전통생약으로서 다양한 효능과 향신료, 조미료로서 사용되어온 초과(草果)의 항알레르기 성분연구를 위해 80% 에탄올 추출물 중 CH2Cl2, 분획으로부터 3 종의 flavonoid를 단리하였으며, 이들의 물리화학적 성상과 분광분석 데이터로부터 구조를 확인한 결과 naringenin-5-O-methyl ether (1), helichrysetin (2) 및 cardamomin (3)로 각각 동정하였다. 이들 화합물 중 화합물 2는 Amomum 속으로부터 처음 규명되었고, 화합물 3은 이 식물에서 처음 보고되는 화합물이다. 또한 화합물 2와 3은 RBL-2H3 세포로부터 β-hexosaminidase assay를 수행한 결과 탈과립 억제효과를 나타내었다. 따라서 초과의 chalcone 성분은 탈과립 억제효능을 통하여 알러지 질환에 유용할 것으로 사료된다.
전통생약으로서 다양한 효능과 향신료, 조미료로서 사용되어온 초과(草果)의 항알레르기 성분연구를 위해 80% 에탄올 추출물 중 CH2Cl2, 분획으로부터 3 종의 flavonoid를 단리하였으며, 이들의 물리화학적 성상과 분광분석 데이터로부터 구조를 확인한 결과 naringenin-5-O-methyl ether (1), helichrysetin (2) 및 cardamomin (3)로 각각 동정하였다. 이들 화합물 중 화합물 2는 Amomum 속으로부터 처음 규명되었고, 화합물 3은 이 식물에서 처음 보고되는 화합물이다. 또한 화합물 2와 3은 RBL-2H3 세포로부터 β-hexosaminidase assay를 수행한 결과 탈과립 억제효과를 나타내었다. 따라서 초과의 chalcone 성분은 탈과립 억제효능을 통하여 알러지 질환에 유용할 것으로 사료된다.
Bioactivity-guided fractionation of EtOH extract of the dried fruits of Amomum tsao-ko led to isolation of three compounds (1-3). Their structures were elucidated by spectroscopic methods (MS, 1D and 2D-NMR) and comparison with literature values, as naringenin-5-O-methyl ether (1), helichrysetin (2)...
Bioactivity-guided fractionation of EtOH extract of the dried fruits of Amomum tsao-ko led to isolation of three compounds (1-3). Their structures were elucidated by spectroscopic methods (MS, 1D and 2D-NMR) and comparison with literature values, as naringenin-5-O-methyl ether (1), helichrysetin (2), and cardamomin (3). Compound 2 was obtained from the genus Amomum for the first time. Among them, compounds 2 and 3 inhibited on the release of β-hexosaminidase from RBL-2H3 cells, with 99.1 and 21.3% at the concentration of 50 μM, respectively.
Bioactivity-guided fractionation of EtOH extract of the dried fruits of Amomum tsao-ko led to isolation of three compounds (1-3). Their structures were elucidated by spectroscopic methods (MS, 1D and 2D-NMR) and comparison with literature values, as naringenin-5-O-methyl ether (1), helichrysetin (2), and cardamomin (3). Compound 2 was obtained from the genus Amomum for the first time. Among them, compounds 2 and 3 inhibited on the release of β-hexosaminidase from RBL-2H3 cells, with 99.1 and 21.3% at the concentration of 50 μM, respectively.
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문제 정의
Allergy 질환의 예방을 위한 기존에 연구된 천연물 소재로는 충울자(Leonurus sibiricus) 추출물[20], 검정콩 껍질 유래 안토시아닌[21], 곰솔(Pinus thunbergii) 로부터 분리한 neolignane 등[22]이 보고되었다. 본 연구에서는 초과(草果)의 성분 및 효능에 대한 연구를 수행하였으며 에탄올 추출물로부터 분리 정제된 화합물의 RBL-2H3 세포로부터 탈과립 억제 활성을 확인하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
73 (3H, s)에서 한 개의 methoxy 그룹을 각각 확인하였다. 13C-NMR와 DEPT 스펙트럼에서 ρ- disubstituted benzene ring의 중복된 탄소(δC 128.6과 115.6)와 δC 56.1의 methoxy 그룹을 포함하여 총 16개의 신호를 확인하였으며, HMBC 스펙트럼으로부터 methoxy 그룹의 수소(δH 3.87)가 C-5 (δC 163.2)와 correlation 하는 것을 통해 methoxy 그룹은 C-5 위치에 결합하고 있음을 결정하였다. 또한, C-2 위치의 stereochemistry는 H-2와 H-3 proton의 커플링 상수와 비 24 25 선광도 측정치 ( ‒17.
87 (3H, s)] 을 확인하였다. 13C-NMR와 DEPT 스펙트럼에서 ρ-disubstituted benzene ring의 중복된 탄소를 포함하여 총 16개의 신호를 확인하였으며, 그 중 1개분에 해당하는 탄소를 포함하여 chalcone 골격에 methoxy 그룹 1개가 결합하고 있는 구조로 유추하였다. HMBC 스펙트럼에서 methoxy 그룹이 C-6'에 correlation (δH 3.
UV spectrum에서 흡수극대파장 (λmax)이 364nm에서 나타나 chalcone 계열에 속하는 것으로 예상되었다[26, 27]. 1H-NMR 스펙트럼에서 chalcone 골격의 C-α 와 C-β 위치에 해당하는 한 쌍의 trans olefinic 수소를 δH 7.67 (1H, d, J=15.4 Hz, H-α)와 7.63 (1H, d, J=15.4 Hz, H-β)에서 확인하였고, ρ-disubstituted benzene ring의 수소 δH 7.57 (2H, d, J=9.1 Hz, H-2, 6)과 6.85 (2H, d, J=9.1 Hz, H-3, 5)를 관찰하였다. 또한, meta-coupling을 하고 있는 aromatic doublet 수소를 δH 6.
농축된 시료에 대하여 증류수 500mL을 가하여 현탁시키고 상법에 따라 동량의 methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc) 및 n-BuOH 순으로 용매 분획한 후 농축시켜 CH2Cl2 가용성 분획 66g, EtOAc 가용성 분획 18g, 및 n-BuOH 가용성 분획 50g을 얻었다. CH2Cl2 가용물을 다시 n-hexane에 현탁 시키고 50% (32g), 70% (8g), 90% MeOH (12g), 및 n hexane (10g) 순으로 각각 분획하였다. 항알러지 효과가 있는 70% MeOH 가용물에 대하여 CHCl3-MeOH혼합용매를 이동상 (1:0→1:1, v/v, 2L)으로 하여 silica gel (70-230 Mesh, Merck, Germany)을 이용한 컬럼 크로마토그래피(ø8×30cm)를 수행하여 7개의 소분획(G47-70M-1-7)으로 나누었다.
항알러지 효과가 있는 70% MeOH 가용물에 대하여 CHCl3-MeOH혼합용매를 이동상 (1:0→1:1, v/v, 2L)으로 하여 silica gel (70-230 Mesh, Merck, Germany)을 이용한 컬럼 크로마토그래피(ø8×30cm)를 수행하여 7개의 소분획(G47-70M-1-7)으로 나누었다. G47-70M-4 소 분획물(1.1 g)에 대하여 MeOH와 증류수 혼합용매를 이동상 (20:80→100:0, v/v, 500mL)으로 하여 역상 ODS-A (12nm S- 75μm, YMC GEL)을 이용한 VLC (vacuum liquid chromatography, ø16×6cm)를 수행하여 6개의 소분획(G47-70M-4-1-6)을 얻었다. G47-70M-4-4 (150mg)에 대하여 CHCl3-MeOH 혼합용매를 이동상(20:1→6:1, v/v, 200mL)으로 하여 silica gel (230-400 Mesh, Merck, Germany)을 이용한 컬럼 크로마토그래피(ø1.
13C-NMR와 DEPT 스펙트럼에서 ρ-disubstituted benzene ring의 중복된 탄소를 포함하여 총 16개의 신호를 확인하였으며, 그 중 1개분에 해당하는 탄소를 포함하여 chalcone 골격에 methoxy 그룹 1개가 결합하고 있는 구조로 유추하였다. HMBC 스펙트럼에서 methoxy 그룹이 C-6'에 correlation (δH 3.87/δC 163.2) 하는 것을 통해 C-6'번 위치에 결합한 methoxy 그룹을 확인하였으며(Fig. 2), 이를 참고문헌과 비교하여 화합물 2를 helichrysetin (2', 4, 4'-trihydroxy-6'-methoxy chalcone) 으로규명하였다[28]. 이는 Amomum속 식물로부터 처음 분리, 보고되는 화합물이다.
측정하였다. Nuclear magnetic resonance (NMR)은 Bruker Ascend Ⅲ 700 (700MHz, cryoprobe) spectrometer (Bruker BioSpin GmbH., Rheinstetten, Germany)를 이용하여 측정하였으며, Electrospray ionization (ESI) mass는 LTQ Orbitrap XL mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific Inc., MA, Waltham, USA)를 사용하였다. TLC plate는 Merck 의 Kiesel gel 60 F254 (0.
1 Hz의 doublet으로 각각 나타났다. δH 5.33 (1H, dd, J=12.6, 2.8 Hz), 2.99 (dd, J=16.8, 12.6 Hz), 및 2.48 (dd, J=16.8, 2.8 Hz)에서 flavanone 유도체임을 알 수 있는 C-ring의 H-2, Ha-3, Hb-3 proton signal과, δH 3.73 (3H, s)에서 한 개의 methoxy 그룹을 각각 확인하였다. 13C-NMR와 DEPT 스펙트럼에서 ρ- disubstituted benzene ring의 중복된 탄소(δC 128.
화합물 3의 1H 및 13C-NMR 스펙트럼은 화합물 2와 유사하였다. 그러나 화합물 2와 달리 mono-substituted benzene ring에 기인하는 수소 δH 7.72 (2H, dd, J=7.7, 1.4 Hz, H-2, 6)와 7.45 (3H, overlapped, H-3, 4, 5)의 관찰과 ESI-MS에서도 amu 16의 차이로 화합물 2의 B 환에서 hydroxy 그룹이 결여된 화합물로 추정하였다. HMBC 스펙트럼에서 methoxy 그룹의 signal이 C-6'에 correlation (δH 3.
이 중 CH2Cl2, 분획물에 대하여 n-hexane과 50, 70, 90% MeOH로 분획 하였고, 70% MeOH 가용 분획물에 대하여 실리카겔, ODS, Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 3종의 화합물을 분리, 정제하였다. 분리한 화합물은 1D-, 2D-NMR 및 MS 등의 기기분석 및 문헌과의 비교를 통하여 그 구조를 규명하였다(Fig. 1).
비선광도는 JASCO P-2000 polarimeter (Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. Nuclear magnetic resonance (NMR)은 Bruker Ascend Ⅲ 700 (700MHz, cryoprobe) spectrometer (Bruker BioSpin GmbH.
2mg)을 분리하였다. 소분획 G47-70M-4-3 (600mg)에 대하여 CHCl3-MeOH (1:1, v/v, 2L) 혼합용매를 이동상으로 하여 SephadexTM LH-20을 이용한 컬럼크로마토그래피(ø4×150cm)를 수행하여 화합물 2 (5.7mg)와 3 (7.3 mg)을 각각 분리 정제하였다.
이 중 CH2Cl2, 분획물에 대하여 n-hexane과 50, 70, 90% MeOH로 분획 하였고, 70% MeOH 가용 분획물에 대하여 실리카겔, ODS, Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 3종의 화합물을 분리, 정제하였다. 분리한 화합물은 1D-, 2D-NMR 및 MS 등의 기기분석 및 문헌과의 비교를 통하여 그 구조를 규명하였다(Fig.
1% BSA를 포함시킨 PIPES buffer 를 180μL 넣고 10분 동안 배양하였다. 전 배양 후 실시예의 시료를 25, 50, 100µg/mL의 농도로 20분간 처리 후 50ng/mL DNP-BSA 20분간 반응시켰다. Ice에서 10분 방치하여 반응을 종결시킨 후 상등액을 30μL씩 96 웰 플레이트에 넣고, 1mM P-니트로페닐-아세틸-β-D-글루코사미니드를 30μL 넣은 후 37 oC에서 1시간 반응시켰다.
초과(草果)로부터 얻은 80% 에탄올 추출물에 대하여 통상적인 방법으로 분획하여 CH2Cl2, EtOAc 및 n-BuOH 분획물을 제조하였다. 이 중 CH2Cl2, 분획물에 대하여 n-hexane과 50, 70, 90% MeOH로 분획 하였고, 70% MeOH 가용 분획물에 대하여 실리카겔, ODS, Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 3종의 화합물을 분리, 정제하였다.
CH2Cl2 가용물을 다시 n-hexane에 현탁 시키고 50% (32g), 70% (8g), 90% MeOH (12g), 및 n hexane (10g) 순으로 각각 분획하였다. 항알러지 효과가 있는 70% MeOH 가용물에 대하여 CHCl3-MeOH혼합용매를 이동상 (1:0→1:1, v/v, 2L)으로 하여 silica gel (70-230 Mesh, Merck, Germany)을 이용한 컬럼 크로마토그래피(ø8×30cm)를 수행하여 7개의 소분획(G47-70M-1-7)으로 나누었다. G47-70M-4 소 분획물(1.
대상 데이터
추출, 분획 및 컬럼 크로마토그래피에 사용한 모든 용매는 1급 시약을 사용하였다. 물은 초순수제조장치(CascadaTM RO water, Pall Corporation, NY, Port Washington, USA)를 이용하여 3차 증류수를 사용하였다.
컬럼 충진제는 실리카겔 60 (70-230 Mesh, Merck KGaA), 실리카겔 60 (230-400 Mesh, Merck KGaA), ODS-A (12nm S-75μm, YMC GEL), SephadexTM LH-20 (GE Healthcare, IL, Chicago, USA)를 사용하였다. 발색시약으로는 10% vanillin/H2SO4 (in EtOH) 시약을 사용하였으며, UV의 검색은 254와 365nm에서 확인하였다. 추출, 분획 및 컬럼 크로마토그래피에 사용한 모든 용매는 1급 시약을 사용하였다.
실험에 사용한 초과(草果)는 2012년 2월 서울 경동시장에서 구입하여 교신저자인 오좌섭 교수로부터 형태학적 평가를 통하여 동정 받은 후 사용하였으며, 표본(G47)은 (재) 경기도경제과학진흥원 천연물연구팀 표본실에 보관하고 있다.
45 (3H, overlapped, H-3, 4, 5)의 관찰과 ESI-MS에서도 amu 16의 차이로 화합물 2의 B 환에서 hydroxy 그룹이 결여된 화합물로 추정하였다. HMBC 스펙트럼에서 methoxy 그룹의 signal이 C-6'에 correlation (δH 3.88/δC 163.2)하는 것을 확인하였고(Fig. 2), 참고문헌[29]과 비교하여 화합물 3은 cardamomin (2', 4'-dihydroxy-6'-methoxy chalcone)으로 동정하였으며 이 식물에서 처음 분리, 보고되는 화합물이다. 초과 추출물에서 분리된 화합물 3종을 이용하여 항알러지 효능을 확인하기 위해 RBL-2H3 세포로부터 β- hexosaminidase assay를 수행한 결과 naringenin-5-O-methyl ether (1)은 탈과립화 억제 효과가 없었고 helichrysetin (2)와 cardamomin (3) 처리군에서는 β-hexosaminidase 억제 효과가 있는 것으로 나타났다(Fig.
2)와 correlation 하는 것을 통해 methoxy 그룹은 C-5 위치에 결합하고 있음을 결정하였다. 또한, C-2 위치의 stereochemistry는 H-2와 H-3 proton의 커플링 상수와 비 24 25 선광도 측정치 ( ‒17.2)를 문헌( ‒14.0)과 비교하여 [ α[ α]D ]D S-form임을 알 수 있었으며, 이상의 결과를 문헌과의 비교로 화합물 1은 naringenin-5-O-methyl ether로 구조를 규명하였다[25]. 화합물 2는 황색 무정형 분말로 분리, 정제되었으며, negative 이온 모드의 ESI-MS에서 285 [M-H]–의 이온 피크를 관찰하여분자량은 286으로 확인하였다.
2), 참고문헌[29]과 비교하여 화합물 3은 cardamomin (2', 4'-dihydroxy-6'-methoxy chalcone)으로 동정하였으며 이 식물에서 처음 분리, 보고되는 화합물이다. 초과 추출물에서 분리된 화합물 3종을 이용하여 항알러지 효능을 확인하기 위해 RBL-2H3 세포로부터 β- hexosaminidase assay를 수행한 결과 naringenin-5-O-methyl ether (1)은 탈과립화 억제 효과가 없었고 helichrysetin (2)와 cardamomin (3) 처리군에서는 β-hexosaminidase 억제 효과가 있는 것으로 나타났다(Fig. 3). Table S1에서 보는 바와 같이 helichrysetin (2)는 100mM에서 99.
후속연구
비만세포는 대부분의 allergy 질환에 중요한 역할을 하는 세포로 알려져 있으며, 항원과 항체의 결합을 통하여 활성화되며 세포의 과립 내에 저장되어 있던 히스타민, 염증촉진 사이토카인과 케모카인, 류코트리엔, 그리고 프로스타글란딘과 같은 allergy 유발물질을 분비한다[18]. 따라서, allergy 유발물질의 탈과립 억제를 통한 비만세포 활성화 조절은 allergy 반응의 약물 개발에 중요한 자료로 활용될 수 있을 것이다[19]. Allergy 질환의 예방을 위한 기존에 연구된 천연물 소재로는 충울자(Leonurus sibiricus) 추출물[20], 검정콩 껍질 유래 안토시아닌[21], 곰솔(Pinus thunbergii) 로부터 분리한 neolignane 등[22]이 보고되었다.
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