[논문]주요 병원균 자극에 의한 닭의 Interleukin-34 발현 분석 비교

홍영호

doi:10.5536/kjps.2021.48.3.111

주요 병원균 자극에 의한 닭의 Interleukin-34 발현 분석 비교
Expression Analysis of Chicken Interleukin-34(IL-34) for Various Pathogenic Stimulations 원문보기

한국가금학회지 = Korean journal of poultry science, v.48 no.3, 2021년, pp.111 - 122

초록
AI-Helper

최근에 IL-34가 MCSFR에 대한 두 번째 기능적 리간드로 확인되었으며, M-CSFR에 대한 결합을 통해 IL-34는 M-CSF와 유사한 기능을 공유한다. 지금까지 닭의 IL-34에 대한 실험적 연구가 아닌 예측된 서열로만 보고되었으며, 닭의 IL-34 기능에 대한 정보는 아직 부족하다. 닭 IL-34의 잠재적 생물학적 기능을 구명하기 위하여, 다양한 품종의 닭, 세포주에 대한 괴사성 장염, 살모넬라 및 E. coli 유래의 LPS 등을 처리하여 관찰하였다. 또한 닭의 IL-34와 M-CSF 재조합 단백질 생산 및 이를 이용한 전염증성 사이토카인 유도를 위하여 클로닝 및 재조합 단백질을 발현 및 정제하였다. 특히 관절이상 육계(unknown cause)에 대한 IL-34, M-CSF, 그리고 M-CSFR 유전자의 발현이 대조구보다 유의하게 증가하였으나, 병원균 자극 조직의 경우 많은 조직에서 감소함을 보였다. M-CSFR의 발현은 in vitro에서 IL-34와 M-CSF 재조합 단백질에 의해 증가함을 보였으며, IFN-γ은 재조합 단백질 M-CSF을 제외한 IL-34에 의해 증가하였다. 하지만, IL-12 발현은 유의적인 차이가 없었으며, IL-1β의 경우는 감소하였다. 이 결과는 IL-34와 M-CSF가 고전적인 대식세포와 대체 대식세포 모두에서 역할을 한다고 할 수 있다. 결론적으로, in vitro와 in vivo 실험을 통하여 병원균 처리 시 닭의 IL-34 발현을 관찰하였으며, IL-34 재조합 단백질이 대식세포에서와 전염증성과 항염증성 반응에 중요한 역할을 함을 증명하였다. 추후에 IL-34의 사이토카인, 케모카인 그리고 염증반응 경로 등에 대한 추가 연구가 필요하다고 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Recently, interleukin 34 (IL-34) was identified as the second functional ligand for macrophage colony-stimulating factor receptor (M-CSFR). IL-34 functions similarly to M-CSF through its binding to the M-CSFR. There is still insufficient information on IL-34 in chickens, which has until now been reported only through predicted sequences and not through experimental research. Thus, to confirm its expression and to determine its potent biological activity, several chicken lines and cell lines were used. Cloning of recombinant chicken IL-34 and M-CSF genes was performed to investigate their modulatory effects on proinflammatory cytokine expression in vitro. The expression levels of IL-34, M-CSF, and M-CSFR genes were upregulated in broiler chickens with leg dysfunction (cause unknown). However, IL-34 was downregulated in most pathogen-stimulated tissues. M-CSFR expression was enhanced by recombinant IL-34 and M-CSF proteins in vitro. IFN-γ expression was enhanced by recombinant IL-34, but not by M-CSF. However, IL-12 expression was not regulated in any of the treated cells, and IL-1β was decreased in all tissues. These results indicate that IL-34 and M-CSF have roles in both the classical and alternative macrophage activation pathways. Collectively, our findings demonstrate the expression of IL-34 in chickens for pathogenic trials, both in vitro and in vivo. Our results suggest that the IL-34 protein plays a role in both pro- and anti-inflammatory functions in macrophages. Therefore, further research is needed to determine the cytokines or chemokines that can be induced by IL-34 and to further elucidate the functions of IL-34 in the inflammatory pathway.

주제어

표/그림 (8)

표 Table 1. Primers used for cloning of chicken IL-34 and M-CSF. Hind III and EcoR I restriction enzyme site (highlighted in bold and underline) was included in the primer for vector cloning.
표 Table 2. Primers used for qRT-PCR
그림 Fig. 1. Differential expression of mRNA in chicken tissues from normal and disable chickens. All data represent the mean±SEM of triplicate trials from three independent experiments. P<0.05 (*), P<0.01 (**), or P<0.001 (***) were considered to be statistically significant.
그림 Fig. 2. Differential expression of chicken IL-34 mRNA in the spleen and small intestine (a) and LPS-stimulated broiler chickens (b). All data represent the mean±SEM of triplicate trials from three independent experiments. P<0.05 (*), P<0.01 (**), or P<0.001 (***) were considered to be statistically significant.
그림 Fig. 3. Expression of chicken IL-34, M-CSF, and M-CSFR mRNA in HD11 induced by LPS. All data represent the mean±SEM of triplicate trials from three independent experiments. P<0.01 was considered to be statistically significant.
그림 Fig. 4. Molecular features and amino acid identities of chicken IL-34. (a) Multiple alignment of avian and mammalian IL-34 deduced amino acid sequences. Sequences were aligned using CLUSTAL Omega software. The conserved amino acid sequences are shaded to indicate homology. (b) Percentage of amino acid identity and similarity of species. Comparison of identities (top right) and similarities (bottom left) of chicken IL-34 molecules with selected IL-34 sequences from mammals and avian. (c) Phylogenetic tree for IL-34.
그림 Fig. 5. Structure-based sequence analysis of the chicken IL-34. (a) Amino acids sequence of chicken IL-34. Image colored by rainbow N to C terminus. Disulfide bonds are shown as a pair of asterisk and number (*1, *2, and *3). (b) Ribbons representation of the chicken IL-34 structure. The PDB file for the chicken IL-34 was generated using I-TASSER (http://zzanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER) with the crystal structure of mouse IL-34 structure as template (PDB Code c4exnF).
그림 Fig. 6. Modulation of chicken IL-34 and M-CSF in HD11 macrophage cell line. Gene expression was expressed as a fold change that was calculated as the average expression level of stimulated samples divided by that of the time-matched controls. The mean ±SEM of triplicates is shown. The p-values of samples ANOVA among stimulated samples and their time matched controls is shown above the bars as: (a) chicken IL-34 (b) M-CSFR (c) IFN-γ.

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

본 연구에서 포유류와 조류의 IL-34에 대한 유사성을 분석하고, 닭의 다양한 병원균 감염조직 및 세포주에서 IL-34의 발현을 비교분석하였다

제안 방법

그리고 E. coli로부터 정제된 재조합 닭 IL-34 및 M-CSF는 닭 대식세포 세포주에서 M-CSFR의 발현을 촉진하는 강력한 생물학적활성을 관찰하였다.
각각의 처리 구는 처리 후 0, 2, 6, 12, 24, 그리고 48 h 후에 TRIzol(Ambion) 에 녹여여total RNA 을추출하여quantitative real-time PCR(qRT-PCR) 을 이용한 발현 분석에사용하였다.
닭 IL-34와 M-CSF는 in vitro에서 표적세포를 발현하는 M-CSFR에 대해 유사한 효과를 나타내므로세포내에서도 유사한 발현패턴을 보이는 지를 조사하였다. 재조합 단백질인 닭 IL-34(200 ng/mL), 닭 M-CSF(200 ng/mL), 두단백질 IL-34(100 ng/mL)와 M-CSF(100 ng/mL), medium, 그리고 mock control(TRX; pET32a vector, 100 ng/mL)을 대조구로 사용하였다.
닭의 대식세포인 HD11 세포주에 LPS 처리 후, 0, 2, 4, 6, 8, 12, 그리고 24 h 동안 닭 IL-34, M-CSF, 그리고M-CSFR 유전자의 발현분석을 실시하였다(Fig. 3).
닭 IL-34와 M-CSF는 in vitro에서 표적세포를 발현하는 M-CSFR에 대해 유사한 효과를 나타내므로세포내에서도 유사한 발현패턴을 보이는 지를 조사하였다. 재조합 단백질인 닭 IL-34(200 ng/mL), 닭 M-CSF(200 ng/mL), 두단백질 IL-34(100 ng/mL)와 M-CSF(100 ng/mL), medium, 그리고 mock control(TRX; pET32a vector, 100 ng/mL)을 대조구로 사용하였다.
총 5개 조직(thymus, spleen, small intestine, caeca, cloaca) 에 대하여 정상인 개체와 관절 이상을 보이는 개체에 대하여IL-34, M-CSF, 그리고 M-CSFR 에 대한 유전자 발현 분석을 실시하였다(Fig. 1).

데이터처리

1) 와 산란계와 육계의 조직별 처리에 대한 IL-34발현 비교(Fig. 2)는 SPSS을 이용한Student t 검정, LPS처리에 대한 유전자의 시간대별 비교 및 재조합단백질처리에 대한 세포주의 시간대별 유전자 발현비교(Fig. 3, 6)는 일원분산분석(ANOVA) 으로 처리간 유의성을 검정하고, 처리평균값 간의 다중검정은 Duncan’s multiple comparison test 검정 방법을 이용하였다.
3, 6)는 일원분산분석(ANOVA) 으로 처리간 유의성을 검정하고, 처리평균값 간의 다중검정은 Duncan’s multiple comparison test 검정 방법을 이용하였다
모든 실험은 최소 3 반복실험을 수행하였으며, 데이터는 mean ± SEM로표기하였고, 유의수준은 P<0.05에서 유의하게 차이가 있다고 판단하였다.

성능/효과

perfringens), S. Enteritidis, LPS 그리고 대조구의 비장 및 소장에서의 IL-34 유전자 발현비교 결과, ADOL6.3 계통의 비장조직을 제외하고는 대부분의 조직에서 처리구대비대조구에서 유의하게 높게 발현되었다(Fig. 2A).
결론적으로, 닭의 다양한 품종별, 조직, 세포주, 그리고 관절이 상닭에 대하여 다양한 질병병원균을 처리하여 닭의 IL-34에 발현 분석 및 비교 결과, 닭의 다양한 조직 및 세포에서 발현되었으며, M-CSFR의 경우, HD11 세포주에서 재조합chIL-34와 chM-CSF 단백질에 의해 증가하였다. 이 결과는 다양한 병원균처리에 대한 IL-34의 발현에 대한 중요한 정보를 제공하며, 추후 닭의 IL-34을 이용한inflammatory pathway, chemokine 발현 및 체내에서의 역할 등에 대한 연구가 필요하다고 판단된다.
본 연구에서 포유동물과 조류 IL-34와 비교시 포유류와는 낮은 유사도(31.0∼32.8%), 조류와는 높은 유사도를 보였다(67.7∼76.7%)

후속연구

결론적으로, 닭의 다양한 품종별, 조직, 세포주, 그리고 관절이 상닭에 대하여 다양한 질병병원균을 처리하여 닭의 IL-34에 발현 분석 및 비교 결과, 닭의 다양한 조직 및 세포에서 발현되었으며, M-CSFR의 경우, HD11 세포주에서 재조합chIL-34와 chM-CSF 단백질에 의해 증가하였다. 이 결과는 다양한 병원균처리에 대한 IL-34의 발현에 대한 중요한 정보를 제공하며, 추후 닭의 IL-34을 이용한inflammatory pathway, chemokine 발현 및 체내에서의 역할 등에 대한 연구가 필요하다고 판단된다.

참고문헌 (43)

Bacon L, Hunt H, Cheng H 2000 A review of the development of chicken lines to resolve genes determining resistance to diseases. Poultry Science 79(8):1082-1093.

상세보기
Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J 2003 MatGAT: An application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. BMC Bioinformatics 4(1):1.

상세보기
Chang EJ, Lee SK, Song YS, Jang YJ, Park HS, Hong JP, Ko AR, Kim DY, Kim JH, Lee YJ, Heo YS 2014 IL-34 is associated with obesity, chronic inflammation, and insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab 99(7):E1263-1271.

상세보기
Chang SH, Choi BY, Choi J, Yoo JJ, Ha YJ, Cho HJ, Kang EH, Song YW, Lee YJ 2015 Baseline serum interleukin-34 levels independently predict radiographic progression in patients with rheumatoid arthritis. Rheumatol Int 35(1):71-79.

상세보기
Chemel M, Le Goff B, Brion R, Cozic C, Berreur M, Amiaud J, Bougras G, Touchais S, Blanchard F, Heymann MF, Berthelot JM, Verrecchia F, Heymann D 2012 Interleukin 34 expression is associated with synovitis severity in rheumatoid arthritis patients. Ann Rheum Dis 71(1):150-154.

상세보기
Chemel M, Le Goff Bi, Brion R, Cozic C, Berreur M, Amiaud J, Bougras G, Touchais S, Blanchard F, Heymann M-F 2012 Interleukin 34 expression is associated with synovitis severity in rheumatoid arthritis patients. Annals of the Rheumatic Diseases 71(1):150-154.

상세보기
Chen X, Liu H, Focia PJ, Shim AH, He X 2008 Structure of macrophage colony stimulating factor bound to FMS: Diverse signaling assemblies of class III receptor tyrosine kinases. Proc Natl Acad Sci USA 105(47):18267-18272.

상세보기
Eda H, Zhang J, Keith RH, Michener M, Beidler DR, Monahan JB 2010 Macrophage-colony stimulating factor and interleukin-34 induce chemokines in human whole blood. Cytokine 52(3):215-220.

상세보기
Ferre F, Clote P 2005 DiANNA: A web server for disulfide connectivity prediction. Nucleic Acids Research 33(suppl 2):W230-W232.

상세보기
Fleetwood AJ, Lawrence T, Hamilton JA, Cook AD 2007 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol 178(8):5245-5252.

상세보기
Franze E, Monteleone I, Cupi ML, Mancia P, Caprioli F, Marafini I, Colantoni A, Ortenzi A, Laudisi F, Sica G, Sileri P, Pallone F, Monteleone G 2015 Interleukin-34 sustains inflammatory pathways in the gut. Clin Sci (Lond) 129(3):271-280.

상세보기
Garceau V, Balic A, Garcia-Morales C, Sauter KA, McGrew MJ, Smith J, Vervelde L, Sherman A, Fuller TE, Oliphant T, Shelley JA, Tiwari R, Wilson TL, Chintoan-Uta C, Burt DW, Stevens MP, Sang HM, Hume DA 2015 The development and maintenance of the mononuclear phagocyte system of the chick is controlled by signals from the macrophage colony-stimulating factor receptor. BMC Biol 13:12.

상세보기
Garceau V, Smith J, Paton IR, Davey M, Fares MA, Sester DP, Burt DW, Hume DA 2010 Pivotal Advance: Avian colony-stimulating factor 1 (CSF-1), interleukin-34 (IL-34), and CSF-1 receptor genes and gene products. J Leukoc Biol 87(5):753-764.

상세보기
Garceau V, Smith J, Paton IR, Davey M, Fares MA, Sester DP, Burt DW, Hume DA 2010 Pivotal Advance: Avian colony-stimulating factor 1 (CSF-1), interleukin-34 (IL-34), and CSF-1 receptor genes and gene products. Journal of Leukocyte Biology 87(5):753-764.

상세보기
Garcia-Morales C, Rothwell L, Moffat L, Garceau V, Balic A, Sang HM, Kaiser P, Hume DA 2014 Production and characterisation of a monoclonal antibody that recognises the chicken CSF1 receptor and confirms that expression is restricted to macrophage-lineage cells. Dev Comp Immunol 42(2):278-285.

상세보기
Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Duvaud Se, Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A 2005. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. Springer. 571-607.
Geissmann F, Manz MG, Jung S, Sieweke MH, Merad M, Ley K 2010 Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science 327(5966):656-661.

상세보기
Goldenberg DL 1998 Septic arthritis. Lancet 351(9097):197-202.

상세보기
Gordon S, Martinez FO 2010 Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity 32(5):593-604.

상세보기
Haishan Lin EL, Kevin Hestir, Cindy Leo, Minmei Huang, Elizabeth Bosch, Robert Halenbeck, Ge Wu, Aileen Zhou, Dirk Behrens, Diane Hollenbaugh, Thomas Linnemann, Minmin Qin, Justin Wong, Keting Chu, Stephen K. Doberstein, Lewis T. Williams 2008 Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.
Hamilton JA 2008 Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nature Reviews Immunology 8(7):533-544.

상세보기
Hume DA, Ross IL, Himes SR, Sasmono RT, Wells CA, Ravasi T 2002 The mononuclear phagocyte system revisited. Journal of Leukocyte Biology 72:621-627.

상세보기
Hwang SJ, Choi B, Kang SS, Chang JH, Kim YG, Chung YH, Sohn DH, So MW, Lee CK, Robinson WH, Chang EJ 2012 Interleukin-34 produced by human fibroblast-like synovial cells in rheumatoid arthritis supports osteo- clastogenesis. Arthritis Res Ther 14(1):R14.

상세보기
Irvine KM, Andrews MR, Fernandez-Rojo MA, Schroder K, Burns CJ, Su S, Wilks AF, Parton RG, Hume DA, Sweet MJ 2009 Colony-stimulating factor-1 (CSF-1) delivers a proatherogenic signal to human macrophages. J Leukoc Biol 85(2):278-288.

상세보기
Kelley LA, Mezulis S, Yates CM, Wass MN, Sternberg MJ 2015 The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols 10(6):845-858.

상세보기
Lee KW, Lillehoj HS, Jeong W, Jeoung HY, An DJ 2011 Avian necrotic enteritis: Experimental models, host immunity, pathogenesis, risk factors, and vaccine development. Poult Sci 90(7):1381-1390.

상세보기
Lin H, Lee E, Hestir K, Leo C, Huang M, Bosch E, Halenbeck R, Wu G, Zhou A, Behrens D, Hollenbaugh D, Linnemann T, Qin M, Wong J, Chu K, Doberstein SK, Williams LT 2008 Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science 320(5877):807-811.

상세보기
Liu H, Leo C, Chen X, Wong BR, Williams LT, Lin H, He X 2012 The mechanism of shared but distinct CSF-1R signaling by the non-homologous cytokines IL-34 and CSF-1. Biochim Biophys Acta 1824(7):938-945.

상세보기
Ma D, Doi Y, Jin S, Li E, Sonobe Y, Takeuchi H, Mizuno T, Suzumura A 2012 TGF-beta induced by interleukin-34-stimulated microglia regulates microglial proliferation and attenuates oligomeric amyloid beta neurotoxicity. Neurosci Lett 529(1):86-91.

상세보기
Moon SJ, Hong YS, Ju JH, Kwok SK, Park SH, Min JK 2013 Increased levels of interleukin 34 in serum and synovial fluid are associated with rheumatoid factor and anticyclic citrullinated peptide antibody titers in patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol 40(11):1842-1849.

상세보기
Mouchemore KA, Pixley FJ 2012 CSF-1 signaling in macrophages: pleiotrophy through phosphotyrosine-based signaling pathways. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 49(2):49-61.

상세보기
Munoz-Garcia J, Cochonneau D, Teletchea S, Moranton E, Lanoe D, Brion R, Lezot F, Heymann MF, Heymann D 2021 The twin cytokines interleukin-34 and CSF-1: masterful conductors of macrophage homeostasis. Theranostics 11(4):1568-1593.

상세보기
Oh JY, Kang MS, An BK, Song EA, Kwon JH, Kwon YK 2010 Occurrence of purulent arthritis broilers vertically infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis in Korea. Poult Sci 89(10):2116-2122.

상세보기
Petersen TN, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H 2011 SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods 8(10):785-786.

상세보기
Pollard JW 2009 Trophic macrophages in development and disease. Nature Reviews Immunology 9(4):259-270.

상세보기
Thomsen R, Solvsten CAE, Linnet TE, Blechingberg J, Nielsen AL 2010 Analysis of qPCR data by converting exponentially related Ct values into linearly related X0 values. Journal of Bioinformatics and Computational Biology 8(05):885-900.

상세보기
Tian Y, Shen H, Xia L, Lu J 2013 Elevated serum and synovial fluid levels of interleukin-34 in rheumatoid arthritis: possible association with disease progression via interleukin-17 production. J Interferon Cytokine Res 33(7):398-401.

상세보기
Van Furth R, Cohn Z, Hirsch J, Humphrey J, Spector W, Langevoort H 1972 The mononuclear phagocyte system: a new classification of macrophages, monocytes, and their precursor cells. Bulletin of the World Health Organization 46(6):845.

상세보기
Verreck FA, de Boer T, Langenberg DM, van der Zanden L, Ottenhoff TH 2006 Phenotypic and functional profiling of human proinflammatory type-1 and anti-inflammatory type-2 macrophages in response to microbial antigens and IFN-gamma- and CD40L-mediated costimulation. J Leukoc Biol 79(2):285-293.

상세보기
Wang Y, Colonna M 2014 Interkeukin-34, a cytokine crucial for the differentiation and maintenance of tissue resident macrophages and Langerhans cells. Eur J Immunol 44(6):1575-1581.

상세보기
Wang Y, Szretter KJ, Vermi W, Gilfillan S, Rossini C, Cella M, Barrow AD, Diamond MS, Colonna M 2012 IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol 13(8):753-760.

상세보기
Wei S, Nandi S, Chitu V, Yeung YG, Yu W, Huang M, Williams LT, Lin H, Stanley ER 2010 Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. J Leukoc Biol 88(3):495-505.

상세보기
Zwicker S, Martinez GL, Bosma M, Gerling M, Clark R, Majster M, Soderman J, Almer S, Bostrom EA 2015 Interleukin 34: a new modulator of human and experimental inflammatory bowel disease. Clin Sci(Lond) 129(3):281-290.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증