[논문]경남지역 종합병원에서 분리된 그람음성막대균으로부터 blaKPC 및 blaNDM 유전자 검출

양병선; 박지애

doi:10.15324/kjcls.2021.53.1.49

경남지역 종합병원에서 분리된 그람음성막대균으로부터 blaKPC 및 blaNDM 유전자 검출
Detection of blaKPC and blaNDM Genes from Gram-Negative Rod Bacteria Isolated from a General Hospital in Gyeongnam 원문보기

Korean journal of clinical laboratory science : KJCLS = 대한임상검사과학회지, v.53 no.1, 2021년, pp.49 - 59

양병선 (진주보건대학교 임상병리과) , 박지애 (진주보건대학교 임상병리과)

초록
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본 연구는 국내에서 가장 빈번히 검출되는 CPE의 유전자형 중 blaKPC 및 blaNDM 유전자의 진단으로 기존의 표현형 검사 및 일반 PCR 검사보다 시간 단축 및 사후 분석의 단점이 보완된 real-time PCR의 융해 곡선을 이용한 분석법에 대해 알아보았다. 표현형적 검사결과 MHT는 35균주 중 25균주에서 양성을 확인하고, CIT는 meropenem+PBA 및 meropenem+EDTA에서 각각 14균주의 양성을 확인하였다. PCR 검사결과 KPC 25균주에서 증폭 산물을 확인하였고, K. pneumoniae 10균주, E. coli 5균주, A. baumannii 5균주, P. aeruginosa 4균주, P. putida 1균주로 나타났다. NDM은 8균주에서 증폭 산물을 확인하였고, K. pneumoniae 2균주, E. coli 3균주, P. aeruginosa 1균주, E. cloacae 1균주, P. rettgeri 1균주로 나타났다. 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 이용한 융해 곡선 분석결과 KPC 25균주, NDM은 8균주에서 증폭을 확인하였고, PCR 결과와 100% 일치함을 확인하였다. 결론적으로 real-time PCR을 이용한 신속하고 특이성이 높은 CRE의 조기진단은 공중보건 및 감염 중에 항균 관리접근법을 통한 병원 내 감염확산 방지 및 통제가 가능할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study investigated the use of real-time PCR melting curves for the diagnosis of blaKPC and blaNDM genes among the most frequently detected carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Korea. As a means of addressing the shortcomings of phenotype tests and conventional PCR. The modified Hodge test confirmed positivity in 25 of 35 strains, and carbapenemase inhibition testing confirmed positivity in 14 strains by meropenem+PBA or meropenem+EDTA. PCR analysis showed amplification products in 25 strains of Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPC), 10 of K. pneumoniae, 5 of E. coli, 5 of A. baumannii, 4 of P. aeruginosa, and 1 of P. putida. New Delhi metallo β-lactamase (NDM) identified amplification products in 8 strains, that is, 2 K. pneumoniae, 3 E. coli, 1 P. aeruginosa, 1 E. cloacae, and 1 P. retgeri strains. Real-time PCR melting curve analysis confirmed amplification in 25 strains of KPC and 8 strains of NDM, and these results were 100% consistent with PCR results. In conclusion, our findings suggest early diagnosis of carbapenem resistant Enterobacteriaceae by real-time PCR offers a potential means of antibacterial management that can prevent and control nosocomial infection spread.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Primers for the detection of carbapenemase-producing bacteria
그림 Figure 1. Frequency of detection in specimens.
표 Table 2. Carbapenem resistance gram negative rod bacteria analyzed in screening test
그림 Figure 2. Result of modified Hodge test (MHT) and carbepenemase inhibition test (CIT). 1) The MHT performed on a MacConkey plate. Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumanni, positive result; Pseudomonas aeruginosa negative result. 2) CIT reading result. (A) negative, (B) Mero+EDTA positive, (C) Mero+PBA positive.
그림 Figure 3. PCR amplification profile of the bla_KPC and bla_NDM gene from the gram negative rod bacteria isolates. 1) bla_KPC PCR product size of 785 bp and 2) bla_NDM PCR product size of 621 bp. M, 100 bp DNA ladder marker.
표 Table 3. Gram negative rod bacteria showing positive results in modified Hodge test and carbepenemase inhibition test (MHT; N=25, Mero+EDTA; N=14, Mero+PBA; N=14)
그림 Figure 4. Melting curve analysis of bla_KPC and bla_NDM. 1) melting curve analysis of bla_KPC amplicon was generated that showed the fragment Tm 87.5°C and 2) melting curve analysis of bla_NDM amplicon was generated that showed the fragment Tm 88°C.

AI 본문요약
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문제 정의

이처럼 MHT는 CLSI가 carbapenemase 생산 균주의 표현형 검출을 위해 권장하는 테스트이지만 MHT 의 해석에 문제가 있고 일부 분리된 균주에서 비교적 높은 위양성 및 위음성 결과 비율이 있으므로 carbapenemase 생산의 최종 확인에는 부적합하다. 또다른 표현형을 이용한 분석 방법으로 여러 억제제 기반 테스트가 있으며[2, 28], 본 연구에서는 유전자형 검출을 위하여 억제제 기반 테스트인 CIT 검사를 실시하였다.
본 연구는 국내에서 가장 빈번히 검출되는 CPE의 유전자형 중 bla_KPC 및 bla_NDM 유전자의 진단으로 기존의 표현형 검사 및 일반 PCR 검사보다 시간 단축 및 사후 분석의 단점이 보완된 real-time PCR의 융해 곡선을 이용한 분석법에 대해 알아보았다. 표현형적 검사결과 MHT는 35균주 중 25균주에서 양성을 확인하고, CIT는 meropenem+PBA 및 meropenem+EDTA 에서 각각 14균주의 양성을 확인하였다.
그러나 기존의 PCR을 이용한 분자 방법은 사후 PCR 분석에 대한 필요성 때문에 종종 시간과 비용이 많이 소요되므로, carbapenemase 등과 같은 저항성 유전자를 대상으로 한 real-time PCR 방식이 최근 빈번하게 적용됐다[35]. 본 연구에서는 저렴하고 사용이 간편한 등 많은 장점을 가져 광범위하게 활용되는 SYBR Green을 이용한 융해 곡선 분석을 실시하였으며, 비특이적 반응 등의 SYBR Green의 단점을 보완하고자 검증된 primer를 활용하여 분석을 실시하였다.
이에 본 연구는 감염관리를 위한 CPE의 시기적절하고 정확한 검출을 위하여 경남지역 종합병원에서 2018년 10월부터 2019년 10월까지 수집된 carbapenem 약제에 내성이 확인된 그람 음성 막대균주를 이용하여 국내에서 가장 빈번히 검출되는 CPE의 유전자형 중 bla_KPC 및 bla_NDM 유전자의 진단으로 기존의 표현형적 검사 및 PCR 방법보다 시간 단축 및 사후 분석 등의 단점이 보완된 real-time PCR의 융해 곡선을 이용한 분석 방법에 대해 알아보았다.
이에 본 연구는 경남지역 종합병원에서 분리된 35균주를 이용하여 국내에서 가장 빈번히 검출되는 CPE의 유전자형 중 bla_KPC 및 bla_NDM 유전자의 real-time PCR의 융해곡선을 이용한 분석 방법으로 보다 신속한 유전자 진단법에 대해 알아보고자 하였다.

제안 방법

5 mL에 넣어 1:10으로 희석하였고, 그 후 MacConkey 배지에 고르게도 말하였다. 3∼5분 건조 후 각각 10 μg imipenem, meropenem 및 ertapenem 감수성 검사용 디스크를 배양접시 가운데에 올려준 후, 검사하고자 하는 균주를 백금이에 묻혀 디스크에서 배양접시 가장자리까지 그어준다. 접종된 배양접시는 배양기에서 18∼24시간 배양한 후 다음날 획선된 균주 주위로 E.
유전자형 검출을 위하여 carbapenemase inhibition test (CIT) 검사를 실시하였다. 3개의 meropenem 디스크 중 한 개에는 class A carbapenemase (KPC)의 검출을 위해 PBA 시약을, 다른 한 개에는 class B carbapenemase (MBL)의 검출을 위해 EDTA 시약을 각각 10 μL씩 떨어트렸다. 37℃ 배양기에서 16∼20시간 배양한 후 각 디스크의 억제대를 측정 후 판독하였다(Figure 2-2).
Carbapenemase 선별시험인 디스크 확산법에서 KPC 및 NDM 생성균주로 의심되는 균주에서 DNA을 추출하여 PCR을 실시하였다. 먼저 의심 균주는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, Wisconsin, USA)의 Gram negative (GN)방법을 이용하여 DNA 추출을 수행하였다.
AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea) 안에 각각 5 pmol의 primer 1 μL, DNA 2 μL, 증류수를 혼합하여 총 부피 20 μL의 반응용액을 만들었다. Dual block PCR C-1000 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., California, USA)를 이용하여 95℃에서 5분간 반응 후, 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃에서 1분씩 35회 증폭 반응을 시키고, 72℃에서 5분간 연장반응을 시켰다. 증폭된 PCR 반응 산물은 ethidium bromide (EtBr)를 포함한 2% agarose gel에서 100 volt 전압으로 40분간 전기영동하여 밴드를 확인하였다.
Imipenem, meropenem 및 ertapenem 약제를이용하였으며, 항생제 감수성 시험은 CLSI 가이드라인의 항생제에 대한 내성판정 기준으로 하였고[11, 12] 결과는 Table 2와 같다. 그 후 선별시험인 MHT를 실시하여 결과를 판독하였다 (Figure 2-1).
그 후 carbapenemase 표현형 검출은 CLSI 에서 설명한 modified Hodge test (MHT)를 이용하였다. MHT를 시행하기 위해 carbapenem 감수성 균주인 E. coli ATCC 25922를 McFarland No. 0.5 탁도로 균주 부유액을 만들었다. 탁도를 맞춘 균주 부유액 0.
Real-time PCR의 융해 곡선(melting curve) 분석을 통한 유전자형 진단을 위하여 iQ SYBR Green Supermix (Bio- Rad Laboratories, Inc., California, USA)를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 반응용액은 10 µL의 iQ SYBR Green Supermix, 1 μL의 primer 혼합액, 1 µL DNA 및 8 μL의 증류수를 넣어 반응액 20 µL를 제조하였다.
1 sequencing kit (Applied Biosystems, Massachusetts, USA)와 ABI3730XL (Applied Biosystems, Massachusetts, USA)을 이용하여 염기서열 분석을 실시하였다. 결정된 염기서열의 비교분석은 NCBI에서 제공하는 blast 프로그램을 이용하였다.
먼저 의심 균주는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, Wisconsin, USA)의 Gram negative (GN)방법을 이용하여 DNA 추출을 수행하였다. 그 후 carbapenem 분해효소 중 2종(KPC, NDM) 에 대한 유전자 검사를 시행하였다(Table 1). AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea) 안에 각각 5 pmol의 primer 1 μL, DNA 2 μL, 증류수를 혼합하여 총 부피 20 μL의 반응용액을 만들었다.
그 후 시간이 지나면 card만 잘려 들어가게 되고, 하루가 지나고 VITEK 프로그램의 ‘setup test post entry’ 에서 ‘accession #’에 샘플번호를 입력하고 저장 버튼을 누른다. 그 후 동정된 균주 및 정확도를 확인한다.
Imipenem, meropenem 및 ertapenem 약제를이용하였으며, 항생제 감수성 시험은 CLSI 가이드라인의 항생제에 대한 내성판정 기준으로 하였고[11, 12] 결과는 Table 2와 같다. 그 후 선별시험인 MHT를 실시하여 결과를 판독하였다 (Figure 2-1). Ertapenem을 이용한 MHT 결과 35균주 중 25 균주에서 양성 결과를 확인하였다.
rettgeri 1균주로 나타났다. 그 후 염기서열 분석을 통해 유전자형을 확인하였으며, NCBI에서 제공하는 blast 프로그램을 이용하여 염기서열의 비교분석을 하였다. bla_KPC 유전자의 경우 Genebank No.
시약을 떨어뜨리지 않은 meropenem의 억제대를 기준으로 시약을 떨어트린 억제 대의직경과의 차이가 ≤3 mm는 negative, 4 mm는 weak positive, ≥5 mme positive로 판독하였다. 그리고 CRE의 선별검사로 이용되는 MHT와 CIT의 결과를 바탕으로 통합 해석을 하였다[18].
분석은 모두 2 반복 실험으로 진행하였다. 그리고 표준 곡선을 이용하여 최소검출농도(limit of detection, LOD)를 확인하였고 SYBR green에서의 비특이적 증폭 산물의 생성 여부를 확인을 위하여 no-template control (NTC)을 함께 실시하였다. NTC는 주형을 제외한 나머지 반응액으로 분석에 이용한 반응조건과 동일하게 진행하였다.
균액의 튜브와 GN kit를카셋트에 꽂아주고, 뾰족한 선 부분이 균액에 들어가도록 한다. 다음으로 VITEK 프로그램을 실행한 후 장치 왼쪽 위의 filler 문을 열고 카셋트를 넣어 필링을 실시하고 완료되면 카셋트를 빼낸다. VITEK 장치 오른쪽 아래에 있는 loader에 문이 열리면카셋트를 넣는다.
95℃에서 5분 반응 후 95℃에서 10초, 60℃에서 30초, 72℃에서 10초의 반응을 40회 반복하였다. 마지막 PCR 반응이 끝난 후 65℃에서 95℃까지 초당 0.5℃의 속도로 온도를 증가시키면서 융해 곡선을 모니터링 하였다.
분석에 이용된 qbla_KPC primer는 이전의 연구[21]에서 항균제 감수성 검사를 통해 β-lactam 항생제의 여러 등급에 내성을 갖는 159 그람음성균주로부터 SYBR Green I를 기반으로 한 real-time PCR 분석에서 bla_KPC 유전자의 106 base pair (bp) 산물을 증폭시키도록 설계되었다. SYBR Green I를 이용한 증폭산물의 융해곡선 분석을 통해 bla_KPC 유전자를 확인하였으며, Tm 값은 약 89℃에서 검출되었다.
분석에 이용된 모든 균주에 대해 carbapenem 분해효소 중 2종(bla_KPC, bla_NDM)에 대한 유전자검사를 시행하였다. 분석 결과 35균주 중 bla_KPC 유전자는 25개의 양성 균주를 bla_NDM 유전자는 8개의 양성 균주를 확인하였다(Figure 3).
분석에 이용한 분리 배양된 35균주는 Gram nagative (GN) kit를 사용하여 VITEK 2 automated instrument ID system (BioMérieux, Marcyl’Etoile, France)으로 세균 동정을 하였다. 먼저 각각의 test tube에 0.
실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용한 균주의 분석은 모두 2 반복 실험으로 진행하였다. 그리고 표준 곡선을 이용하여 최소검출농도(limit of detection, LOD)를 확인하였고 SYBR green에서의 비특이적 증폭 산물의 생성 여부를 확인을 위하여 no-template control (NTC)을 함께 실시하였다.
3∼5분 건조 후 각각 10 μg imipenem, meropenem 및 ertapenem 감수성 검사용 디스크를 배양접시 가운데에 올려준 후, 검사하고자 하는 균주를 백금이에 묻혀 디스크에서 배양접시 가장자리까지 그어준다. 접종된 배양접시는 배양기에서 18∼24시간 배양한 후 다음날 획선된 균주 주위로 E. coli ATCC 25922 균주가 클로버 잎과 같이 움푹 들어간 상태(clover leaf-like indentation)로 자라면 양성으로 판정하였다[11, 12]. 선별검사에서 유전자형 검출에 이용되는 carbapenemase inhibition test (CIT)는 특정 억제제를 추가하여 carbapenemase의 활성을 억제하는 원리를 이용한 검사이다.
, California, USA)를 이용하여 95℃에서 5분간 반응 후, 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃에서 1분씩 35회 증폭 반응을 시키고, 72℃에서 5분간 연장반응을 시켰다. 증폭된 PCR 반응 산물은 ethidium bromide (EtBr)를 포함한 2% agarose gel에서 100 volt 전압으로 40분간 전기영동하여 밴드를 확인하였다. 확인된 PCR 산물은 QIA quick gel extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하였고, 그 후 BigDye Terminator V3.
증폭된 PCR 반응 산물은 ethidium bromide (EtBr)를 포함한 2% agarose gel에서 100 volt 전압으로 40분간 전기영동하여 밴드를 확인하였다. 확인된 PCR 산물은 QIA quick gel extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하였고, 그 후 BigDye Terminator V3.1 sequencing kit (Applied Biosystems, Massachusetts, USA)와 ABI3730XL (Applied Biosystems, Massachusetts, USA)을 이용하여 염기서열 분석을 실시하였다. 결정된 염기서열의 비교분석은 NCBI에서 제공하는 blast 프로그램을 이용하였다.

대상 데이터

이러한 CIT의 검사방법 및 결과해석은 2015년 질병관리본부 과대한 임상미생물학회에서 제시한 CPE 진단법 지침서를 따랐다 [18]. 검사대상 균주는 McFarland No. 0.5 탁도로 균주 부유액을 만들고, Muller Hinton 배지에 도말한 후 meropenem 디스크 3개를 적절한 간격으로 놓는다. 3개의 meropenem 디스크 중 한 개에는 PBA 시약을, 다른 한 개에는 EDTA 시약을 각각 10 μL씩 떨어트린다.
본 연구의 분석에 사용한 검체는 경남 지역 종합병원에서 수집된 35균주를 대상으로 하였고, 균주의 식별은 VITEK 2 automated instrument ID system (BioMérieux, Marcyl’Etoile, France)에 의하여 확인하였다. 분석결과 Klebsiella pneumoniae 12균주, Escherichia coli 7균주, Acinetobacter baumannii 6 균주, Pseudomonas aeruginosa 6균주, Enterobacter cloacae 2균주, Providencia rettgerii 1균주, Pseudomonas putida 1균주를 확인하였다.
분석에 사용한 검체는 경남지역 종합병원에서 2018년 10월부터 2019년 10월까지 수집된 imipenem, meropenem 및 ertapenem에 약제 내성이 확인된 그람 음성 막대균 35 균주를 대상으로 분석에 이용하였다.
확산법을 시행하였다. 시험에 이용한 균주는 균주 부유액 탁도를 McFarland No. 0.5로 맞춘 후 Mueller Hinton 배지에 면봉으로 고루 접종하였다. 접종한 균주가 마른 뒤 배지의 중앙에 imipenem, meropenem 및 ertapenem (10 μg, BBL, Cockeysville, MI, USA)를 놓은 후 37℃ 배양기에서 18∼24 시간 배양한다.

데이터처리

그리고 유전자형을 확인할 수 있다고 알려진 CIT 검사와 MHT 결과를 바탕으로 한 통합 해석 결과와 PCR 결과를 비교분석하였다. 분석결과 통합해석에서 KPC 생성균주는 11균주, PCR 검사는 25균주가 양성으로, 표현형적 검사법에서 14균주 (44%)의 위음성을 확인하였다.

이론/모형

항균제별 최소발육억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)의 해석은 CLSI의 기준을 따라 양성으로 판단하였다[11]. 그 후 carbapenemase 표현형 검출은 CLSI 에서 설명한 modified Hodge test (MHT)를 이용하였다. MHT를 시행하기 위해 carbapenem 감수성 균주인 E.
먼저 분리된 35균주를 동정한 후 식별된 모든 균주에 대해서는 carbapenem 분해효소 선별시험인 디스크 확산법을 시행하였고, 항생제 감수성 시험은 imipenem, meropenem 및 ertapenem를 이용하여 CLSI 가이드라인에 따라 시행 및 판독하였다. 그 후 선별시험인 MHT를 실시하여 결과를 판독하였고 35균주 중 25균주에서 양성을 확인하였다.
먼저 의심 균주는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, Wisconsin, USA)의 Gram negative (GN)방법을 이용하여 DNA 추출을 수행하였다. 그 후 carbapenem 분해효소 중 2종(KPC, NDM) 에 대한 유전자 검사를 시행하였다(Table 1).
분석에 이용한 35균주는 carbapenemase 선별시험인 디스크 확산법을 시행하였다. 시험에 이용한 균주는 균주 부유액 탁도를 McFarland No.
반응용액은 10 µL의 iQ SYBR Green Supermix, 1 μL의 primer 혼합액, 1 µL DNA 및 8 μL의 증류수를 넣어 반응액 20 µL를 제조하였다. 실시간 중합 효소 연쇄반응은 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc., California, USA)를이용하였다. 95℃에서 5분 반응 후 95℃에서 10초, 60℃에서 30초, 72℃에서 10초의 반응을 40회 반복하였다.
유전자형 검출을 위하여 carbapenemase inhibition test (CIT) 검사를 실시하였다. 3개의 meropenem 디스크 중 한 개에는 class A carbapenemase (KPC)의 검출을 위해 PBA 시약을, 다른 한 개에는 class B carbapenemase (MBL)의 검출을 위해 EDTA 시약을 각각 10 μL씩 떨어트렸다.
Class A carbapenemase (KPC)의 검출을 위해서는 phenylboronic acid (PBA)를, class B carbapenemase (metallo-β-lactamase, MBL)의 검출을 위해서는 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 억제제로 이용한다. 이러한 CIT의 검사방법 및 결과해석은 2015년 질병관리본부 과대한 임상미생물학회에서 제시한 CPE 진단법 지침서를 따랐다 [18]. 검사대상 균주는 McFarland No.
임상검체 중 식별된 모든 균주에 대해서는 디스크 확산법을 시행하였다. Imipenem, meropenem 및 ertapenem 약제를이용하였으며, 항생제 감수성 시험은 CLSI 가이드라인의 항생제에 대한 내성판정 기준으로 하였고[11, 12] 결과는 Table 2와 같다.
접종한 균주가 마른 뒤 배지의 중앙에 imipenem, meropenem 및 ertapenem (10 μg, BBL, Cockeysville, MI, USA)를 놓은 후 37℃ 배양기에서 18∼24 시간 배양한다. 항균제별 최소발육억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)의 해석은 CLSI의 기준을 따라 양성으로 판단하였다[11]. 그 후 carbapenemase 표현형 검출은 CLSI 에서 설명한 modified Hodge test (MHT)를 이용하였다.

성능/효과

그리고 억제제를 이용하여 유전자형을 알아볼 수 있는 CIT 검사에서 MBL 억제제로 흔히 사용되는 EDTA는 세균 외부 세포막의 투과성을 증가 시켜, 특히 Acinetobacter에 대해 비특정 위양성 결과를 발생시킬 수 있다[33, 34]. CIT 검사와 PCR 검사의 비교 분석한 결과, A. baumannii 1균주에서 CIT 검사는 양성이나 PCR 검사 결과에서는 음성으로 위양성 결과를 확인하였고, 이는 EDTA는 세균 외부 세포막의 투과성을 증가시켜, 특히 Acinetobacter 에 대해 비특정 위양성 결과를 발생한 것으로 보인다.
bla_KPC 유전자의 경우 Genebank No. CP054782.1에서 상동성(homology)은 평균 99%이며, 원래 서열보다 평균 3 개 염기의 누락(Gap 1%)을 확인하였다. bla_NDM 유전자의 경우 Genebank No.
그 후 선별시험인 MHT를 실시하여 결과를 판독하였다 (Figure 2-1). Ertapenem을 이용한 MHT 결과 35균주 중 25 균주에서 양성 결과를 확인하였다. 분석결과 K.
9%로 뒤를 이었다. KPC-2에서 K. pneumoniae 73.1%, E. coli는 15.8%로 나타났으며 NDM-1은 Enterobacter cloacae 복합체에서 23.3% 분리되었다.
bla_NDM 유전자의 경우 Genebank No. LC₅₃6682.1에서 상동성(homology)은 평균 99%이며, 원래 서열보다 평균 1.5개 염기의 누락(Gap 1%)을확인하였다.
coli 4 균주로 나타났다. Meropenem+EDTA의 분석결과 35균주 중 14 균주에서 양성을 확인하였고, 균주는 A. baumannii 5균주, K. pneumoniae 2균주, E. coli 2균주, P. aeruginosa 2균주, E. cloacae 2균주, P. rettgeri 1균주로 나타났다(Table 3). 그리고 MHT와 CIT의 결과를 바탕으로 통합 해석을 하였고 [18], 분석결과 KPC 11균주, class B 및 추정 class B cabapenemase 10균주, class D cabapenemase 4균주, AmpC 추정 3균주, non cabapenemase 3균주를 확인하였다 (Table 2).
putida 1균주로 나타났다. NDMe 8균주에서 증폭 산물을 확인하였고, K. pneumoniae 2균주, E. coli 3균주, P. aeruginosa 1균주, E. cloacae 1균주, P. rettgeri 1균주로 나타났다. 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 이용한 융해 곡선 분석결과 KPC 25균주, NDMe 8균주에서 증폭을 확인하였고, PCR 결과와 100% 일치함을 확인하였다.
분석 결과 35균주 중 bla_KPC 유전자는 25개의 양성 균주를 bla_NDM 유전자는 8개의 양성 균주를 확인하였다(Figure 3). PCR 검사 결과음성으로 확인된 bla_KPC 유전자는 35균주 중 10개의 균주에서 음성을 확인하였고, K. pneumoniae 2균주, E. coli 2균주, P. aeruginosa 2균주, E. cloacae 2균주, A. baumannii 1균주, P. rettgeri 1균주로 나타났다. bla_NDM 유전자는 35균주 중 27 개의 음성균주가 확인되었으며, K.
표현형적 검사결과 MHT는 35균주 중 25균주에서 양성을 확인하고, CIT는 meropenem+PBA 및 meropenem+EDTA 에서 각각 14균주의 양성을 확인하였다. PCR 검사결과 KPC 25균주에서 증폭 산물을 확인하였고, K. pneumoniae 10 균주, E. coli 5균주, A. baumannii 5균주, P. aeruginosa 4 균주, P. putida 1균주로 나타났다. NDMe 8균주에서 증폭 산물을 확인하였고, K.
산물을 증폭시키도록 설계되었다. SYBR Green I를 이용한 증폭산물의 융해곡선 분석을 통해 bla_KPC 유전자를 확인하였으며, Tm 값은 약 89℃에서 검출되었다. 그리고 연구결과 표현 형적 검사인 MHT 및 염기서열 분석과 비교하여 실시간 PCR 분석의 특이성과 민감도는 100%로 평가되었으며, 실시간 PCR 검사는 높은 분석 민감도와 특수성을 가진 KPC-harbing 균주를 빠르고 정확하게 검출할 수 있었다[21].
putida 1균주로 나타났다. bla_NDM 8균주는 K. pneumoniae 2균주, E. coli 3균주, P. aeruginosa 1균주, E. cloacae 1균주, P. rettgeri 1균주로 나타났으며, 이는 PCR 결과와 100% 일치하였다. 증폭된 유전자의 평균 cycle threshold (Ct) 값은 bla_KPC 의 경우 17.
rettgeri 1균주로 나타났다. bla_NDM 유전자는 35균주 중 27 개의 음성균주가 확인되었으며, K. pneumoniae 10균주, E.coli 4균주, A. baumannii 6균주, P. aeruginosa 5균주, P. putida 1균주, E. cloacae 1균주로 나타났다.
결론적으로 CPE의 조기진단에 있어 real time PCR을 이용한 검사법은 기존의 표현형적 검사법이나 일반적인 PCR 검사법과 비교하여 보다 신속하고 특이성이 높게 검출이 가능하여, 신속한 진단으로 항생제 내성의 경향은 부상하는 병원균에 대한 중요한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 공중보건 및 감염 중에 항균 관리접근법을 통한 병원 내 감염확산 방지 및 통제가 가능할 것으로 사료된다.
그 후 선별시험인 MHT를 실시하여 결과를 판독하였고 35균주 중 25균주에서 양성을 확인하였다.
그 후 정확한 유전자 진단을 위해 분석에 이용된 모든 균주에 대해 bla_KPC, bla_NDM에 대한 유전자 검사를 시행하였으며, 분석 결과 bla_KPC 유전자는 25균주, bla_NDM 유전자는 8균주에서 양성을 확인하였다(Figure 3). 양성으로 나온 균주는 염기서열 분석을 통해 유전자형을 확인하였으며, 그 결과 bla_KPC 유전자는 평균 99%, bla_NDM 유전자는 평균 99%의 상동성(homology) 을 확인하였다.
연구에 따르면 감염의 시작과 전달 사이의 48∼72시간 이내에 항생제의 적절한 처리는 대단히 중요하다[16, 17]. 그러므로 신속한 진단 테스트 결과가 중요한 시간 동안 항생제 선택에 도움이 되며, 적절한 항생제 치료의 가능성을 높일 수 있다. 따라서 CRE, 특히 CPE의 시기적절하고 정확한 검출은 임상 치료와 감염 예방에 필수적이라 할 수 있다.
rettgeri 1균주로 나타났다(Table 3). 그리고 MHT와 CIT의 결과를 바탕으로 통합 해석을 하였고 [18], 분석결과 KPC 11균주, class B 및 추정 class B cabapenemase 10균주, class D cabapenemase 4균주, AmpC 추정 3균주, non cabapenemase 3균주를 확인하였다 (Table 2).
특이성 문제가 발생할 수 있다[29]. 그리고 β- lactam-chelator 조합에 기초한 MBL 검출 방법은 K. pneumoniae와 E. coli에 대해 우수한 성능을 발휘하지만, 다른 장내세균 종에 대해서는 체계적으로 검사되지 않았다. 또한, MBL 검출 방법의 특이성은 킬레이트 작용제의 영향으로 손상되어 비특이적으로 작용하고 다른 프로세스에 영향을 미칠 수 있다는 점을 반드시 감안하여야 한다[30-32].
SYBR Green I를 이용한 증폭산물의 융해곡선 분석을 통해 bla_KPC 유전자를 확인하였으며, Tm 값은 약 89℃에서 검출되었다. 그리고 연구결과 표현 형적 검사인 MHT 및 염기서열 분석과 비교하여 실시간 PCR 분석의 특이성과 민감도는 100%로 평가되었으며, 실시간 PCR 검사는 높은 분석 민감도와 특수성을 가진 KPC-harbing 균주를 빠르고 정확하게 검출할 수 있었다[21]. 또한 융해곡선 분석에 이용된 qbla_NDM primer는 알려진 모든 bla_NDM (bla_NDM- 1∼7) 대립유전자와 동일함을 확인하였다[22].
0%이었다. 그리고 일반적으로 최소 1 개의 carbapenemase producing Enterobacteriaceae (CPE) 에 대해 58.1%가 양성반응을 보였으며, KPC-2가 46%로 가장 일반적인 CPE형으로 나타났으며, New Delhi metallo β- lactamase (NDM)-1이 5.9%로 뒤를 이었다. KPC-2에서 K.
73으로 나타났으며, 음성으로 나타난 균주에서는 증폭 산물이 없었다. 그리고 증폭 산물의 융해 곡선 분석 결과 bla_KPC는 melting temperature (Tm) 87.5℃, bla_NDM은 Tm 88℃를 확인하였다(Figure 4). 양성으로 확인된 검체를 이용하여 표준곡선분석을 실시였고 10⁰ 희석한 검체에서 최소검출농도(limit of detection, LOD)를확인한 결과 bla_KPC 유전자는 22 ng/mL, bla_NDM 유전자는 27.
분석결과 통합해석에서 KPC 생성균주는 11균주, PCR 검사는 25균주가 양성으로, 표현형적 검사법에서 14균주 (44%)의 위음성을 확인하였다. 그리고 통합해석 결과에서 NDM 생성 추정 균주는 14균주, PCR 검사는 8균주가 양성으로, 표현형적 검사법에서 6균주(43%)의 위양성을 확인하였다.
본 연구에서는 SYBR green을 이용한 융해곡선 분석으로 bla_KPC와 bla_NDM 유전자의 검출 유무를 확인하였으며, 분석 결과 기존의 연구와 마찬가지로 real-time PCR의 결과가 100% 일치한다는 것을 확인하였다.
분석 결과 35균주 중 bla_KPC 유전자는 25개의 양성 균주를 bla_NDM 유전자는 8개의 양성 균주를 확인하였다(Figure 3). PCR 검사 결과음성으로 확인된 bla_KPC 유전자는 35균주 중 10개의 균주에서 음성을 확인하였고, K.
Ertapenem을 이용한 MHT 결과 35균주 중 25 균주에서 양성 결과를 확인하였다. 분석결과 K. pneumoniae 11균주, A. baumannii 6균주, E. coli 2균주, P. aeruginosa 2균주, E. cloacae 2균주, P. putida 1균주, P. rettgeri 1 균주로 나타났다(Table 3).
의하여 확인하였다. 분석결과 Klebsiella pneumoniae 12균주, Escherichia coli 7균주, Acinetobacter baumannii 6 균주, Pseudomonas aeruginosa 6균주, Enterobacter cloacae 2균주, Providencia rettgerii 1균주, Pseudomonas putida 1균주를 확인하였다. 분리된 검체의 빈도는 sputum 15개 (42.
분석결과 meropenem+PBA에서 35균주 중 14균주에서 양성 결과를 확인하였고, K. pneumoniae 10균주, E. coli 4 균주로 나타났다. Meropenem+EDTA의 분석결과 35균주 중 14 균주에서 양성을 확인하였고, 균주는 A.
분석결과 통합해석에서 KPC 생성균주는 11균주, PCR 검사는 25균주가 양성으로, 표현형적 검사법에서 14균주 (44%)의 위음성을 확인하였다. 그리고 통합해석 결과에서 NDM 생성 추정 균주는 14균주, PCR 검사는 8균주가 양성으로, 표현형적 검사법에서 6균주(43%)의 위양성을 확인하였다.
37℃ 배양기에서 16∼20시간 배양한 후 각 디스크의 억제대를 측정한다. 시약을 떨어뜨리지 않은 meropenem의 억제대를 기준으로 시약을 떨어트린 억제 대의직경과의 차이가 ≤3 mm는 negative, 4 mm는 weak positive, ≥5 mme positive로 판독하였다. 그리고 CRE의 선별검사로 이용되는 MHT와 CIT의 결과를 바탕으로 통합 해석을 하였다[18].
표본이 30 사이클의 교차점 (crossing point, Cp) 이전의 임계값을 초과할 경우 양성으로, Cp가 30보다 클 경우 음성으로 간주하였다. 실시간 중합 효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용한 분석결과 bla_KPC 유전자는 25개, bla_NDM 유전자는 8개의 균주에서 증폭곡선을 확인하였다. bla_KPC 25균주에는 K.
rettgeri 1균주로 나타났다. 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 이용한 융해 곡선 분석결과 KPC 25균주, NDMe 8균주에서 증폭을 확인하였고, PCR 결과와 100% 일치함을 확인하였다. 결론적으로 real-time PCR을 이용한 신속하고 특이성이 높은 CRE의 조기진단은 공중보건 및 감염 중에 항균 관리접근법을 통한 병원 내 감염확산 방지 및 통제가 가능할 것으로 사료된다.
확인하였다(Figure 3). 양성으로 나온 균주는 염기서열 분석을 통해 유전자형을 확인하였으며, 그 결과 bla_KPC 유전자는 평균 99%, bla_NDM 유전자는 평균 99%의 상동성(homology) 을 확인하였다.
5℃, bla_NDM은 Tm 88℃를 확인하였다(Figure 4). 양성으로 확인된 검체를 이용하여 표준곡선분석을 실시였고 10⁰ 희석한 검체에서 최소검출농도(limit of detection, LOD)를확인한 결과 bla_KPC 유전자는 22 ng/mL, bla_NDM 유전자는 27.96 ng/mL으로 확인되었다.
융해 곡선의 분석에 앞서 NTC 분석결과 검체 이외에는 증폭된 산물이 없음을 확인하였고, 이후 분석에 이용한 균주는 모두 2 반복 실험으로 진행하였다. 표본이 30 사이클의 교차점 (crossing point, Cp) 이전의 임계값을 초과할 경우 양성으로, Cp가 30보다 클 경우 음성으로 간주하였다.
증폭된 bla_KPC 25균주의 분석결과, K. pneumoniae 10 균주, E. coli 5균주, A. baumannii 5균주, P. aeruginosa 4 균주, P. putida 1균주로 나타났다. 증폭된 bla_NDM 8균주의 분석 결과, K.
putida 1균주로 나타났다. 증폭된 bla_NDM 8균주의 분석 결과, K. pneumoniae 2균주, E. coli 3균주, P. aeruginosa 1균주, E. cloacae 1균주, P. rettgeri 1균주로 나타났다. 그 후 염기서열 분석을 통해 유전자형을 확인하였으며, NCBI에서 제공하는 blast 프로그램을 이용하여 염기서열의 비교분석을 하였다.
표현형적 검사결과 MHT는 35균주 중 25균주에서 양성을 확인하고, CIT는 meropenem+PBA 및 meropenem+EDTA 에서 각각 14균주의 양성을 확인하였다. PCR 검사결과 KPC 25균주에서 증폭 산물을 확인하였고, K.
EDTA와 같은 화합물은 Zn 이온을 제거함으로써 MBL이 항균제를 가수분해할 수 없게 불활성화시킨다. 표현형적 검사인 MHT와 CIT 검사결과를 바탕으로 한 통합 해석을 실시하였고[18], 분석결과 KPC 생성균주는 11균주, NDM 생성 추정균주는 14균주를 확인하였다.

후속연구

실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 이용한 융해 곡선 분석결과 KPC 25균주, NDMe 8균주에서 증폭을 확인하였고, PCR 결과와 100% 일치함을 확인하였다. 결론적으로 real-time PCR을 이용한 신속하고 특이성이 높은 CRE의 조기진단은 공중보건 및 감염 중에 항균 관리접근법을 통한 병원 내 감염확산 방지 및 통제가 가능할 것으로 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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