[논문]한국 자생 염생식물 추출물의 항산화 활성 및 다재내성 Acinetobacter baumannii에 대한 항생물막 활성

이은성; 박정우; 문기환; 서영완

doi:10.5352/jls.2023.33.12.1015

한국 자생 염생식물 추출물의 항산화 활성 및 다재내성 Acinetobacter baumannii에 대한 항생물막 활성
Antioxidant Activity of Native Korean Halophyte Extracts and Their Anti-biofilmActivity against Acinetobacter baumannii 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.33 no.12, 2023년, pp.1015 - 1024

이은성 (한국해양대학교 해양과학기술전문대학원 해양과학기술융합학과) , 박정우 (한국해양대학교 해양과학기술전문대학원 해양과학기술융합학과) , 문기환 (한국해양대학교 해양과학기술전문대학원 해양과학기술융합학과) , 서영완 (한국해양대학교 해양과학기술전문대학원 해양과학기술융합학과)

초록
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항생제는 인간을 비롯한 가축 및 어류의 세균성 감염 질환의 치료에 크게 기여해 왔으나, 그 오남용으로 인해 많은 다제약제 내성균의 등장을 야기하였다. 최근, 항생제 내성균의 제어를 위한 새로운 항생물질 소재 발굴 및 신약 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 염생식물은 염분이 높은 토양에서 자생하는 식물로 산화 스트레스로 작용하는 염분에 대한 적응으로 독특한 대사과정을 통한 특이한 이차 대사산물을 생성하는 것으로 알려져 있다. 최근 항생제의 오용 및 남용으로 항생제 내성균이 증가해 천연물질을 활용한 새로운 신약 개발의 필요성이 커지고 있다. 세균의 생물막 형성은 적대적 환경으로부터 스스로를 보호하는 적응 및 생존을 위한 전략으로 인식되며, 감염성 세균의 경우 숙주 내 부착 및 집락화를 위한 주요병원성 인자로 여겨진다. 특히, 생물막을 형성한 세균은 항생제에 대해 더 큰 내성을 보이며 쉽게 죽지 않아 치료가 더욱 어려워진다. 부유성 세균은 다양한 외부 환경을 인식하여 표면 부착을 통한 생물막 형성이 유도되는데 산화적 스트레스는 이를 유도할 수 있는 주요 신호 중 하나이다. 따라서 항산화제와 같은 산소 스트레스 조절 효과를 갖는 화학 물질은 세균의 생물막 형성과 관련된 감염성 질환 치료에 사용될 수 있을 것으로 여겨지고 있다. 본 연구에서는 총 18종의 국내에 자생하는 염생식물 추출물에 대한 항산화 효능을 확인하고 나아가 Acinetobacter baumannii ATCC 17978균주에 대한 항생물막 효과 및 세포 독성을 검증하였다. 그 결과 해국, 통보리사초, 해당화, 천문동에서 높은 항산화 효과와 항생물막 효과가 있는 것을 확인하였고 세포독성 역시 보이지 않음을 확인하였다. 해당 연구를 통해 국내 자생 염생식물 유래 항산화 물질의 항생물막 활성을 함께 확인함으로써, 새로운 천연물 유래 신약 후보군을 제시하고 향후 다제약제 내성균의 제어를 위한 의약 소재로서 개발이 가능할 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Antibiotics have greatly contributed to the treatment and prevention of bacterial diseases in humans, animals, and fish. However, antibiotic misuse has led to the emergence and spread of multidrug-resistant bacteria. In addition to antibiotic discovery research, efforts are being made to combat such multidrug-resistant bacteria using antimicrobial agents, antioxidants, host immune enhancement, probiotics, and bacteriophages, as well as various symptomatic therapies. To discover novel bioactive compounds, it is crucial to adopt approaches that incorporate fresh ideas, new targets, innovative techniques, and untapped resources. Halophytes are plants that grow in high-salt soils and are known to adapt to salt-induced stress through unique metabolic processes that produce secondary metabolites. This study aimed to investigate the effects of extracts of halophytes native to Korea on oxidative stress and to determine whether they exert inhibitory activity against biofilms, which are major pathogenic factors of infectious bacteria. The Acinetobacter baumannii strain ATCC 17978, a representative drug-resistant bacterium, was used to measure anti-biofilm activity. The results showed that Aster spathulifolius, Carex kobomugi, Rosa rugosa, and Asparagus cochinchiensis exerted strong antioxidant and anti-biofilm effects without affecting bacterial growth itself. The halophytes used in this study are promising candidates for the development of pharmaceutical agents with antioxidant and antimicrobial properties.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. List of halophytes
그림 Fig. 1. Ferric reducing antioxidant power of crude extracts from halophytes (% of control). ^a-hMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 2. Scavenging activity of crude extract from halophytes on authentic ONOO^- (% of control). ^a-jMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 3. Scavenging activity of crude extract from halophytes on ONOO^- from SIN-1 (% of control). ^a-iMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 4. Anti-biofilm activity of crude extracts from halophytes against A. baumannii ATCC 17978. ^a-dMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 5. Growth ratio of A. baumannii ATCC 17978 with crude extracts from halophytes. ^a-bMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 6. Cytotoxic effects of crude extracts on HT-1080 cells by using the MTT analysis. The cells were treated with 200, 100, 50 μg/ml of crude extracts for 24 hr. ^a-dMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 7. Effects of crude extracts on intracellular ROS generation by DCFH-DA assay. HT-1080 cells were treated with DCFH-DA and exposed with H₂O₂. CON: with H₂O₂, BK: without H₂O₂.
그림 Fig. 8. Effects of crude extracts on regulation of GSH level in HT-1080 cells. ^a-cMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.

AI 본문요약
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문제 정의

이러한 고 염분 환경 유도 산화스트레스 저항을 위해 염생식물들은 매우 독특한 항산화 기전을 발전시켜 왔으며, 현재까지 많은 염생식물에서 다양한 항산화 물질들이 발견되고 있다[1, 3]. 본 연구에서는 다양한 국내 자생 염생식물을 조추출물을 확보하여 해당 추출물의 항산화 효능 및 다제약제 내성균 중 하나인 Acinetobacter baumannii의 항생물막 효과를 검증하고, 나아가 세포주를 활용한 in vitro 상의 독성 평가를 통해 새로운 형태의 항생제 내성균 제어 물질 후보군을 탐색하고자 한다. 항산화물질의 항병원성(항생물막) 능력 검증은 다제약제 내성균의 제어를 위한 기존약물의 신약 재창출(drug-repositioning) 개념과도 일맥상통하며, 해당 연구를 통해 국내 자생 염생식물로부터 새로운 항산화 물질의 신약 활용 가능성을 확인할 수 있을 것으로 기대한다.
본 연구에서는 다제약재내성균 중의 하나인 Acinetobacter baumannii 균주에 대한 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 Acinetobacter baumannii ATCC 17978 표준 균주는 Luria-Bertani (BD, USA) 액체 배지 및 1.

제안 방법

시료에 대한 A. baumannii ATCC 17978균주의 생물막 생성량을 정량하기 위해 crystal violet (Sigma-Aldrich, USA) 시약을 사용하여 염색된 생물막 생성량을 측정하였다. 5 ml polystyrene tube (Corning, USA)에 LB 액체 배지를 500 µl씩 분주한 후 A.
염생식물은 염분이 높은 환경에서 적응하여 염분에 의해서 야기된 산화 스트레스에 적응하기 위한 독특한 항산화 방어기작이 있다고 알려져 있다[17]. 따라서 본 연구에서는 국내 자생 염생식물 18종의 조추출물로 항산화 효과가 있는 물질을 screening 한 뒤, 활성이 있는 시료를 선정하여 Acinetabacter baumannii ATCC 17978 균주에 대한 항생물막 실험을 진행하고, HT-1080 cell을 이용한 세포독성 실험 및 세포 내 항산화 실험을 추가로 진행하였다. 해당 18종의 국내 자생 염생식물 조추출물의 in vitro 상에서의 환원력 및 peroxynitrite (ONOO‾) 소거활성능을 확인해 본 결과 해국, 통보리사초, 해당화 및 천문동 샘플에서 좋은 활성을 확인할 수 있었다.
시료의 조추출물의 항산화 활성을 측정하기 위해 조추출물이 HT-1080 세포 생존율에 미치는 영향을 MTT assay를 통해 확인하였다(Fig. 6).
9%로 나타났다. 이러한 MTT assay 측정결과를 바탕으로 세포 내 항산화 활성 실험을 실시하였다.

대상 데이터

본 연구에서는 다제약재내성균 중의 하나인 Acinetobacter baumannii 균주에 대한 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 Acinetobacter baumannii ATCC 17978 표준 균주는 Luria-Bertani (BD, USA) 액체 배지 및 1.5% agar를 첨가한 고체 배지를 사용하여 37℃ 조건에서 18시간 배양되었다.
실험에 사용된 HT-1080 세포는 인간 섬유육종 세포이며, 한국 세포주 은행(KCLB, Korean cell line bank)에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 10% fetal bovine serum (FBS), 100 unit/ml penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI 1640을 배양액으로 하여 37℃, 5% CO₂ incubator (Forma scientific)에서 배양하였다.

데이터처리

실험결과는 평균±표준편차(Mean ± Standard deviation, n=3)로 표기하였고, statistical analysis system v9.1 (SAS Institute Inc., USA)를 이용하여 실험결과의 유의성을 검토하였다
이는 3-morpholinsydnonimine (SIN-1)이 NO･와 O2･‾를 동시에 발생시켜 ONOO‾를 생성시키는 화합물로, authentic peroxynitrite의 급속한 DHR 123의 산화와는 달리 점진적으로 산화가 일어나게 하기 때문이다. 실험은 triplicate로 행하였으며, 결과는 blank를 차감한 값을 평균하여 대조군에 대한 백분율로 계산하였다[13, 14].
집단 간의 유의성을 알아보기 위하여 일원 배치 분산분석(One way Analysis Of Variance: ANOVA)을 실시하였고, 사후검증은 Duncan’s multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 검증하였다.

이론/모형

세포 내 free radical 생성은 DCFH-DA assay로 측정하였다. DCFH-DA (2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, sigma)는 세포 내 활성산소와 반응해 형광물질을 만드는데 이 시약을 처리해 발생하는 형광을 측정함으로써 세포 내 활성산소의 농도를 측정할 수 있다.

성능/효과

8%. 86.9%로 나타났다. 이러한 MTT assay 측정결과를 바탕으로 세포 내 항산화 활성 실험을 실시하였다.
이 후, 해당 네개 샘플에 대해 A. baumannii의 생물막 저해 능력을 확인해 본 결과 해국, 해당화, 천문동 샘플에서 활성을 보였으나 통보리사초의 경우 생물막 저해능은 확인되지 않았다. 세포생존률 측정에서도 네개 샘플 모두 80% 내외의 생존률을 보였으며, 세포 내 항산화 활성 및 GSH 함량 측정에서도 좋은 활성을 나타내었다.
가장 높은 처리 농도인 200 µg/ml에서 해국, 통보리사초, 해당화, 천문동의 세포 생존율은 각각 82.6%, 74%, 84.8%
baumannii의 생물막 저해 능력을 확인해 본 결과 해국, 해당화, 천문동 샘플에서 활성을 보였으나 통보리사초의 경우 생물막 저해능은 확인되지 않았다. 세포생존률 측정에서도 네개 샘플 모두 80% 내외의 생존률을 보였으며, 세포 내 항산화 활성 및 GSH 함량 측정에서도 좋은 활성을 나타내었다. 결론적으로 이상과 같은 실험결과는 해국, 통보리사초, 해당화, 천문동이 항산화 및 항생물막 효과를 가진 천연 소재로의 개발 가능성을 제시하였다.
실험 결과, 조추출물을 처리한 세포는 대조군과 비교하여 200 µg/ml에서 대부분 GSH 함량이 증가하였음을 확인할 수 있었으며, 특히 해국 조추출물에서는 200 및 100 µg/ml 농도에서 대조군과 비교하여 각각 4.5% 및 4.4% 가량의 GSH 함량이 증가하였다.
해국 조추출물을 처리하였을 때에는 100 µg/ml 농도까지 생물막 형성량이 감소하였고, 해당화 및 천문동 조추출물에서는 200 µg/ml 농도에서만 생물막 형성량이 감소하였다
해당 18종의 국내 자생 염생식물 조추출물의 in vitro 상에서의 환원력 및 peroxynitrite (ONOO‾) 소거활성능을 확인해 본 결과 해국, 통보리사초, 해당화 및 천문동 샘플에서 좋은 활성을 확인할 수 있었다

후속연구

세포생존률 측정에서도 네개 샘플 모두 80% 내외의 생존률을 보였으며, 세포 내 항산화 활성 및 GSH 함량 측정에서도 좋은 활성을 나타내었다. 결론적으로 이상과 같은 실험결과는 해국, 통보리사초, 해당화, 천문동이 항산화 및 항생물막 효과를 가진 천연 소재로의 개발 가능성을 제시하였다. 본 연구를 통해 국내 자생 염생식물 유래 항산화 물질의 항생물막 활성을 함께 확인하였으며, 이를 바탕으로 새로운 천연물 유래 신약 후보군을 제시함으로써 향후 다제약제내성균의 제어를 위한 신약 발굴에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
산화 스트레스는 미생물이 부유 상태에서 생물막을 형성한 고착상태로 이동하도록 하는 주요 메커니즘 중의 하나이다[4]. 따라서 항산화제와 같은 산화 스트레스 조절제를 표적으로 삼을 수 있는 화학물질은 생물막 형성 관련 감염을 치료하는 데 사용할 수 있을 것으로 사료되고 있다.
산화 스트레스는 미생물이 부유 상태에서 생물막을 형성한 고착상태로 이동하도록 하는 주요 메커니즘 중의 하나이다[4]. 따라서 항산화제와 같은 산화 스트레스 조절제를 표적으로 삼을 수 있는 화학물질은 생물막 형성 관련 감염을 치료하는 데 사용할 수 있을 것으로 사료되고 있다.
지구상에 존재하는 생명체 중 약 80%가 해양에 존재하며 해양 생물종에 대해 진행된 연구는 미흡한 실정이다. 또한 육상 생물과는 다른 환경에서 서식하기 때문에 육상 생물과는 다른 특이한 생화학적 대사산물이 발견될 가능성이 크다고 할 수 있다.
결론적으로 이상과 같은 실험결과는 해국, 통보리사초, 해당화, 천문동이 항산화 및 항생물막 효과를 가진 천연 소재로의 개발 가능성을 제시하였다. 본 연구를 통해 국내 자생 염생식물 유래 항산화 물질의 항생물막 활성을 함께 확인하였으며, 이를 바탕으로 새로운 천연물 유래 신약 후보군을 제시함으로써 향후 다제약제내성균의 제어를 위한 신약 발굴에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다. 특히, 국내 연안습지에 서식하고 있는 다양한 염생식물들의 신약 후보군으로 서의 가능성을 제시함으로써 해양 바이오 신소재 산업 분야 발전에 기여하고 새로운 고부가가치 창출의 가능성을 제시할 수 있는 초석 연구가 될 것으로 기대한다.
본 연구를 통해 국내 자생 염생식물 유래 항산화 물질의 항생물막 활성을 함께 확인하였으며, 이를 바탕으로 새로운 천연물 유래 신약 후보군을 제시함으로써 향후 다제약제내성균의 제어를 위한 신약 발굴에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다. 특히, 국내 연안습지에 서식하고 있는 다양한 염생식물들의 신약 후보군으로 서의 가능성을 제시함으로써 해양 바이오 신소재 산업 분야 발전에 기여하고 새로운 고부가가치 창출의 가능성을 제시할 수 있는 초석 연구가 될 것으로 기대한다.
본 연구에서는 다양한 국내 자생 염생식물을 조추출물을 확보하여 해당 추출물의 항산화 효능 및 다제약제 내성균 중 하나인 Acinetobacter baumannii의 항생물막 효과를 검증하고, 나아가 세포주를 활용한 in vitro 상의 독성 평가를 통해 새로운 형태의 항생제 내성균 제어 물질 후보군을 탐색하고자 한다. 항산화물질의 항병원성(항생물막) 능력 검증은 다제약제 내성균의 제어를 위한 기존약물의 신약 재창출(drug-repositioning) 개념과도 일맥상통하며, 해당 연구를 통해 국내 자생 염생식물로부터 새로운 항산화 물질의 신약 활용 가능성을 확인할 수 있을 것으로 기대한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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