[논문]Salmonella enteritidis 감염에 의해 장내 점막에서 유도되는 면역반응에 관한 연구

이강희; 이세희; 양진영

doi:10.5352/jls.2022.32.1.36

Salmonella enteritidis 감염에 의해 장내 점막에서 유도되는 면역반응에 관한 연구
Research for Intestinal Mucosal Immunity Induced by Salmonella enteritidis Infection 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.1, 2022년, pp.36 - 43

이강희 (부산대학교 생명시스템학과) , 이세희 (부산대학교 생명시스템학과) , 양진영 (부산대학교 생명시스템학과)

초록
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점막면역체계는 병원체에 대항하여 정밀하게 설계된 생물체의 방어체계로 그 중 위장관은 최전방에서 가장 중요한 기능을 하는 기관이다. 숙주 감염을 일으키는 병원성 미생물 가운데 식중독을 유발하는 살모넬라는 구강경로로 체내로 들어와 파이어판을 통해서 침입한다. 다양한 혈청형의 살모넬라 균주는 여러 톨유사수용체의 리간드를 통해서 숙주의 선천면역을 자극하지만, 숙주 특이성과 병원성에 따라 장내 점막에서 다양한 후천면역반응을 유도하기도 한다. 우리는 살모넬라 균주 중 비교적 연구가 덜 되어있는 S. enteritidis에 의해 감염되었을 때 장 내에서 일어나는 면역반응을 연구하였다. 우선 마우스에 처리할 적정 농도의 살모넬라 농도를 정하기 위해 살모넬라의 농도를 다르게 하여 실험을 진행하였고 고농도의 살모넬라 처리군에서 더 낮은 생존율과 높은 몸무게 감소율을 관찰하였다. 반수치사량의 반에 해당하는 농도의 살모넬라를 마우스에 감염시켰을 때 장 내 수지상세포와 T 세포에 유의적인 차이가 없는 것을 확인하였다. 하지만 동일한 조건의 마우스에서 회장조직을 염색했을 때 뮤신 분비의 증가와 술잔세포의 감소를 확인할 수 있었다. 또한 밀착연접단백질 유전자의 상대적인 발현량을 분석하였고 살모넬라 처리군에서 Claudin의 유의적인 감소를 확인할 수 있었다. 이어 살모넬라 감염 후 DSS를 처리한 실험에서 살모넬라 처리군에서 생존율이 낮아짐을 확인하여 S. enteritidis가 염증반응을 악화시킨다는 것을 알 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Mucosal immunity is a well-designed defense system that builds precise and dynamic relationships against pathogens, and the gastrointestinal tract is the most important organ with this system, acting as a guardian at the forefront of its activity. Salmonella spp. cause food poisoning, entering the body orally and mainly invading the Peyer's patches of the small intestine. Although Salmonella strains share similar mechanisms for inducing innate immunity, different serotypes may have different effects on the intestinal mucosa due to host specificities and pathogenicity. In this study, we evaluated the effects of Salmonella enteritidis infections in mouse intestine and observed significantly reduced dose-dependent survival rates in a challenge test. Flow cytometry data showed no significant differences in intestinal immune cell populations, although histology indicated increased mucin production and decreased goblet cell counts in the Salmonella-treated groups. Furthermore, Claudin expression was significantly decreased in the samples with Salmonella. To investigate the relationship between S. enteritidis infection and inflammatory response, dextran sodium sulfate (DSS) was administered after infection and the results indicate lower survival rate after DSS treatment. In conclusion, we were able to identify the optimal concentration of S. enteritidis to modulate the intestinal mucosal immunity of mice and inflammatory response.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Primers lists used for real-time PCR [31]
그림 Fig. 1. Measuring Lethal Dose for mouse experiments. (A) Mice orally infected with S. enteritidis were monitored daily for survival to determine LD50 of S. enteritidis (4×10⁶ or 4×10⁸ CFUs/ml). (B) Body weight changes were monitored daily. Statistical analyses were performed with Log-rank test (A) and multiple t tests using Holm-Sidak method (B). ***p<0.001.
그림 Fig. 2. ½LD50 of S. enteritidis hardly penetrate intestinal epithelial cells. (A) CFUs were measured in small intestine, spleen and blood 7 days after infection. (B) CFUs were measured in same organs 1 days after infection through oral or intraperitoneal routes. T cells and dendritic cells were analyzed in spleen (C) and small intestine (D) 3 days after infection by FACS analysis. Statistical analyses were performed with regular two-way ANOVA (B). ***p<0.001.
그림 Fig. 3. S. enteritidis infection generates the loss of tight junctions and secretion of mucin. (A) Peyer's patch and villi of ileum were stained with H&E staining. (B) Villi of ileum were stained with PAS staining. Tissue damage and secretion of mucin are indicated (arrow). Scale bars represent 50 μm. (C) Expression of tight junction related genes was measured by qRT-PCR. Statistical analyses were performed with two-tailed paired t-test. *p<0.05; ns, not significant.
그림 Fig. 4. S. enteritidis infection increases inflammatory susceptibility of mice. (A) Schematic of strategies for administration of S. enteritidis and DSS. Body weight (B) of mice infected with S. enteritidis and survival rate (C) was monitored after 3% DSS treatment. ns, not significant.

AI 본문요약
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제안 방법

소장과 비장 조직에서 획득한 세포를 CD45, CD4, CD8, CD11b, CD11c에 각각 FITC (BD bioscience), efluor450 (Invi- trogen), PE (BD bioscience), Pe-Cy7 (BD bioscience), APC (BD bioscience)가 부착된 항체와 반응시켜 유세포분석에 사용하였다. 세포는 4℃, 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층 액을 제거한 뒤, 미리 준비한 50 μl의 항체 cocktail과 반응시켰다.
전처리한 조직을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하기 전에 파라핀을 제거하고 수분을 공급하기 위하여 슬라이드글라스를 두 번에 거쳐서 자일렌으로 제거해주고 100%, 90%, 80%, 70%의 에탄올로 1분씩 처리한 후 흐르는 수돗물에 5분간 담구어 두었다. 이후 세포핵의 염색을 위하여 헤마톡실린을 1분간 처리하였고, 흐르는 물에 5분간 담구어 충분히 씻어 주었다.

대상 데이터

실험 동물은 생후 6주령의 암컷 BALB/c마우스(Samtako) 를 일주일간 동물실험실의 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 마우스는 온도 24-26℃와 습도 45-55%로 유지된 동물실험실에서 실험용 쥐사료 SAM#31 (Samtako)와 1차증류수를 공급받았으며 외부로부터의 공기가 차단된 MSRSII cage (Orient bio)에서 사육되었다. 살모넬라에 감염시키기 4시간 전에 사료와 물의 공급을 중단하였으며 감염시킨 후 4시간 뒤에 재공급해주었다.
실험 동물은 생후 6주령의 암컷 BALB/c마우스(Samtako) 를 일주일간 동물실험실의 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 마우스는 온도 24-26℃와 습도 45-55%로 유지된 동물실험실에서 실험용 쥐사료 SAM#31 (Samtako)와 1차증류수를 공급받았으며 외부로부터의 공기가 차단된 MSRSII cage (Orient bio)에서 사육되었다.
살모넬라에 감염시키기 4시간 전에 사료와 물의 공급을 중단하였으며 감염시킨 후 4시간 뒤에 재공급해주었다. 실험동물은 그룹당 3 마리를 사용하였으며 생존율을 측정하는 실험에서 4 그룹을 사용하였다. 모든 실험동물은 부산대학교 동물실험윤리위원회의 사전승인 하에 동물실험윤리 기준에 따라 취급하였다(PNU-2021-2862).

데이터처리

본 실험의 모든 실험결과는 평균±표준 오차로 나타내었으며, Graph pad prism (Graph Pad Software Inc, San Diego, CA, USA)을 이용하였다. 마우스의 생존율에 관한 실험결과는 Log-rank test를 통해 검증하였으며 마우스의 몸무게 감소율에 관한 실험결과는 multiple t test를 실시한 후 Holm-Sidak test로 검증하였다. 살모넬라의 집락형성능에 관한 실험 결과는 two-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시하였으며 실시간 중합효소연쇄반응에 관한 실험결과는 two-tailed paired t test로 분석하였다.
본 실험의 모든 실험결과는 평균±표준 오차로 나타내었으며, Graph pad prism (Graph Pad Software Inc, San Diego, CA, USA)을 이용하였다
마우스의 생존율에 관한 실험결과는 Log-rank test를 통해 검증하였으며 마우스의 몸무게 감소율에 관한 실험결과는 multiple t test를 실시한 후 Holm-Sidak test로 검증하였다. 살모넬라의 집락형성능에 관한 실험 결과는 two-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시하였으며 실시간 중합효소연쇄반응에 관한 실험결과는 two-tailed paired t test로 분석하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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