[논문]Hydrogen peroxide에 의해 유도된 남성 생식 세포 GC-1 cell에 미치는 오자연종환(五子衍宗丸)의 효과 연구

장문석; 이호철; 이승호; 박성규

doi:10.14374/hfs.2021.29.1.1

Hydrogen peroxide에 의해 유도된 남성 생식 세포 GC-1 cell에 미치는 오자연종환(五子衍宗丸)의 효과 연구
Study of Ojayeonjonghwan on hydrogen peroxide-induced oxidative stress in male reproductive GC-1 germ cell lines 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.29 no.1, 2021년, pp.1 - 8

장문석 (경희대학교 한의과대학 처방제형학교실) , 이호철 (경희대학교 대학원 기초한의과학과) , 이승호 (경희대학교 대학원 기초한의과학과) , 박성규 (경희대학교 한의과대학 처방제형학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The purpose of this study was to investigate the antioxidant activity of water extract of Ojayeonjonghwan (OYH) in GC-1 germ cell lines. Methods : DPPH radical scavenging activity and cell viability assays in GC-1 germ cell lines were performed. In addition, the protective effects of OYH against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in GC-1 germ cell lines were examined by measuring cell viability after H2O2 treatmet. The formation of ROS and the antioxidant enzymes activity such as SOD and catalase were measured in the same condition. Results : OYH scavenged DPPH radical dose-dependent manner and the IC50 was 63.79 ㎍/ml. OYH showed no cytotoxicity at concentration of 1, 10, 100 ㎍/ml. The hydrogen peroxide-induced cytotoxicity of GC-1 germ cell lines was protected to 53.66% by OYH at concentration of 10 ㎍/ml. OYH effectively inhibited ROS production in GC-1 germ cell lines. Mn SOD and catalase protein expression were significantly increased in GC-1 germ cell lines, but Cu/Zn SOD protein expression was not significantly changed. Conclusions : In conclusion, OYH has antioxidant activities against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in GC-1 germ cell lines.

주제어

표/그림 (6)

표 Table. 1. Constituents of Ojayeonjonghwan (OYH)
그림 Fig. 1. DPPH radical-scavenging activity of Ojayeonjonghwan (OYH). Values indicate mean ± S.E. of three replications.
그림 Fig. 2. Effect of Ojayeonjonghwan (OYH) on the viability of GC-1 cell lines. GC-1 cell lines were treated with OYH at 37℃ for 24 h. Each columns or points represent mean ± S.E. (n = 3). * significantly different from the normal value (*: p < 0.05).
그림 Fig. 3. Effect of Ojayeonjonghwan (OYH) on hydrogen peroxide-induced cytotoxicity of GC-1 cell lines. GC-1 cell lines treated with OYH were incubated in the presence of 100 μM H₂O₂ at 37℃ for 24 h. Each columns or points represent mean ± S.E. (n = 3). * significantly different from the normal value (***: p < 0.001). # significantly different from the control value (#: p < 0.05).
그림 Fig. 4. Effect of Ojayeonjonghwan (OYH) on hydrogen peroxide-induced ROS production of GC-1 cell lines. GC-1 cell lines treated with OYH were incubated in the presence of 100 μM H₂O₂ at 37℃ for 24 h. Total cell lysate from cultured cells were analyzed for ROS production. Each columns or points represent mean ± S.E. (n = 3). * significantly different from the normal value (**: p < 0.01). # significantly different from the control value (#: p < 0.05, ##: p < 0.01).
그림 Fig. 5. Effect of OYH on Cu/Zn SOD, Mn SOD and Catalase proteins expression in GC-1 cell lines. Analysis of western blotting was done on Cu/Zn SOD, Mn SOD, Catalse and β-tublin antibody. Normal is vehicle treated group. Control is hydrogen peroxide (100 μM) treated group. GC-1 cell lines treated with OYH (1, 10, 100 μg/ml) were incubated in the presence of 100 μM H₂O₂ at 37℃ for 24 h. β-tubulin was used as internal control.

AI 본문요약
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문제 정의

男子精虛無子, 陽事不擧의 치료에 활용되고 있는 五子衍種丸이 남성불임에 미치는 기전을 밝히기 위하여, 정자 발생과정 상 B type의 정원세포 (spermatogonia) 와 제 1정모세포 (primary spermatocytes) 사이에 속하는 GC-1 spg cell에 미치는 항산화작용을 연구하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
그러나 五子衍宗丸이 남성생식세포를 구성하는 GC-1 cell의 산화적 스트레스에 미치는 효과에 대한 연구는 보고된 바가 없다. 이에 남성생식세포를 구성하는 GC-1 cell에 대하여 五子衍宗丸이 미치는 영향을 관찰하기 위하여 DPPH radiclal scavenging activity, cell viability, 산화적 스트레스 모델로서 hydrogen peroxide를 처리한 후 cytotoxicity에 대한 항산화 효과, ROS생성 억제효과, superoxide dismutase (SOD) activity, catalase activity에 미치는 영향을 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

GC-1 cell에 대한 cell viability 결과에 근거하여 hydrogen peroxide에 의해 유도된 cytotoxicity를 측정하였다. Hydrogen peroxide에 의해 유도된 GC-1 celle 정상군에 비하여 각각 36.
Germ cell lines에 hydrogen peroxide를 처리한 후 농도별 시료를 처리하여 항산화 효소인 SOD Catalase protein 발현에 미치는 영향을 측정하였다. 100 mm tissue culture dish (BD Falcon, USA)에 10% FBS, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml)이 첨가된 DMEM 배지에 현탁된 3×10⁵ cells/ml의 cell을 8 ml 씩 넣었다.
Hydrogen peroxide에 의해 유도된 cytotoxicity 에 대한 五子衍種丸의 보호효과를 알아보기 위해 MTT test를 응용하여 실험하였다¹¹⁾. 96 well plate에 1×10⁵ cells/ml의 cell을 100 μl씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 PBS 용액으로 씻어주었다.
五子衍種丸의동결건조된 시료를 증류수에 녹여서 1, 5, 10, 50, 100, 500 μg/ml의 농도로 시액을 제조하였다. 양성 대조군으로 시료와 같은 농도의 ascorbic acid를 사용하였다.
1에 명시하였다 (Table 1). 枸杞子 36 g, 免絲子 28 g, 覆盆子 20 g, 車前子 12 g, 五味子 4 g으로총 100 g을 정확하게 중량을 측정한 뒤 1차 증류수 2, 000 ml에 넣어 90 분 동안 냉침하고, 환류 추출기를 이용하여 100℃ 가까이 온도가 상승하여 탕액이끓는 시점으로부터 90 분 동안 가열하여 추출한 다음, filter paper로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축액을 얻었다. 이 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조한 분말을 시료로 사용하였다.
실험하였다. 농도별 五子衍種丸 (1, 10, 100 μg/ml)과 100 μM의 H₂O₂ 처리 후 100 μl (100 μM)의 DCF-DA를 첨가하여 37℃ 조건에서 1시간 배양 하였다. Media를 제거하고 1X PBS 로 2회 세척 한 다음 새로운 serum free media 100 μl와 2X Cell Lysis buffer 100 μl를넣어 상온에서 5분간 배양하였다.
5 ml의 eppendorf tube에 담아 12,000 × g에서 10 분간 원심분리 하여 상층액을 취하고 상층액 중의 1 μl를 취해 Bradford's method¹²⁾로 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질 30 μg을 10% Tris-glycine gel에 SDS-PAGE를 실시하였다. SDS-PAGE후 gel를 nitrocellulose membrane에 120 mA에서 1시간 동안 transfer를 실시한 후 membranee 5% skim milk를 이용하여 1시간 실온에서 blocking하였다.

대상 데이터

9% (Duksan, Korea), tetrazolium salt 3, [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT; Sigma, USA), dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma, USA), hydrogen peroxide (Sigma, USA), Anti-Cu/Zn SOD, Mn SOD (Stressgen, USA)와 Anti- Catalase (Abcam, UK) 등이 사용되었다. 본 실험에 사용된 기기는 rotary evaporatory (Eyela, Japan), freeze dryer (Cooling & Heating Systems, Korea), deep freezer (Revco, USA), microplate spectrophotometer (Molecular Devices, USA), CO₂ incubator (Sanyo, Japan), Fluorescence plate reader (ThermoFisher Scientific, USA) 등이다.
본 실험에서 사용된 枸杞子, 免絲子, 覆盆子, 五味子, 車前구는 각각 서울특별시 동대문구 제기동 경동약령시장의 원광약업사를 통하여 구입하여, 경희대학교 처방제형학 교실에서 외부형태를 비교 조사하여 확인한 후 사용하였으며, 일부는 경희대학교 한의과대학 처방제형학 교실에 보관하였다.
USA)에서 구입하였다. 본 실험을 위해서 fetal bovine serum (FBS; GIBCO BRL, USA), dulbecco's modified eagle medium (DMEM; GIBCO BRL, USA), trypsin-EDTA (GIBCO BRL, USA), 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma, USA), ascorbic acid (Sigma, USA), ethanol 99.9% (Duksan, Korea), tetrazolium salt 3, [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT; Sigma, USA), dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma, USA), hydrogen peroxide (Sigma, USA), Anti-Cu/Zn SOD, Mn SOD (Stressgen, USA)와 Anti- Catalase (Abcam, UK) 등이 사용되었다. 본 실험에 사용된 기기는 rotary evaporatory (Eyela, Japan), freeze dryer (Cooling & Heating Systems, Korea), deep freezer (Revco, USA), microplate spectrophotometer (Molecular Devices, USA), CO₂ incubator (Sanyo, Japan), Fluorescence plate reader (ThermoFisher Scientific, USA) 등이다.
실험에 사용된 세포주는 생쥐의 Spermatogonia (GC-1 spg)로서 America Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하였다. 본 실험을 위해서 fetal bovine serum (FBS; GIBCO BRL, USA), dulbecco's modified eagle medium (DMEM; GIBCO BRL, USA), trypsin-EDTA (GIBCO BRL, USA), 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma, USA), ascorbic acid (Sigma, USA), ethanol 99.
五子衍種丸의동결건조된 시료를 증류수에 녹여서 1, 5, 10, 50, 100, 500 μg/ml의 농도로 시액을 제조하였다. 양성 대조군으로 시료와 같은 농도의 ascorbic acid를 사용하였다. 96 well microplate (Corning, USA)에 ethanol에 녹인 0.

데이터처리

실험성적은 평균치±표준오차 (Mean±S.E.)로 나타내었으며, 대조군과 실험군과의 평균의 차이는 Student's t-test로 검정하여 p < 0.05 일 때를 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

이론/모형

DPPH radical scavenging activity를 알아보기 위하여 Tanaka¹⁰⁾의 방법을 응용하였다. 五子衍種丸의동결건조된 시료를 증류수에 녹여서 1, 5, 10, 50, 100, 500 μg/ml의 농도로 시액을 제조하였다.
五子衍種丸을 구성하는 약재의 비율은 『東醫寶鑑』을 참고하였으며, 한약명 학명 생약명과 용량을 표 1에 명시하였다 (Table 1). 枸杞子 36 g, 免絲子 28 g, 覆盆子 20 g, 車前子 12 g, 五味子 4 g으로총 100 g을 정확하게 중량을 측정한 뒤 1차 증류수 2, 000 ml에 넣어 90 분 동안 냉침하고, 환류 추출기를 이용하여 100℃ 가까이 온도가 상승하여 탕액이끓는 시점으로부터 90 분 동안 가열하여 추출한 다음, filter paper로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축액을 얻었다.
五子衍種丸의 hydrogen peroxide에 의한 ROS 생성 억제 효과를 알아보기 위해 ROS detection kit (Cell biolabs, USA)의 manual을 이용하여 실험하였다. 농도별 五子衍種丸 (1, 10, 100 μg/ml)과 100 μM의 H₂O₂ 처리 후 100 μl (100 μM)의 DCF-DA를 첨가하여 37℃ 조건에서 1시간 배양 하였다.
五子衍種丸이 Germ cell lines의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 Mosmann 등¹¹⁾의 방법을 응용하였다. 96 well plate에 1×10⁵ cells/ml의 cell을 100 μl씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24 시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 PBS 용액으로 씻어주었다.
五子衍種丸이 생식세포의 성장 및 증식에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 五子衍種丸은 1, 10, 100 μg/ml 의 농도에서 GC-1 cell 생존율은 각각 102.
활성산소들은 분해하는 효소인 Cu/Zn SOD, Mn SOD, catalase의 활성도 측정을 위해 Western blot 을 실시하였다. GC-1 cell에서 五子衍種丸은 10, 100 μg/ml의 농도에서 hydrogen peroxide에 의해 산화가 유도된 대조군에 비해 Mn SOD, catalase 효소의 protein 발현을 증가시켰다.
활성산소들은 분해하는 효소인 Cu/Zn SOD, Mn SOD, catalase의 활성도 측정을 위해 Western blot 을 실시하였다. GC-1 cell에서 五子衍種丸은 10, 100 μg/ml의 농도에서 hydrogen peroxide에 의해 산화가 유도된 대조군에 비해 Mn SOD, catalase 효소의 protein 발현을 증가시켰다.

성능/효과

1. 五子衍種丸은 농도 의존적으로 DPPH radical 소거 활성을 증가시켰다.
2. GC-1 spg cell에 대한 cell viability를 측정한 결과 五子衍種丸은 최대 100 ug/ml의 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.
3. Hydrogen peroxide에 의해 유도된 cytotoxicity 에 대하여 五子衍種丸은 유의하게 GC-1 spg cell 의 생존율을 증가시켰다.
4. Hydrogen peroxide에 의해 산화가 유도된 GC-1 spg cell에서 五子衍種丸은 ROS 생성을 억제하였다.
5. 五子衍種丸은 hydrogen peroxide에 의해 산화가 유도된 GC-1 spg cell에서 Mn SOD와 catalase 의 단백질 발현량을 증가시켰으며, Cu/Zn SOD의 단백질 발현량은 유의한 변화가 나타나지 않았다. 이에 五子衍種丸Fe 남성생식세포 중 GC-1 spg cell에 대하여 항산화효과를 가지며, 산화작용에 의한 남성 불임의 치료에 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
五子衍種丸이 생식세포의 cell viability에 미치는 효과를 알아보기 위하여 MTT assay를 수행한 결과 GC-1 세포에서 五子衍種丸의 세포독성은 나타나지 않았다. GC-1 cell에 대한 cell viability 결과에 근거하여, hydrogen peroxide에 의해 유도된 cytotoxicity 를 측정한 결과 hydrogen peroxide에 의해 유도된 GC-1은 정상군에 비하여 36.65, %로 유의하게 cell viability가 감소하였으나, hydrogen peroxide에 의해 유도된 GC-1 cell에 대하여 五子衍種丸은 10 μg/ml 의 농도에서 cell viability가 53.66%의 유의한 보호 효과가 있는 것으로 나타났다. GC-1 cell에서 정상군에 비해 대조군의 ROS 생성이 유의하게 증가하였으며 (380.
Cu/Zn SOD에서 정상군과 대조군의 protein 발현이 명확하게 나타나지 않았으므로 五子衍種丸의 효과를 비교할 수 없었다. GC-1 cell에서 Mn SOD 및 catalase 효소의 protein 발현은 정상군에 비해 대조군에서 유의하게 감소하였으며, 五子衍種丸은 10, 100 μ g/ml의농도에서 대조군에 비해 Mn SOD 및 catalase 효소의 protein 발현이 증가하였다.
GC-1 cell에서 정상군에 비해 대조군의 ROS 생성이 유의하게 증가하였으며 (380.6 vs. 553.15 unit, p <0.01) 五子衍種丸은 1, 10, 100 μg/ml의 농도에서 각각 382.86, 461.11, 369.54 unit을 나타내어 대조군에 비해 ROS 생성이 억제됨을 알 수 있었다 (p <0.001, Fig. 4).
66%의 유의한 보호 효과가 있는 것으로 나타났다. GC-1 cell에서 정상군에 비해 대조군의 ROS 생성이 유의하게 증가하였으며 (380.6 vs. 553.15 unit, p <0.01), 대조군에 비해 五子衍種丸은 1, 10, 100 μg/ml의 농도에서 각각 382.86, 461.11, 369.54 unit을 나타내어 ROS 생성이 억제됨을 알 수 있었다. 활성산소들은 분해하는 효소인 Cu/Zn SOD, Mn SOD, catalase의 활성 도 측정을 위해 Western blot을 실시하였다.
3). Hydrogen peroxide에 의해 유도된 GC-1 cell에 대하여 五子衍種丸은 10 μg/ml의 농도에서 53.66, % 의 보호 효과를 나타내었다 (p < 0.05).
五子衍種丸의 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과 농도 의존적으로 DPPH radical 소거 활성이 증가하였다. 50%의 DPPH radical 소거 활성을 나타내는 화합물의 농도(IC₅₀)는 五子衍種丸은 63.
五子衍種丸의 농도에 따른 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과, ascorbic acid와 五子衍種丸은 모두 농도 의존적으로 DPPH radical 소거 활성이 증가하였다. 五子衍種丸은 각각 1, 5, 10, 50, 100, 500 μg/ml의 농도에서 0, 4.
37%의 높은 소거율을 나타내었는데 이는 기존의 연구에서 김의¹⁷⁾ 右歸飮, 최의¹⁸⁾ 八味地黃丸와 같은 腎虛로 인한 불임증에 사용된 처방보다 높은 소거율을 보여주었다. 五子衍種丸이 생식세포의 cell viability에 미치는 효과를 알아보기 위하여 MTT assay를 수행한 결과 GC-1 세포에서 五子衍種丸의 세포독성은 나타나지 않았다. GC-1 cell에 대한 cell viability 결과에 근거하여, hydrogen peroxide에 의해 유도된 cytotoxicity 를 측정한 결과 hydrogen peroxide에 의해 유도된 GC-1은 정상군에 비하여 36.
이상의 실험결과 五子衍宗丸은 DPPH radical 소거 활성이 있으며, GC-1 cell에 대한 세포독성이 나타나지 않았고, hydrogen peroxide에 의해 유발된 GC-1 cell의 산화 스트레스에 대하여 유의한 cell viability 보호 효과와 ROS 생성을 억제하였으며, Mn SOD 및 catalase 효소의 protein 발현이 증가하였다. 이로써 五子衍宗丸은 산화물질로부터 남성 생식세포를 보호하는 기전이 확인되었다.

후속연구

五子衍種丸은 hydrogen peroxide에 의해 산화가 유도된 GC-1 spg cell에서 Mn SOD와 catalase 의 단백질 발현량을 증가시켰으며, Cu/Zn SOD의 단백질 발현량은 유의한 변화가 나타나지 않았다. 이에 五子衍種丸Fe 남성생식세포 중 GC-1 spg cell에 대하여 항산화효과를 가지며, 산화작용에 의한 남성 불임의 치료에 응용할 수 있을 것으로 사료된다.

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