발현양을 조사한 결과, TCA는 p53과 Bax의 단백질 발현을 증가시켰다. 또한, 분절된 caspase 9 및 PARP의 발현이 증가되는 것으로부터 TCA가 AGS 세포주의 세포사멸을 유도하였음을 알 수 있었다. 본 연구결과로부터 TCA가 위암에 대한 항암 활성이 있음을 확인하였으며, 추후 지속적인 연구를 통해 항암제 후보물질로 기대된다.
트랜스 신남알데하이드(TCA)는 계피의 활성성분 중 하나로 알려져 있으며, 항바이러스, 항균, 항진균 뿐 아니라 일부 암세포주에서 항암 작용이 있다고 보고된 바 있다. 하지만, 위암세포주에서의 보고는 미비하며 그 작용기전에 대해서는 밝혀진 바가 없다. 본 연구에서는 위암 AGS 세포주에 대한 증식 억제작용 및 그 기전을 살펴보았다. TCA는 농도의존적으로 AGS 세포의 생존율을 억제하였다. AGS 세포 형태로 보아 TCA에 의한 세포사멸을 확인할 수 있었다. 그 기전을 확인하기 위하여, 세포사멸 관련 단백질의 발현양을 조사한 결과, TCA는 p53과 Bax의 단백질 발현을 증가시켰다. 또한, 분절된 caspase 9 및 PARP의 발현이 증가되는 것으로부터 TCA가 AGS 세포주의 세포사멸을 유도하였음을 알 수 있었다. 본 연구결과로부터 TCA가 위암에 대한 항암 활성이 있음을 확인하였으며, 추후 지속적인 연구를 통해 항암제 후보물질로 기대된다.
trans-Cinnamaldehyde (TCA), as one of the active ingredients in cinnamon, has been reported to have antiviral, antibacterial and antifungal effects as well as anti-cancer effects in several cancer cell lines. However, reports of TCA in gastric cancer are rare, and its mechanism is unclear. In this s...
trans-Cinnamaldehyde (TCA), as one of the active ingredients in cinnamon, has been reported to have antiviral, antibacterial and antifungal effects as well as anti-cancer effects in several cancer cell lines. However, reports of TCA in gastric cancer are rare, and its mechanism is unclear. In this study, we investigated the anti-proliferative effect of TCA and its mechanism in gastric cancer AGS cells. TCA dose-dependently inhibited the cell viability of AGS cells. Our results suggested that TCA induces apoptosis through changes in cell morphology. To elucidate its mechanism, we investigated the expression level of apoptosis-related proteins. TCA induced the expression of p53 and Bax proteins, and then increased the cleaved caspase 9 and cleaved PARP. These results indicated that TCA triggers apoptosis via p53 pathway in AGS cells. Our results suggested that TCA might be a new anticancer drug candidate for gastric cancer.
trans-Cinnamaldehyde (TCA), as one of the active ingredients in cinnamon, has been reported to have antiviral, antibacterial and antifungal effects as well as anti-cancer effects in several cancer cell lines. However, reports of TCA in gastric cancer are rare, and its mechanism is unclear. In this study, we investigated the anti-proliferative effect of TCA and its mechanism in gastric cancer AGS cells. TCA dose-dependently inhibited the cell viability of AGS cells. Our results suggested that TCA induces apoptosis through changes in cell morphology. To elucidate its mechanism, we investigated the expression level of apoptosis-related proteins. TCA induced the expression of p53 and Bax proteins, and then increased the cleaved caspase 9 and cleaved PARP. These results indicated that TCA triggers apoptosis via p53 pathway in AGS cells. Our results suggested that TCA might be a new anticancer drug candidate for gastric cancer.
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문제 정의
따라서, 항암효능 평가에 대표적으로 쓰이는 세포주이다. 본 연구에서는 AGS세포주에서 MTT assay를 통해 TCA의 항암효과를 평가하였다. TCA를 AGS세포주에 24시간 및 48 시간 동안 처리한 후, 세포의 생존율을 비교분석한 결과, 농도 의존적으로 세포의 생존율이 감소하였다(Fig.
이와 같은 암세포의 증식 억제 효과는 유방암 세포주, 간암 세포주, 비소세포폐암 세포주, 대장암 세포주에서 보고된 바와5, 8-10)같은 양상을 나타냈다 . 아직까지 TCA가 위암 세포주의 증식을 억제하는 작용기전에 대해서는 알려진 바가 없으므로, 이에 대하여 조사하였다.
이에 대한 분자학적인 기전을 확인하기 위하여, 세포사멸과 관련된 단백질의 발현 정도를 분석하였다. 내재적 세포사멸 경로에서 작용하는 단백질인 p53, Bax, caspase 9 및 PARP의 발현 변화를 조사한 결과(Fig.
Milani 등 연구에서 TCA와 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate)의 병용처치가 세포생존율을 감소를 증가시킨다고 보고한 바 있다. 이와 같은 보고들을 토대로, 본 연구에서는 TCA가 위암 AGS 세포주에서 암세포 증식 억제 작용을 평가하고, 그 작용 기전을 알아보았다.
제안 방법
총 단백질은 BCA assay kit (Thermo scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 농도를 측정하였다. 10-12% SDS-PAGE로 단백질을 분리하고, semi-dry electro blotter (Peqlab, Erlangen, Germany)를 이용하여 PVDF membrane (Millipore, Burlington, MA, USA)에 옮긴 후 실온에서 1시간 동안 5% blotting-grade blocker (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 로 blocking하였다. 검출하고자 하는 단백질과 특이적으로 결합하는 1차 항체와 함께 4 C에서 밤새 반응시켰다.
AGS세포를 TCA (100µM)로 처리한 후 24시간 동안 배양한 후, protease inhibitor (GenDEPOT)와 phosphatase inhibitor (Roche, Basel, Switzerland)를 넣은 RIPA 완충액 (GenDEPOT) 처리하여 4 C에서 15 분 동안 반응시킨 후 cell scraper (SPL life science, Pocheon, Korea)를 사용하여 용해된 세포를 모았다. 용해된 세포는 4 C 원심분리기 (Labogene 1730R, Seoul, Korea)에서 14, 000 rpm, 15 분 동안 원심분리하여 상층액을 취했다.
AGS세포에 100μM TCA를 처리 또는 용매만 처리(대조군)하여 24시간 동안 배양한 후, PBS (Gibco, Grand Island, NY, USA)로 치환하고 바로 세포 형태의 변화를 현미경(Nikon ECLIPSE TS 100, Nikon Corporation, Tokyo, Japan) 40배율로 관찰하였다.
TCA에 의해 세포 생존율 감소가 세포사멸에 의한 것인지를 확인하기 위하여 100μM의 TCA를 24시간 처리한 조건에서 이후 실험을 진행하였다. 먼저, TCA에 의한 AGS 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다.
이후 실험을 진행하였다. 먼저, TCA에 의한 AGS 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. TCA를 처리한 세포에서는 대조군 세포에 비하여 수적으로 감소되었을 뿐 아니라 정상세포의 모습과는 다르게 수축되어 있으며 수포처럼 보이는 세포들이 관찰되었다(Fig.
2 차 항체는 Anti-mouse IgG (H+L) horseradish peroxidase conjugate와 Anti-rabbit IgG (H+L) horseradish peroxidase conjugate (Bio-Rad)을 각각 1:3000으로 희석하여 사용하였다. 이후, chemiluminescent 용액으로 반응시켜 FluorChem E (Proteinsimple, San Jose, CA, USA)으로 확인하였다.
대상 데이터
검출하고자 하는 단백질과 특이적으로 결합하는 1차 항체와 함께 4 C에서 밤새 반응시켰다. 1차 항체는 항 p53항체(Millipore), 항 caspase 9 항체(Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA) 및 항 PARP 항체(Cell Signaling Technology)은 1:1000, 항 Bax 항체(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)는 1:2000, 항 β-actin 항체(Sigma-Aldrich)는 1:5000으로 희석하여 사용하였다. 다음날, 실온에서 3 시간 동안 2차 항체와 함께 배양하였다.
다음날, 실온에서 3 시간 동안 2차 항체와 함께 배양하였다. 2 차 항체는 Anti-mouse IgG (H+L) horseradish peroxidase conjugate와 Anti-rabbit IgG (H+L) horseradish peroxidase conjugate (Bio-Rad)을 각각 1:3000으로 희석하여 사용하였다. 이후, chemiluminescent 용액으로 반응시켜 FluorChem E (Proteinsimple, San Jose, CA, USA)으로 확인하였다.
21739)는 한국세포주은행에서 분양받았다. AGS세포주는 RPMI-1640배지 (GenDEPOT, Katy, TX, USA)에 10% FBS (GenDEPOT), 1% penicillin-streptomycin (GenDEPOT)을 첨가한 혼합 배지를 사용하여 37 C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
인간 위암 AGS세포주(KCLB No. 21739)는 한국세포주은행에서 분양받았다. AGS세포주는 RPMI-1640배지 (GenDEPOT, Katy, TX, USA)에 10% FBS (GenDEPOT), 1% penicillin-streptomycin (GenDEPOT)을 첨가한 혼합 배지를 사용하여 37 C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
실험결과는 평균 ± 표준편차로 나타내고, 통계적 유의성은 GraphPad Prism v7.0 (GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA) 프로그램을 활용하여 일원분산분석(oneway ANOVA 및 Tukey’s post host test) 및 Student t-test를 수행하여 검증하였다. P 값이 0.
성능/효과
본 연구에서는 AGS세포주에서 MTT assay를 통해 TCA의 항암효과를 평가하였다. TCA를 AGS세포주에 24시간 및 48 시간 동안 처리한 후, 세포의 생존율을 비교분석한 결과, 농도 의존적으로 세포의 생존율이 감소하였다(Fig. 2). TCA 처리 48시간에서 IC50은 92.
활성화된 Bax는 미토콘드리아에서 분비된 cytochrome c에 의하여 caspase 9을 활성화시키고, PARP도 활성화시킴으로 , 활성화된 이들 분자가 세포사멸을 초래한다고 알려져 있다. TCA를 처리한 세포에서도 caspase 9과 PARP 의 활성형인 cleaved caspase 9및 cleaved PARP의 밴드가 확인되었으며 이는 세포사멸이 유도되었음을 보여준다.
관련된 단백질의 발현 정도를 분석하였다. 내재적 세포사멸 경로에서 작용하는 단백질인 p53, Bax, caspase 9 및 PARP의 발현 변화를 조사한 결과(Fig. 3B), TCA에 의하여 p53의 발현양이 유의적으로 증가되었다. 단백질 p53 은 종양 억제 유전자로 세포주기, DNA 복구, 복제 노화 및 세포사멸에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며 , 세포사멸 과정에 있어서 Bax를 활성화시키는 것으로 알려져 있다.
69μM이었다. 또한, 25µM TCA부터 유의적인 차이가 나타났으며, 고농도로 갈수록 시간에 따라 세포 생존 억제능의 차이가 커졌다. 이와 같은 암세포의 증식 억제 효과는 유방암 세포주, 간암 세포주, 비소세포폐암 세포주, 대장암 세포주에서 보고된 바와5, 8-10)같은 양상을 나타냈다 .
보고가 있었는데, 본 연구 결과로부터 AGS 세포주에서 TCA의 항암작용이 있음을 새로이 확인하였다. 또한, TCA 의 항암작용은 p53 경로를 통한 세포사멸을 유도함으로써 나타난다는 것을 밝혔다(Fig. 4). 기존에 보고된 타 암종뿐 만 아니라 위암세포에서도 TCA가 항암효과를 보였기에, 천연 유래 항암물질로서 개발 가능성을 시사하고 있다.
단백질 p53 은 종양 억제 유전자로 세포주기, DNA 복구, 복제 노화 및 세포사멸에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며 , 세포사멸 과정에 있어서 Bax를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구 결과에서도 p53과 마찬가지로 Bax 의 발현이 TCA에 의해 증가됨을 확인할 수 있었다. 활성화된 Bax는 미토콘드리아에서 분비된 cytochrome c에 의하여 caspase 9을 활성화시키고, PARP도 활성화시킴으로 , 활성화된 이들 분자가 세포사멸을 초래한다고 알려져 있다.
후속연구
기존에 보고된 타 암종뿐 만 아니라 위암세포에서도 TCA가 항암효과를 보였기에, 천연 유래 항암물질로서 개발 가능성을 시사하고 있다. 이를 위하여, AGS 세포주 이외의 위암 세포주에서의 실험 및 in vivo 시험을 포함한 추가적인 연구가 요구된다.
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