[논문]ARPE-19 세포에서 산화적 스트레스에 대한 갈색거저리 추출물의 항산화 효과

김봉선; 최라영; 반유진; 이준하; 김인우; 서민철

doi:10.5352/jls.2022.32.11.865

ARPE-19 세포에서 산화적 스트레스에 대한 갈색거저리 추출물의 항산화 효과
Antioxidative Effects of Tenebrio molitor Larvae Extract Against Oxidative Stress in ARPE-19 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.11, 2022년, pp.865 - 871

김봉선 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부 곤충양잠산업과) , 최라영 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부 곤충양잠산업과) , 반유진 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부 곤충양잠산업과) , 이준하 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부 곤충양잠산업과) , 김인우 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부 곤충양잠산업과) , 서민철 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부 곤충양잠산업과)

초록
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황반 변성은 현대 사회에서 발병율이 급격히 증가한 질환 중 하나이다. 황반 변성의 대표적인 원인은 노화로 인한 산화 스트레스로 널리 알려져 있고 최근 노령화로 인해 발병 연령은 40대부터 급격하게 증가하고 있다. 따라서 본 연구에서는 TMH를 이용해 산화적 스트레스에 대한 항산화 효능 및 세포 사멸 억제연구를 통해 눈 건강 개선 소재를 개발하였다. 먼저 TMH의 인간 망막색소상피세포 사멸 억제 효능 평가를 위해 MTS assay로 세포 생존율을 측정하였다. 망막색소상피세포에서 H₂O₂에 의한 산화적 스트레스로 인해 약 60%의 세포 생존율을 확인 할 수 있었고 TMH에 의해 농도 의존적으로 세포 사멸을 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한 LDH release assay를 통해 세포막 보호 효능을 확인 하였으며 세포 내 ROS 측정을 통해 세포 내 활성산소종 조절을 통한 항산화 효능을 확인 할 수 있었다. 마지막으로 세포 생존과 사멸에 관여하는 세포 내 신호 단백질인 MAPKs의 인산화 조절, 항산화 효소인 HO-1 발현 조절, 세포 사멸 관여 단백질인 Bax/Bcl-2의 발현 그리고 cleaved caspase-3 단백질 분석을 통해 TMH의 산화 스트레스에 대한 항산화 그리고 세포 사멸 억제 경로를 확인 하였다. 위와 같은 결과 도출을 통해 TMH의 눈 건강 기능성 소재로서의 가능성을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Tenebrio molitor larvae is well known as edible insect. Then, although it has been widely studied that Tenebrio molitor larvae has various bioactive functions such as antioxidant, anti-wrinkle, and anticancer. Nevertheless, antioxidant effects of Tenebrio molitor larvae water extract (TMH) has not been well described in Adult Retina Pigment Epithelial cell line (ARPE-19). In this study, we demonstrated that antioxidant effects of TMH against H2O2-induced oxidative stress in ARPE-19. Thus, we selected for our studies and performed a series of dose-response assay to determine the working concentration that lead to a consistent and high degree of cytotoxicity, which we defined as the level of H2O2 that killed 40% of the ARPE-19 cells. ARPE-19 cells were pre-treated with various concentrations of TMH (0.1 up to 2 mg/ml) before exposure to 300 µM H2O2. As we expected, TMH effectively prevented ARPE-19 cells from 300 µM H2O2-induced cell death in a dose-dependent manner. Furthermore, TMH inhibited the phosphorylation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) such as extracellular signal regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), and p38. Overall, the inhibitory effects of TMH on H2O2-induced apoptosis and oxidative stress were associated with the protection cleaved caspase-3, Bax, Bcl-2, and HO-1. The TMH suppressed H2O2-induced cell membrane leakage and oxidative stress in ARPE-19 cells. Thus, these results suggest that the TMH plays an important role in antioxidant effect in ARPE-19.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Definition of H₂O₂ working concentration to oxidative stress in ARPE-19 cells. ARPE-19 (1×10⁵ cells/ml were plated in the complete DMEM/F12 medium. The cells were treated with H₂O₂ various concentration for 24 hr After treatment, the cell viability was measured using by MTS assay. Asterisks (*), (**), and (***) indicate p<0.05, p<0.01 and p<0.005, respectively.
그림 Fig. 2. TMH protects human adult retina pigment epithelial cells from H₂O₂-induced cell death. ARPE-19 (1×10⁵ cells/ml) were plated in the complete DMEM/F12 medium. The cells were treated with TMH 0.1, 0.5, 1 or 2 mg/ml for 24 hr (A). The cells were pre-treated with TMH for 1 hr. Then, the cells were treated H₂O₂ (300 μM) with for 24 hr (B). Subsequently, the cell viability was measured using a MTS assay. Asterisks (*), (**), and (***) indicate p<0.05, p<0.01 and p<0.005, respectively.
그림 Fig. 3. Inhibitory effect of TMH on H₂O₂-induced cell death and ROS release. ARPE-19 (1×10⁵ cells/ml) were plated in the complete DMEM/F12 medium. The cells were pre-treated with TMH for 1 hr. Then, the cells were treated H₂O₂ (300 μM) with for 24 hr, followed by the cell viability was determined using a LDH assay (A). The cells were pre-treated with TMH for 1 hr. Then, the cells were treated H₂O₂ (300 μM) with for 24 hr. After treatment, the ROS production was determined by using a ROS kit (B). Asterisks (*), (**), and (***) indicate p< 0.05, p<0.01 and p<0.005, respectively.
그림 Fig. 4. TMH attenuates H₂O₂-induced activation of MAPKs in ARPE-19 cells. ARPE-19 (1×10⁵ cells/ml) were plated in the complete DMEM/F12 medium. The cells were pre-treated with TMH for 1 hr. Then, the cells were treated H₂O₂ (300 μM) with for 30 min. Subsequently, the cell lysates were subjected to Western blotting using primary antibodies (p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK and p-JNK).
그림 Fig. 5. Suppression of H₂O₂-induced oxidative stress and cell death by HO-1, Bax/Bcl-2 and cleaved caspase-3 in ARPE-19 cells. ARPE-19 (1×10⁵ cells/ml) were plated in the complete DMEM/F12 medium. The cells were pre-treated with TMH for 1 hr. Then, the cells were treated H₂O₂ (300 μM) with for 24 hr. Subsequently, the cell lysates were subjected to western blotting using primary antibodies (HO-1, Bax/Bcl-2, and cleaved caspase-3).

AI 본문요약
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대상 데이터

본 연구에 사용된 갈색거저리 유충 원료는 우주 곤충(고흥, 전라남도)에서 종령 유충을 구입하였다. 갈색거저리 유충은 세척 후 멸균 및 동결 건조한 뒤 분쇄해 3차 증류수와 1:10 (W/V) 비율로 60℃, 80 rpm에 20시간 회전 교반한 다음 980× g에서 4℃로 원심 분리 해 상등액을 취해 새로운 micro tube에 옮겨 centrifugal evaporator (CVE-3100, Tokyo, Japan)를 이용해 완벽히 건조 시켜 -80℃ 냉동고에 보관하여 사용하였다.

데이터처리

모든 실험결과는 3회 반복 실험을 실시한 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 대조군과 실험 군의 유의성 검사는 GraphPad prism 5 (GraphPad SoftWare Inc., USA)의 unpaired two-tailed t test를 이용해 p<0.05값을 통계적으로 유의한 것으로 통계 처리하였다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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