가뭄 스트레스 특이적인 cis-regulatory element의 특성을 기반으로 한 신규 프로모터 구축 Construction of novel promoters based on the characteristics of drought stress specific cis-regulatory element원문보기
김기환
(Department of Applied Biosciences, Kyungpook National University)
,
김병규
(Department of Integrative Biology, Kyungpook National University)
,
신주형
(Department of Integrative Biology, Kyungpook National University)
,
김원찬
(Department of Applied Biosciences, Kyungpook National University)
가뭄은 작물의 성장과 생산성을 방해하는 비 생물학적 스트레스 중 하나다. 비 생물학적 스트레스에 대응하기 위해서는 식물이 불리한 환경 조건에서 스트레스에 나타내는 분자 조절 네트워크를 이해해야 한다. 비 생물학적 스트레스 (가뭄에 대응)에 대처할 수 있는 조합을 선별하기 위한 실험에서 스트레스 조건에서만 발현되는 5개의 가뭄 스트레스 유도성 프로모터를 선별하였으며, 이 중 36개의 cis-regulatory element를 선별하였다. 그 결과 가뭄 스트레스에서만 발현되는 유전자의 프로모터에서 cis-regulatory element를 새롭게 조합하여 미세 제어 조절을 할 수 있는 2 개의 합성프로모터(BL1, BL2)를 제작하였다. 합성프로모터를 포함한 형질전환식물(BL1-GUS, BL2-GUS)의 분석은 합성프로모터가 건조 조건에서 형질전환식물 내의 GUS 유전자의 발현을 증가시키는 것을 통하여 확인하였다. 또한 Transient activation assay를 통해 DREB1A와 DREB2C에 의해 합성프로모터가 활성화되는 것도 확인하였다. 이러한 결과는 가뭄 특이적인 cis-regulatory element의 조합에 의해 제작한 합성프로모터가 다양한 비 생물학적 스트레스에 반응하고, 식물의 성장 지연을 유발하지 않고 스트레스에 효과적으로 대응할 수 있을 것이라 예상할 수 있다.
가뭄은 작물의 성장과 생산성을 방해하는 비 생물학적 스트레스 중 하나다. 비 생물학적 스트레스에 대응하기 위해서는 식물이 불리한 환경 조건에서 스트레스에 나타내는 분자 조절 네트워크를 이해해야 한다. 비 생물학적 스트레스 (가뭄에 대응)에 대처할 수 있는 조합을 선별하기 위한 실험에서 스트레스 조건에서만 발현되는 5개의 가뭄 스트레스 유도성 프로모터를 선별하였으며, 이 중 36개의 cis-regulatory element를 선별하였다. 그 결과 가뭄 스트레스에서만 발현되는 유전자의 프로모터에서 cis-regulatory element를 새롭게 조합하여 미세 제어 조절을 할 수 있는 2 개의 합성프로모터(BL1, BL2)를 제작하였다. 합성프로모터를 포함한 형질전환식물(BL1-GUS, BL2-GUS)의 분석은 합성프로모터가 건조 조건에서 형질전환식물 내의 GUS 유전자의 발현을 증가시키는 것을 통하여 확인하였다. 또한 Transient activation assay를 통해 DREB1A와 DREB2C에 의해 합성프로모터가 활성화되는 것도 확인하였다. 이러한 결과는 가뭄 특이적인 cis-regulatory element의 조합에 의해 제작한 합성프로모터가 다양한 비 생물학적 스트레스에 반응하고, 식물의 성장 지연을 유발하지 않고 스트레스에 효과적으로 대응할 수 있을 것이라 예상할 수 있다.
Droughts are one of the abiotic stresses that hinders the growth and productivity of crop plants. Coping with abiotic stress is necessary to understand the molecular regulatory networks that makes plants respond to adverse environmental conditions. In our experiment to find a combination that can co...
Droughts are one of the abiotic stresses that hinders the growth and productivity of crop plants. Coping with abiotic stress is necessary to understand the molecular regulatory networks that makes plants respond to adverse environmental conditions. In our experiment to find a combination that can cope with abiotic stress (respond to drought), we screened 5 stress-inducible promoters that are expressed only under stress conditions. This founded 36 cis-elements in stress-inducible promoters. With the result we designed 2 synthetic promoters (BL1, BL2) for fine-controlled regulation by assembling cis-elements from the native promoters, which are expressed only under stress caused by droughts. Analysis of the transgenic plant (BL1-GUS, BL2-GUS) showed that the synthetic promoters increased the expression of β-glucuronidase (GUS) in transgenic plants under desiccation. Also in the transient activation assay demonstrated that synthetic promoters induced the co-transformation of effector DREB1A and DREB2C. These results expect that the synthetic promoter with a combination of drought-specific elements can be used to respond to various abiotic stress and is resistant to stress without causing growth retardation.
Droughts are one of the abiotic stresses that hinders the growth and productivity of crop plants. Coping with abiotic stress is necessary to understand the molecular regulatory networks that makes plants respond to adverse environmental conditions. In our experiment to find a combination that can cope with abiotic stress (respond to drought), we screened 5 stress-inducible promoters that are expressed only under stress conditions. This founded 36 cis-elements in stress-inducible promoters. With the result we designed 2 synthetic promoters (BL1, BL2) for fine-controlled regulation by assembling cis-elements from the native promoters, which are expressed only under stress caused by droughts. Analysis of the transgenic plant (BL1-GUS, BL2-GUS) showed that the synthetic promoters increased the expression of β-glucuronidase (GUS) in transgenic plants under desiccation. Also in the transient activation assay demonstrated that synthetic promoters induced the co-transformation of effector DREB1A and DREB2C. These results expect that the synthetic promoter with a combination of drought-specific elements can be used to respond to various abiotic stress and is resistant to stress without causing growth retardation.
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제안 방법
2개의 합성프로모터(BL1, BL2)가 가뭄 스트레스뿐만 아니라 다른 비 생물학적 스트레스에도 반응하는지 확인하기 위하여 비생물학적 스트레스 중 추위에 의해 발현이 유도되는 전사조절인자인 DREB1A [40]와 고온에 의해 발현이 유도되는 전사조절인자인 DREB2C [41]에 대한 반응성을 조사하였다. 비 생물학적 스트레스인 추위 및 고온에 의해 유도되는 대표적인 전사조절인자인 DREB1A와 DREB2C에 대한 합성프로모터의 반응성 확인은 애기장대 잎으로부터 추출한 원형질체를 이용한 transient activity assay를 통해 수행되었다.
6B). DREB2C 전사조절인자는 RD29A 프로모터와 합성프로모터인 BL1 프로모터, BL2 프로모터에 각각 약 17배, 3배, 13배 정도의 GUS 유전자의 발현을 활성화하였다(Fig. 6C). 이 결과는 본 연구에서 제작한 합성프로모터가 가뭄 스트레스뿐만 아니라 저온 및 고온에 해당하는 비 생물학적 스트레스에도 발현을 유도할 수 있으므로, 다양한 비 생물학적 스트레스 환경에 효과적으로 대응 가능할 수 있을 것으로 사료된다.
제작하여 실험하였다. Effector 벡터의 구축을 위하여는 DREB1A (At4g25480) 및 DREB2C (At2g40340)의 cDNA 를 CaMV 35S 프로모터 하류에 삽입시켰고, reporter 벡터는 합성 프로모터를 GUS 리포터 유전자 상류에 삽입하여 제작하였다. 이렇게 제작된 effector 및 reporter 벡터는 원형질체 내부로도 입 시켜 실험하였다[33].
엽록소가 제거된 애기장대는 Leica사(Wetzlar, DEU)의 EZ4E 모델 현미경을 사용하여 관찰하였다. GUS 단백질의 활성을 측정은 4-Methylumbelliferyl β- D-galactopyranoside의 분해 산물인 4-methylumbelliferone을 Specta Max Gemini XS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다[29]. 단백질의 농도는 Bradford reagent (Bio-Rad, CA, Hercules, USA)를 통해 정량 분석하였다[30].
진행하였다. PP2C, LEA4-5, ATGOLS2, ERF53, RD29A는 specific-inducible promoter, P5CS1, LTI30, ATHB-7는 continuous inducible promoter, 가뭄 스트레스에 반응하지 않은 유전자는 non-inducible promoter로 분류하였다. 각 그룹에 해당하는 유전자들의 프로모터 영역의 cis-regulatory element를 분석한 결과, specific-inducible promoter는 42개, Continuous-inducible promoter 는 71개의 공통적인 TF-matrix-ID가 있음을 확인하였다(Fig.
추출된 total RNA는 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역전시켰다. RT-PCRe 생성된 cDNA를 주형으로 사용하여 수행되었으며, 증폭된 DNA 단편을 1% Agarose (Invitrogen)에서 분리하고 ethidium bromide (BioBasic, Toronto, CAN)로 염색하여 확인하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머는 Table 1에 별도로 표기하였다.
RT-PCR을 이용한 가뭄 스트레스에 대한 유전자의 mRNA의 발현량 변화를 바탕으로 가뭄 스트레스에 특이적인 cis-regulatory element 선별을 위해 각 유전자를 3개의 그룹으로 나누어 분석을 진행하였다. PP2C, LEA4-5, ATGOLS2, ERF53, RD29A는 specific-inducible promoter, P5CS1, LTI30, ATHB-7는 continuous inducible promoter, 가뭄 스트레스에 반응하지 않은 유전자는 non-inducible promoter로 분류하였다.
TAIR (https://www.arabidopsis.org)를 활용하여 CDS (coding sequence) 의 상위 2kb 프로모터 영역을 획득하였으며, PlantPAN 3.0 (https://www.plantpan.itps.ncku.edu.tw)를 사용하여 프로모터 영역에 존재하는 cis-regulatory element를 확인하였다[24, 25].
Total RNA의 추출은 TRIzol reagent (Invitrogen, CA, Carlsbad, USA)를 사용하여 가뭄 스트레스 처리된 애기장대 및 대조군의 잎과 뿌리을 추출하였다. 추출된 total RNA는 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역전시켰다.
cis-regulatory element가 조합된 합성프로모터는 Integrated DNA Technology를 통해 합성을 진행하였다. 제작된 합성 프로모터들은 SpeI과 BamHI의 제한효소를 통해 pCB308 벡터[26] 에 삽입하여 재조합 벡터를 제작하였다.
5×Murashige and Skoog 한천 배지에서 3일간 생육하여 사용하였다[23]. 가뭄 스트레스 해소는 가뭄 스트레스 처리된 애기장대를 새로운 0.5×Murashige and Skoog 한천 배지에 옮겨 심어 3일간 생육시켜 사용하였다.
가뭄 스트레스에 특이적으로 발현이 유도되는 유전자를 선별하기 위한 가뭄 스트레스 처리 실험에서는 8일간 생육시킨 애기장대를 시간대별로 자연 건조하여 사용하였다[10]. 합성 프로모터의 성능을 검증하기 위한 가뭄 스트레스 처리 실험은 Polyethylene glycol (Sigma Aldrich, St.
GUS 단백질의 활성을 측정은 4-Methylumbelliferyl β- D-galactopyranoside의 분해 산물인 4-methylumbelliferone을 Specta Max Gemini XS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다[29]. 단백질의 농도는 Bradford reagent (Bio-Rad, CA, Hercules, USA)를 통해 정량 분석하였다[30]. GUS 단백질의 활성은 밀리그램 단백질 당 분당 피코 몰 4- methylumbelliferone으로 표현되었다.
특히, ERF53 유전자[16, 35, 36]와 RD29A 유전자[10, 37, 38]는 가뭄, 염해 등과 같은 비 생물학적 스트레스에 의해 발현이 유도되는 결과와 일치한다. 따라서, ERF53 유전자의 상위 2kb 영역의 프로모터와 RD29A 유전자의 상위 1kb 영역의 프로모터에서 각 TF-matrix-ID에 해당하는 cisregulatory element의 서열만 남기고 해당하지 않는 DNA 서열은 제거하여 각각 BL1 및 BL2의 합성프로모터를 설계하였다 (Fig. 3).
3가지 그룹에 공통적인 31개의 TF-matrix- ID는 프로모터로 작용하기에 최소한의 요소라 생각된다. 상기의결 과를 바탕으로 합성프로모터의 제작을 위해 36개의 TF-matrix- ID를 선정하였다(Table 3). 합성프로모터의 제작은 가뭄 스트레스에 의해 발현이 강하게 유도되고, 가뭄 스트레스 해소에 의해 발현이 빠르게 감소하는 ERF53과 RD29A의 프로모터를 이용하였다(Fig.
선정하였다(Table 2). 선정된 가뭄 스트레스 내성 유전자들은 시간대별로 자연 건조를 통해 가뭄 스트레스 처리된 애기장대 및 가뭄 스트레스 해소된 애기장대 내의 mRNA의 양을 RT-PCR을 통해 측정하였다(Fig. 1). 그 결과, 애기장대의 잎과 뿌리에서 가뭄 스트레스가 증가할수록 모든 가뭄 스트레스 내성 유전자의 mRNA의 양이 증가함을 확인할 수 있었다.
애기장대 내에서 가뭄 스트레스에 특이적으로 반응하는 유전자를 선별하기 위해 기존의 논문들을 통해 가뭄 스트레스 내성 유전자들을 선정하였다(Table 2). 선정된 가뭄 스트레스 내성 유전자들은 시간대별로 자연 건조를 통해 가뭄 스트레스 처리된 애기장대 및 가뭄 스트레스 해소된 애기장대 내의 mRNA의 양을 RT-PCR을 통해 측정하였다(Fig.
애기장대의 종자는 70% ethanol을 이용하여 5분간 소독 후 종자 소독제(25% 표백제 및 0.01% Triton X-100)를 이용하여 10분간 표면을 살균하여 사용하였다. 표면 멸균된 종자는 증류수로 헹군 뒤 0.
Technology를 통해 합성을 진행하였다. 제작된 합성 프로모터들은 SpeI과 BamHI의 제한효소를 통해 pCB308 벡터[26] 에 삽입하여 재조합 벡터를 제작하였다. 재조합 벡터들은 아그로박테리움(GV3101)을 이용한 floral dip method [27]를 통해 실시하였다.
01% Triton X-100)를 이용하여 10분간 표면을 살균하여 사용하였다. 표면 멸균된 종자는 증류수로 헹군 뒤 0.5×Murashige and Skoog 한천 배지 (0.002% MS, 6mM MES, 1% Sucrose, 0.6% Agar, pH5.7) 에 파종하여 춘화 처리 후 생육시키며 사용하였다. 생육 조건은 생장 상에서 장일조건(16시간 명 처리/8시간 암 처리, 23oC)으로 생육시켰다.
그러나, 음성 대조군으로 사용된 pCB308 (공 벡터) 형질전환 식물은 가뭄 스트레스에 상관없이 염색이 되지 않았다. 합성프로모터의 반응성을 정량적으로 분석하기 위해 GUS 단백질의 활성을 측정하였다(Fig. 5). 잎에서의 GUS 단백질의 활성을 측정한 결과 RD29A 프로모터, BL1 프로모터 및 BL2 프로모터가 형질전환된 식물은 가뭄 스트레스에 의해 GUS 단백질의 활성이 각각 약 49배, 17배, 10배가 증가하였다(Fig.
합성프로모터의 성능을 확인하기 위하여 애기장대의 잎으로부터 원형질체를 추출하고[31] effector와 reporter 벡터는 pTrGUS 벡터[32]를 제작하여 실험하였다. Effector 벡터의 구축을 위하여는 DREB1A (At4g25480) 및 DREB2C (At2g40340)의 cDNA 를 CaMV 35S 프로모터 하류에 삽입시켰고, reporter 벡터는 합성 프로모터를 GUS 리포터 유전자 상류에 삽입하여 제작하였다.
대상 데이터
6A). Effector로는 DREB1A 또는 DREB2C 전사조절인자를 사용하였고, reporter로는 합성프로모터인 BL1과 BL2 프로모터를 GUS 유전자 앞에 삽입한 것을 사용하였고, internal control로는 NAN 단백질을 사용하였다. 그 결과 effector 벡터를 넣어 주지 않고 reporter 벡터만 넣어준 대조 구보다 DREB1A 전사조절인자는 positive control로 사용한 RD29A 프로모터와 합성프로모터인 BL1 프로모터, BL2 프로모터에 각각 약 26배, 3배, 23배 정도의 GUS 유전자의 발현을 활성화하였다(Fig.
4). 본 실험에서는 음성 대조군으로 pCB308 (공 벡터)가 형질전환된 식물을 사용하였으며, 양성 대조군으로는 기존에 스트레스에 의해 유도된다고 잘 알려진 RD29A 프로모터와 GUS 유전자가 연결된 벡터가 형질 전환된 식물을 대표적으로 사용하였다[10, 37, 38]. RD29A 프로모터와 GUS 유전자가 연결된 벡터가 형질전환된 식물, BL1 프로모터 및 BL2 프로모터와 GUS 유전자가 연결된 벡터가 형질 전환된 식물은 가뭄 스트레스에 반응하여 GUS 염색이 증가하였다.
애기장대(Arabidopsis thaliana)는 야생형(Col-0)을 실험에 사용하였다. 애기장대의 종자는 70% ethanol을 이용하여 5분간 소독 후 종자 소독제(25% 표백제 및 0.
합성 프로모터의 성능을 검증하기 위한 가뭄 스트레스 처리 실험은 Polyethylene glycol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 가첨가된 −0.77MPa 0.5×Murashige and Skoog 한천 배지에서 3일간 생육하여 사용하였다[23]. 가뭄 스트레스 해소는 가뭄 스트레스 처리된 애기장대를 새로운 0.
상기의결 과를 바탕으로 합성프로모터의 제작을 위해 36개의 TF-matrix- ID를 선정하였다(Table 3). 합성프로모터의 제작은 가뭄 스트레스에 의해 발현이 강하게 유도되고, 가뭄 스트레스 해소에 의해 발현이 빠르게 감소하는 ERF53과 RD29A의 프로모터를 이용하였다(Fig. 1). 특히, ERF53 유전자[16, 35, 36]와 RD29A 유전자[10, 37, 38]는 가뭄, 염해 등과 같은 비 생물학적 스트레스에 의해 발현이 유도되는 결과와 일치한다.
데이터처리
모든 실험 결과는 3회 반복으로 시행하여 평균 ± 표준편차 (standard deviation, SD)를 사용해 표기하였다. 통계 분석은 Student’s t-test를 사용하여 p 값이 0.
deviation, SD)를 사용해 표기하였다. 통계 분석은 Student’s t-test를 사용하여 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
이론/모형
DREB2C [41]에 대한 반응성을 조사하였다. 비 생물학적 스트레스인 추위 및 고온에 의해 유도되는 대표적인 전사조절인자인 DREB1A와 DREB2C에 대한 합성프로모터의 반응성 확인은 애기장대 잎으로부터 추출한 원형질체를 이용한 transient activity assay를 통해 수행되었다. 추출된 원형질체 내부로 effector 벡터, reporter 벡터 및 internal control 벡터를 PEG를 이용하여 동시에 형질전환 시켰다(Fig.
Louis, MO, USA)를 함유하는 GUS 반응 혼합물에 24시간 침지 후, 70% ethanol을 사용하여 엽록소를 제거하여 확인하였다[28]. 엽록소가 제거된 애기장대는 Leica사(Wetzlar, DEU)의 EZ4E 모델 현미경을 사용하여 관찰하였다. GUS 단백질의 활성을 측정은 4-Methylumbelliferyl β- D-galactopyranoside의 분해 산물인 4-methylumbelliferone을 Specta Max Gemini XS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다[29].
제작된 합성 프로모터들은 SpeI과 BamHI의 제한효소를 통해 pCB308 벡터[26] 에 삽입하여 재조합 벡터를 제작하였다. 재조합 벡터들은 아그로박테리움(GV3101)을 이용한 floral dip method [27]를 통해 실시하였다.
성능/효과
본 실험에서는 음성 대조군으로 pCB308 (공 벡터)가 형질전환된 식물을 사용하였으며, 양성 대조군으로는 기존에 스트레스에 의해 유도된다고 잘 알려진 RD29A 프로모터와 GUS 유전자가 연결된 벡터가 형질 전환된 식물을 대표적으로 사용하였다[10, 37, 38]. RD29A 프로모터와 GUS 유전자가 연결된 벡터가 형질전환된 식물, BL1 프로모터 및 BL2 프로모터와 GUS 유전자가 연결된 벡터가 형질 전환된 식물은 가뭄 스트레스에 반응하여 GUS 염색이 증가하였다. 특히, 정상적인 생육조건 및 스트레스 해소 조건에서 2개의 합성프로모터(BL1, BL2)는 RD29A 프로모터보다 GUS 염색이 적었다.
PP2C, LEA4-5, ATGOLS2, ERF53, RD29A는 specific-inducible promoter, P5CS1, LTI30, ATHB-7는 continuous inducible promoter, 가뭄 스트레스에 반응하지 않은 유전자는 non-inducible promoter로 분류하였다. 각 그룹에 해당하는 유전자들의 프로모터 영역의 cis-regulatory element를 분석한 결과, specific-inducible promoter는 42개, Continuous-inducible promoter 는 71개의 공통적인 TF-matrix-ID가 있음을 확인하였다(Fig. 2A, B). 또한, 각 그룹에서 공통적인 TF-matrix-ID와 non-inducible promoter를 분석한 결과에서는 31개의 공통적인 TF-matrix-ID 가 존재하며, specific-inducible promoter만 가지는 3개의 TF- matrix-ID, specific-inducible promoter와 continuous-inducible promoter의 공통적인 2개의 TF-matrix-ID가 있음을 확인하였다 (Fig.
Effector로는 DREB1A 또는 DREB2C 전사조절인자를 사용하였고, reporter로는 합성프로모터인 BL1과 BL2 프로모터를 GUS 유전자 앞에 삽입한 것을 사용하였고, internal control로는 NAN 단백질을 사용하였다. 그 결과 effector 벡터를 넣어 주지 않고 reporter 벡터만 넣어준 대조 구보다 DREB1A 전사조절인자는 positive control로 사용한 RD29A 프로모터와 합성프로모터인 BL1 프로모터, BL2 프로모터에 각각 약 26배, 3배, 23배 정도의 GUS 유전자의 발현을 활성화하였다(Fig. 6B). DREB2C 전사조절인자는 RD29A 프로모터와 합성프로모터인 BL1 프로모터, BL2 프로모터에 각각 약 17배, 3배, 13배 정도의 GUS 유전자의 발현을 활성화하였다(Fig.
1). 그 결과, 애기장대의 잎과 뿌리에서 가뭄 스트레스가 증가할수록 모든 가뭄 스트레스 내성 유전자의 mRNA의 양이 증가함을 확인할 수 있었다. 하지만 자연 건조 후 2시간과 4시간 뒤의 애기장대를 새로운 배지로 옮겨 가뭄 스트레스를 해소한 애기장대 잎의 P5CS1 (At2g39800), LTI30 (At3g50970), ATHB-7 (At2g46680) 유전자의 경우에는 mRNA의 양이 감소하지 않았으며, PP2C LEA4-5 (At1g07430), (At5g06760), ATGOLS2 (At1g56600), (At2g20880), RD29A (At5g42310) 유전자의 경우에는 EFR53 mRNA의 양이 감소하였다(Fig.
2A, B). 또한, 각 그룹에서 공통적인 TF-matrix-ID와 non-inducible promoter를 분석한 결과에서는 31개의 공통적인 TF-matrix-ID 가 존재하며, specific-inducible promoter만 가지는 3개의 TF- matrix-ID, specific-inducible promoter와 continuous-inducible promoter의 공통적인 2개의 TF-matrix-ID가 있음을 확인하였다 (Fig. 2C). 이 결과는 specific-inducible promoter이 가지는 3개의 TF-matrix-ID는 가뭄 스트레스에 특이적인 요소로 판단되며, specific-inducible promoter와 continuous-inducible promoter의 공통적인 2개의 TF-matrix-ID는 가뭄 스트레스에 반응하기 위한 요소로 판단된다.
본 연구에서는 가뭄 스트레스에 특이적인 cis-regulatory element의 새로운 조합을 통한 합성프로모터를 구축하고 다양한 비 생물학적 스트레스에 반응하여 유전자 발현을 조절할 수 있음을 확인하였다. 이는 정상적인 생육조건에서는 유전자 발현이 되지 않고, 비 생물학적 스트레스 조건에서만 특이적으로 유전자 발현이 유도되어 효율적인 스트레스 내성 작물 개발에 도움이 될 것으로 생각된다.
1B). 이 결과는 PP2C, LEA4-5, ATGOLS2, ERF53, RD29A 유전자의 경우 가뭄 스트레스에 의해 발현이 유도되며, 가뭄 스트레스가 해소된 조건에서는 발현이 억제되는 것으로 보아 각 유전자의 프로모터는 가뭄 스트레스에 특이적으로 발현이 조절되는 cis-regulatory element를 가질 것으로 생각된다.
2C). 이 결과는 specific-inducible promoter이 가지는 3개의 TF-matrix-ID는 가뭄 스트레스에 특이적인 요소로 판단되며, specific-inducible promoter와 continuous-inducible promoter의 공통적인 2개의 TF-matrix-ID는 가뭄 스트레스에 반응하기 위한 요소로 판단된다. 3가지 그룹에 공통적인 31개의 TF-matrix- ID는 프로모터로 작용하기에 최소한의 요소라 생각된다.
5A). 이와 유사하게 뿌리에서도 GUS 단백질의 활성이 각각 약 5배, 15배, 6배가 증가함을 확인하였다(Fig. 5B). 그러나, pCB308이형질전환된 식물은 가뭄 스트레스와 상관없이 잎과 뿌리 모두에서 GUS 단백질의 활성 차이가 없었다.
5). 잎에서의 GUS 단백질의 활성을 측정한 결과 RD29A 프로모터, BL1 프로모터 및 BL2 프로모터가 형질전환된 식물은 가뭄 스트레스에 의해 GUS 단백질의 활성이 각각 약 49배, 17배, 10배가 증가하였다(Fig. 5A). 이와 유사하게 뿌리에서도 GUS 단백질의 활성이 각각 약 5배, 15배, 6배가 증가함을 확인하였다(Fig.
후속연구
6C). 이 결과는 본 연구에서 제작한 합성프로모터가 가뭄 스트레스뿐만 아니라 저온 및 고온에 해당하는 비 생물학적 스트레스에도 발현을 유도할 수 있으므로, 다양한 비 생물학적 스트레스 환경에 효과적으로 대응 가능할 수 있을 것으로 사료된다. 종합적으로 상기의 결과들로부터 가뭄 스트레스에 특이적인 cis-regulatory element의 조합을 통한 합성프로모터는 가뭄 스트레스에 효율적으로 발현이 유도되는 것으로 판단되며, 추가적인 연구를 진행한다면 기존에 알려진 가뭄 스트레스 관련 cis-regulatory element 외에 새로운 cis-regulatory element의 조합을 선별하기 위한 기초 자료로 사용될 수 있을 것이라 생각된다.
확인하였다. 이는 정상적인 생육조건에서는 유전자 발현이 되지 않고, 비 생물학적 스트레스 조건에서만 특이적으로 유전자 발현이 유도되어 효율적인 스트레스 내성 작물 개발에 도움이 될 것으로 생각된다.
이 결과는 본 연구에서 제작한 합성프로모터가 가뭄 스트레스뿐만 아니라 저온 및 고온에 해당하는 비 생물학적 스트레스에도 발현을 유도할 수 있으므로, 다양한 비 생물학적 스트레스 환경에 효과적으로 대응 가능할 수 있을 것으로 사료된다. 종합적으로 상기의 결과들로부터 가뭄 스트레스에 특이적인 cis-regulatory element의 조합을 통한 합성프로모터는 가뭄 스트레스에 효율적으로 발현이 유도되는 것으로 판단되며, 추가적인 연구를 진행한다면 기존에 알려진 가뭄 스트레스 관련 cis-regulatory element 외에 새로운 cis-regulatory element의 조합을 선별하기 위한 기초 자료로 사용될 수 있을 것이라 생각된다.
참고문헌 (41)
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